Vereshchagin1972

I. Методы анализа триглицеридов и составляющих их жирных кислот

В методической части монографии не излагаются все методы исследования триглицеридов, перечисленные в табл. 1. Из физических методов анализа подробно описаны отдельные разновидности хроматографии и метод кристаллизации, из химических — переэтерификация, а из биохимических — установление позиционных категорий глицеридного состава путем липазного гидролиза и определение абсолютной конфигурации триглицеридов при помощи стереоспецифических ферментов липидного обмена. В заключительном разделе этой части рассматриваются современные методы исследования и свойства полиморфных модификаций кристаллических триглицеридов в зависимости от их строения и ненасыщенности. Большинство других методов исследования, в частности окислительных, описывается лишь попутно, с большей или меньшей обстоятельностью, в этой и последующих частях монографии. Остальные методы приведены в руководствах по химии жиров (см., например, [689]).

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ И НЕПОЗИЦИОННЫХ КАТЕГОРИЙ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Природные липиды обычно представляют собой смеси алифатических соединений различных классов, характеризуемых определенным числом тех или иных функциональных групп (стр. 24). Для предварительного фракционирования этих смесей на отдельные классы и выделения триглицеридов, ди- и моноглицеридов, жирных кислот, метиловых эфиров и т. д. служит метод адсорбционной хроматографии. Не случайно принцип хроматографии был открыт и применен М. С. Цветом в 1903 г. [37] как средство адсорбционного разделения именно липидных растительных пигментов. Открытая повторно в 1931 г. Куном и Ледерером [589], адсорбционная хроматография была впервые использована в анализе алифатических липидов Кауфманом в 1936 г. [501] и <\br> Траппе в 1940 г. [941]; до появления распределительной и газо-жидкостной хроматографии она в течение 10—15 лет служила основным методом разделения этих соединений. За последние годы данный вид хроматографии пережил «второе рождение» благодаря развитию методов адсорбционного разделения на бумаге и, особенно, тонкослойной хроматографии. В настоящее время исследователи в области биохимии липидов повседневно используют адсорбционную хроматографию в препаративном и аналитическом масштабе; она является единственным хроматографическим методом фракционирования сложных смесей липидов природного происхождения на отдельные классы и широко применяется для исследования олефинового состава липидов в пределах одного класса. Адсорбционной хроматографии липидов посвящено несколько сот экспериментальных исследований и ряд обзоров [71, 225, 226, 278, 389, 391, 682, 687, 722, 831, 832, 999].

Структурные различия липидов внутри отдельного класса, выделенного адсорбционной хроматографией, определяются в основном двумя параметрами — числом метиленовых групп, а также числом и положением двойных связей. Совокупность липидов, у которых один из этих параметров постоянен, а другой монотонно изменяется, образует гомологический ряд, причем каждый класс может содержать один или несколько таких рядов. При хроматографии на необработанном адсорбенте разделение классов на гомологические ряды и разделения внутри рядов, как правило, не происходит, поскольку различия между липидами по величине полярности, имеющиеся внутри класса, незначительны по сравнению с теми сдвигами полярности, которые вызываются функциональными группами. Однако столь слабые различия оказываются вполне достаточными для разделения липидов внутри классов и гомологических рядов методом распределительной хроматографии. Следует отметить, что этот укоренившийся сейчас термин нельзя признать удачным, так как масса распределяется между твердой, жидкой или газовой фазами при любом хроматографическом разделении; здесь и ниже имеется в виду система двух жидких фаз — подвижной и неподвижной, которые не смешиваются между собой. Распределительная хроматография, разработанная в 1941 г. Мартином и Синджем [690], нашла применение в области липидов только в 1948 г. в работах Рамсая и Паттерсона [809] и исследованиях Дж. Болдинга [111].

После появления методов адсорбционной и распределительной хроматографии удалось значительно расширить наши представления о строении и обмене липидов в живых организмах. Однако использованию этих видов анализа в химии липидов мешали многие недостатки: большая затрата времени для достижения удовлетворительного разделения, недостаточная воспроизводимость анализа и большая его трудоемкость, совпадение величин распределения насыщенных и ненасыщенных липидов и т. д. В поисках метода эффективного разделения сложных смесей липидов жи- <\br> вотного организма, которые могут насчитывать 60 и более различных компонентов, английские биохимики Джеймс и Мартин открыли в 1952 г. совершенно новый вид хроматографии — газо-жидкостную хроматографию [436]. В данном случае разделение смеси основано на различном распределении компонентов между двумя фазами — неподвижной жидкой фазой, нанесенной на твердый носитель хроматографической колонки, и проходящим через колонку газом. При давлениях, близких к атмосферному, газы по сравнению с жидкостями имеют значительно меньшую плотность и вязкость, поэтому сопротивление колонки газовому потоку сравнительно невелико. Это обстоятельство позволяет достичь большой скорости анализа при весьма высокой эффективности разделения, которая обеспечивается интенсивным массообменом на поверхности неподвижной фазы. Концентрацию выходящих из колонки органических паров можно непрерывно автоматически регистрировать, определяя те или иные их физические свойства. Преимущества газо-жидкостной хроматографии выдвигают ее сейчас среди других разновидностей хроматографии. Этим методом разделяют метиловые эфиры жирных кислот, свободные жирные кислоты, триглицериды, производные моно- и диглицеридов и т. д. Для некоторых из перечисленных соединений газо-жидкостная хроматография является наилучшим способом разделения и количественного определения.

В методической части монографии не приведены многочисленные работы, в которых отдельные разновидности хроматографии липидов использовались лишь в чисто аналитических целях и которые не содержат оригинального материала по теории и технике самого метода. Почти не затронуты исследования по хроматографии алифатических соединений с короткой цепью (m ≤ 8), а также стероидов, эфирных масел и других производных изопрена. Подробные сведения по теоретическим основам того или иного хроматографического метода не приводятся и не дается описание особенностей применяемой аппаратуры; соответствующие данные содержатся в руководствах и обзорах по адсорбционной [41, 356, 622, 891], распределительной [24, 33, 39, 72, 168, 278, 390, 501, 582, 709, 724, 832, 852, 875, 966, 993] и газо-жидкостной хроматографии [7, 10, 17—19, 22, 34, 38, 160, 272, 435, 540, 630, 632, 793, 794].

Из других методов анализа триглицеридного состава жиров в этом разделе рассматривается кристаллизация из растворителей при низких температурах — метод, широко применявшийся в прошлом, но подчас используемый и в настоящее время.

Глава 1. АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ОСОБЕННОСТИ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ЛИПИДОВ

В адсорбционной хроматографии поток жидкости вызывает селективную миграцию компонентов смеси в пористой среде с высокой адсорбирующей способностью из узкой стартовой зоны. В большинстве случаев адсорбентом для разделения липидов служит силикагель или кремнекислота. Эти термины обозначают соединения, близкие по составу. Они представляют собой сыпучие тела с микропористой структурой, соответствующие формуле SiO₂ · Н₂О и образующиеся из щелочного силиката в процессе дегидратации и полимеризации ортокремневой кислоты H₄SiO₄ в сильнокислой среде. Силикагель можно получить из H₄SiO₄ и в солевом растворе, например в растворе NН₄СІ. Такой силикагель не содержит на поверхности участков с кислыми свойствами и как адсорбент существенно отличается от силикагеля, полученного в кислой среде [339]. Из отечественных сортов силикагеля для адсорбционной хроматографии чаще всего применяется силикагель КСК [1а, 6].

Внутренняя часть зерен кремнекислоты и силикагеля представляет собой силоксан тетраэдрического строения (—Si—O—Si—), лишенный адсорбционных свойств. Адсорбирующая способность материала связана исключительно с поверхностными группами силанола (— Si — ОН), которые обычно удерживают при помощи водородных связей мономолекулярный слой «свободной» воды [785]:

  -Si-O-Si-
   |     |
   O     O
   |     |
   H     H
   |     |
  HOH   HOH

При нагревании до 110—120° монослой удаляется, но может быть восстановлен прибавлением к адсорбенту определенного количества воды. Наиболее эффективное разделение при адсорбционной хроматографии липидов обеспечивает силикагель, который удерживает в мономолекулярном слое 8—15% «свободной» воды [225, 806]. Если силикагель содержит более 25% «свободной» воды, то сродство липидов к адсорбенту резко падает.

Липиды из живых тканей обычно характеризуют по их полярности, определяющей величину адсорбционного сродства. Различают нейтральные липиды, включающие углеводороды, стерины и их эфиры, глицериды, свободные и этерифицированные жирные кислоты и др.; другую группу составляют полярные липиды — <\br> фосфо-, глико- и сульфолипиды. Сведения о химической природе липидов содержатся в монографии [342].

Адсорбция нейтральных липидов на поверхности силикагеля обусловлена образованием водородных связей между полярными силанольными группами адсорбента и функциональными группами липидных молекул. По степени полярности функциональные группы располагаются в следующий ряд [736]:

—OCH₃<—HC—CH—<—COOCH₃<C=O<CHO<—NH₂<OH<—COOH.

Совокупность липидов, близких по составу и свойствам и характеризуемых присутствием тех или иных функциональных групп, обычно называют классом липидов. Природа и количество функциональных групп в липидной молекуле и, следовательно, общая способность молекул к образованию водородных связей определяют величину сродства данного класса липидов к адсорбенту. Поскольку содержание неполярных метиловых и метиленовых групп, а также ненасыщенных связей обычно мало влияет на адсорбцию, отдельные классы дают на хроматограмме однородные по составу зоны [831, 833]. В пределах одного и того же класса вещества с большим числом атомов углерода и меньшим числом е преимущественно накапливаются во фронтальной части хроматографической зоны [682].

На силикагеле, пропитанном раствором AgNO₃, между ненасыщенными липидами и ионами Ag⁺ возникают лабильные координационные комплексы, полярность которых значительно меняется в зависимости от числа двойных связей, их положения в молекуле и стереоизомерии. В такой хроматографической системе хорошо разделяются липиды, отличающиеся друг от друга по количеству двойных связей только на Δе = 1 [969].

При адсорбционной хроматографии на обычном силикагеле в системе гексан : эфир : уксусная кислота наблюдается следующий порядок роста полярности нейтральных липидов и соответственно убывания их относительной хроматографической подвижности: н-углеводороды, воска, эфиры стеринов, метиловые эфиры жирных кислот, жирные альдегиды, триглицериды, жирные кислоты, жирные спирты, 1,3-диглицериды, 1,2(2,3)-диглицериды, стерины, жирные оксикислоты, 1(3)-моноглицериды, 2-моноглицериды [218, 220, 225, 245, 330, 533, 555, 679, 684, 836, 967]. В зависимости от эффективности данного адсорбционно-хроматографического метода стоящие в ряду по соседству нейтральные липиды могут отделяться друг от друга или же мигрировать совместно в одной зоне хроматограммы. На некоторых сортах силикагеля при отсутствии уксусной кислоты в растворителе свободные жирные кислоты остаются на старте.

Подвижность липидов при разделении зависит не только от силы адсорбента и содержания функциональных групп в липидной молекуле, но и от полярности применяемой системы раство- <\br> рителей. Ряд растворителей, расположенных в порядке возрастания их диэлектрической постоянной и элюирующей способности по отношению к адсорбированным липидам, Траппе назвал элюотропным рядом: петролейный эфир < циклогексан < CCl₄ < < бензол < CHCl₃ < CH₂Cl₂ < эфир < этилацетат < ацетон < < этанол < метанол < уксусная кислота [941].

Ниже рассматриваются отдельные виды адсорбционной хроматографии липидов в порядке их возникновения, начиная с методов, давно вошедших в лабораторную практику, и кончая самой новой разновидностью — хроматографией в тонком слое.

ВЫТЕСНИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ И НЕКОТОРЫЕ ДРУГИЕ РАЗНОВИДНОСТИ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

При адсорбционной хроматографии подвижность компонентов определяется не только их сродством к адсорбенту, но и взаимодействием компонентов друг с другом. Вещества, адсорбируемые сильнее, вытесняют с поверхности адсорбента менее прочно связанные вещества. На принципе вытеснения одних компонентов другими основана одна из разновидностей адсорбционной хроматографии, называемая вытеснительной хроматографией.

В форме вытеснительной хроматографии адсорбционная хроматография липидов была впервые применена Хольманом [389]. На колонке, наполненной активированным углем Darco G-60, при элюировании петролейным эфиром разделили лауриновую и стеариновую кислоты; пальмитиновая кислота от стеариновой не была отделена [167]. Применяя в колонках водный этанол, выделили фракции, обогащенные пальмитиновой и стеариновой кислотами [165, 297].

В отличие от адсорбции на минеральных адсорбентах, адсорбция липидов на угле возрастает с увеличением m и снижением е; липиды обнаруживают здесь криволинейную изотерму адсорбции, т. е. их коэффициент распределения снижается при уменьшении концентрации разделяемого вещества в хроматографическом растворителе. Поэтому для фракционирования можно применить вытеснительную хроматографию. В колонку с углем вносили смесь жирных кислот с m = 16—20, а затем промывали колонку спиртовым раствором бегеновой кислоты (m = 22), которая служила вытеснителем. Бегеновая кислота, обладающая более высоким сродством к адсорбенту, чем все компоненты разделяемой смеси, вытесняла арахиновую кислоту; последняя, смещаясь по колонке, вытесняла стеариновую кислоту, а та в свою очередь — пальмитиновую кислоту, которая и выходила первой из колонки в виде отдельной фракции. Затем собирали фракции следующих кислот в порядке возрастания m [389]. Этот метод применили для разделения полиненасыщенных кислот рыбьего жира, а также простых эфиров глицерина и жирных спиртов [391]. <\br> Основной недостаток описанной методики заключается в том, что при переходе от одной фракции к другой элюат содержит обе соседние кислоты. Для количественного разделения компонентов применяли вытеснительную хроматографию с носителем. В колонку вносили смесь изомеров с m = 18: 2-амил-3-метил-додекановой, 2-гептилундекановой и 2-метилгептадекановой кислот; носителями для этих кислот служили соответственно метиловые эфиры лауриновой, миристиновой и пальмитиновой кислот, которые вводили одновременно с разделяемой смесью, причем количество носителя в 10 раз превышало количество пробы. Колонку промывали раствором вытеснителя — 1%-ного метилстеарата в 95%-ном этаноле. Выход эфиров из колонки регистрировали рефрактометром. Чистые фракции изомеров, которые элюировались в виде узкой зоны непосредственно перед фронтом соответствующего носителя, определяли титрованием [391].

В настоящее время почти не применяются такие разновидности адсорбционной хроматографии, как фронтальный анализ, который ранее использовали для предварительной оценки состава смеси перед разделением [389]. Для выделения свободных жирных кислот (СЖК) из смеси с моно-, ди- и триглицеридами ранее применяли ионообменную хроматографию на Амберлите IR-A 400 [114, 607]; сейчас показано, что поглощенные колонкой кислоты нельзя элюировать количественно [666]. На колонке с мочевиной достигли некоторого разделения нормальных и разветвленных жирных кислот; 1%-ный раствор метанола в изооктане извлекал из колонки преимущественно разветвленные кислоты [71].

ХРОМАТОГРАФИЯ НА КОЛОНКАХ С МИНЕРАЛЬНЫМИ АДСОРБЕНТАМИ

Хроматография на колонках была разработана раньше других адсорбционно-хроматографических методов. Этот метод часто используется и в настоящее время.

Хроматографические колонки могут иметь разное отношение диаметра к длине. Уменьшение диаметра увеличивает эффективность разделения, но в очень узкой колонке скорость тока растворителя сильно снижается [206, 225, 376, 645, 674, 831]. При адсорбционно-хроматографическом разделении часто наблюдаются искривление фронта зоны и ее расширение из-за диффузии вещества в колонке; этих нежелательных явлений можно в значительной степени избегнуть, используя составные колонки, у которых каждое последующее звено уже и длиннее предыдущего. Термостатирование водяной рубашкой улучшает воспроизводимость разделения [90, 389, 852, 970]. В элюате из колонки обычно содержится некоторое количество мелких частиц адсорбента, что может мешать химическому и биологическому изучению полученных липидов [999]. <\br> Используемый размер зерна адсорбента для колонок — от 100 до 325 меш; лучше применять узкий диапазон размеров частиц. При крупных зернах эффективность разделения больших количеств липидов снижается из-за быстрого протекания растворителя через колонку, тогда как при размере частиц менее 325 меш скорость потока резко падает [164, 330, 622, 666]. Раньше для ускорения протекания адсорбент смешивали с крупнозернистым кизельгуром или Целитом; сейчас этот способ применяют редко, поскольку включение в адсорбент еще одного переменного фактора нежелательно [98, 282, 327, 343, 345]. Поток можно усилить, применяя давление очищенного азота от 1 атм и выше; при этом надо иметь в виду, что продолжительное пребывание колонки под давлением приводит к уплотнению адсорбента и снижению скорости протекания [607, 823].

Колонку заполняют суспензией адсорбента в наименее полярном из применяемых в данном опыте растворителей — гексане, хлороформе и т. д. [395, 970]. Для удаления излишней воды и стабилизации влажности адсорбента колонку кондиционируют, пропуская через нее в изотермических условиях ацетон, смесь ацетона с эфиром (1 : 1), эфир и, наконец, петролейный эфир до полного удаления всех предыдущих растворителей, не адсорбированных на поверхности частиц; для стабилизации пользуются также бензолом и гексаном [581]. Часто рекомендуют вымывать метанолом избыток влаги в адсорбенте еще до использования других растворителей; при этом не учитывают, что спирты, подобно воде, образуют на поверхности кремнекислоты мономолекулярный слой, который не смещается другими растворителями и снижает адсорбирующую способность [276, 335, 634, 999].

При разделении нейтральных липидов скорость тока (0,1—2,5 мл/мин) зависит от условий опыта; при анализе продуктов присоединения по двойным связям липидов эта скорость выше обычной [806, 969, 985]. Перед анализом ненасыщенных липидов рекомендуется обрабатывать адсорбенты и растворители очищенным азотом, а все операции проводить без доступа воздуха [831].

Из адсорбентов в колоночной хроматографии чаще всего используется силикагель. Адсорбент предварительно активируют при 110—120° в течение 12—24 час., а колонку наполняют в вакууме при помощи вибратора [114, 226, 398]. На нейтральном силикагеле липиды делятся на классы разной полярности. Для количественного отделения СЖК от других липидов адсорбент обрабатывают 5%-ным раствором КОН в изопропиловом спирте в течение 5 мин. [666]. Для разделения метиловых эфиров жирных кислот и триглицеридов по величине е [330] используют силикагель, пропитанный AgNO₃ (стр. 24). При хроматографии на силикагеле гидролиза, разрушения или необратимого связывания нейтральных липидов не наблюдается. Отмечалась лишь изомеризация 2-моноглицеридов в 1(3)-изомеры, катализируемая спиртами [711, 791]. <\br> Во флоризиле содержится 15% химически связанной окиси магния (—Si—O—Mg—ОН или — Si—O—Mg—O—Si—); он может быть получен прибавлением MgSO₄ к раствору Na₂SiO₃, отмыванием сульфата натрия и нагреванием адсорбента до 1200°. Несмотря на большой размер зерна и, следовательно, более высокую скорость потока жидкости, флоризил по площади адсорбирующей поверхности на единицу объема не уступает лучшим сортам силикагеля [164]. Флоризил, содержащий 7% воды, пригоден для разделения смесей нейтральных липидов на отдельные классы и для отделения метиловых эфиров жирных 2-оксикислот от других липидов [108, 162, 577]. Трехкратным нагреванием адсорбента с концентрированной НСІ можно получить адсорбент, не содержащий MgO, свободного силиката и сопутствующих солей. Такой адсорбент по свойствам не отличается от силикагеля; благодаря крупнозернистости материала приготовление колонок и разделение липидов занимают не более 4—5 час. [163].

В работах раннего периода для разделения отдельных классов липидов (неомыляемых, метиловых эфиров жирных кислот, глицеридов и СЖК) использовали колонки, наполненные окисью алюминия [71, 285, 701, 941, 942, 983, 986, 992]. Этот адсорбент может вызывать гидролиз сложных эфиров и изомеризацию двойных связей и потому сейчас применяется для хроматографии липидов сравнительно редко — например, для разделения эфиров кислот, у которых к двойным связям присоединены перекисные группы, бром или ацетат ртути [97, 403, 588]. Для фракционирования метилолеата, -линолеата и -линолената, а также их ацетоксимеркуриметокси-(АОММО-) производных использовали колонки с кизельгуром [440].

Окись магния применяли для анализа липидов лишь в начальный период развития адсорбционной хроматографии, в связи с тем что этот адсорбент малоэффективен. Так, для отделения олеиновой кислоты от стеариновой на колонке MgO требуется более 17 суток. Аддукты жирных кислот и 2,4-динитробензосульфохлорида разделяли на MgSO₄ [114, 305, 877]. В настоящее время MgO и MgSO₄ в хроматографии липидов не используются.

Метилолеат, -линолеат и -линоленат, и также их цис-, транс-изомеры разделяли на катионообменных смолах, пропитанных AgNO₃ [263, 1002].

Для получения хроматограммы и анализа отдельных фракций пробу липидов вносят в верхнюю часть колонки в смеси с адсорбентом или чаще в минимальном объеме петролейного эфира, бензола или хлороформа [838]. Размер пробы зависит от природы адсорбента и разделяемых липидов; при перегрузке колонки ее эффективность резко снижается [755]. Длительность разделения на колонке обычно 8—24 час. (иногда до 200 час.) [327].

Выход нейтральных липидов и АОММО-производных метилолеата и метиллинолеата из колонки обычно составляет 95—100%; для АОММО-производного метиллинолената выход не превышает <\br> 56% из-за сильной адсорбции [985]. В ранних работах из колонки после разделения вырезали окрашенные участки, содержащие производные жирных кислот, окрашенные вещества элюировали и колориметрировали [305, 877]. Сейчас идентификацию и количественное определение липидов проводят после сбора отдельных фракций элюата. Для количественного анализа фракции взвешивают или же определяют в них органическое вещество путем его окисления 0,1 н. раствором Na₂Cr₂O₇ и последующей колориметрии [839а]. Иногда проводят элементарный анализ полученных фракций или определяют в них функциональные группы. По полученным данным строят кривые элюирования, где площадь каждого пика отражает содержание соответствующего компонента в смеси [76, 330]. Эти кривые можно также получить при помощи самопишущего рефрактометра, установленного на выходе колонки, и по поглощению инфракрасного (ИК) света С=О-группами липидов при 1745 см⁻¹. Оптические кривые элюирования обычно совпадают с гравиметрическими [161, 814, 1001].

Для идентификации липидов в элюате определяют кислотное и иодное числа [756, 816], содержание сложноэфирных связей [376], ИК-спектр [588] или радиоактивность [607]. Кривые элюирования для моно-, ди- и триглицеридов строили по содержанию во фракциях глицерина [108], а для АОММО-производных метиловых эфиров — по реакции на ртуть с S-дифенилкарбазоном [440]. Выделенные классы липидов идентифицировали хроматографией на бумаге, пропитанной кремнекислотой [164, 237, 1014], или при помощи тонкослойной хроматографии [831], а жирнокислотный состав классов устанавливали газо-жидкостной хроматографией [160a, 277, 441, 984].

Сложную смесь липидов, сильно различных по полярности, обычно нельзя разделить на колонке одним растворителем. Работы школы Т. Рейхштейна показали, что в таких случаях в хроматографическую систему надо последовательно вводить растворители возрастающей полярности. Эта полярность может изменяться ступенчато, если данный растворитель после выхода из колонки определенного класса липидов сразу заменяется следующим, более полярным. Если же два растворителя разной полярности непрерывно смешиваются, то создается плавный возрастающий градиент концентрации более полярного компонента в смеси, т. е. градиент элюирующей способности растворителя [622, 815].

Обычно рекомендуется использовать ступенчатое элюирование, как более быстрое и простое по выполнению [225]. Предварительно полярность отдельных систем растворителей в применении к данной смеси липидов можно определить при помощи хроматографии на бумаге из стеклянных волокон. Порядок выхода липидов из колонок был указан выше (стр. 24) [501, 999].

Для разделения нейтральных липидов на отдельные группы классов, близких по полярности, применяли простые по составу смеси растворителей. Так, сумму нейтральных липидов можно <\br> элюировать хлороформом или эфиром. После удаления последних, СЖК, адсорбированные на силикагеле с высоким содержанием силиката К, элюировали 2%-ным раствором НСООН в эфире [666]. При фракционировании смеси липидов на классы разной полярности обычно применяют раствор эфира в петролейном эфире: 1%-ный для выделения восков и метиловых эфиров кислот, 4%-ный — для триглицеридов, 50%-ный — для жирных кислот, 60%-ный — для диглицеридов и чистый эфир — для моноглицеридов [711]. При работе на сильно адсорбирующих колонках флоризила полярность смесей этих растворителей возрастала более резко, чем в предыдущем случае, а СЖК элюировались лишь раствором СН₃СООН в эфире. Для разделения восков смесь эфира с петролейным эфиром можно заменить бензолом, хлороформом, пропанолом или уксусной кислотой [591].

Адсорбционная хроматография была использована для частичного разделения бинарных смесей метиловых эфиров жирных кислот, причем с увеличением е эффективность разделения сильно снижалась. В качестве растворителей были использованы смеси петролейного эфира с эфиром и бензолом. При хроматографии на силикагеле или окиси алюминия в анаэробных условиях с применением растворов эфира в гексане получили препараты метиловых эфиров линолевой, линоленовой, арахидоновой, эйкозапентаеновой и докозапентаеновой кислот с чистотой 92—99%. Метиловые эфиры жирных кислот, содержащих разное число ОН-групп и тройных связей, разделялись полностью [358, 600, 825]. Хроматография триглицеридов растительных масел на колонках с минеральными адсорбентами не привела к выделению отдельных видов глицеридов, однако крайние фракции элюата могли различаться по иодному числу на 65—70 ед. Для разделения моно-, ди- и триглицеридов на силикагеле и флоризиле применяли смеси этилового эфира с бензолом, изопропилового эфира с изооктаном и этанолом и петролейного эфира с хлороформом и ацетоном; в результате эти глицериды полностью отделялись друг от друга и от примеси минерального масла [992].

Для фракционирования липидов по е применяли хроматографию продуктов присоединения по двойным связям. Метиловые эфиры жирных кислот, содержащие перекисные или диоксигруппы, разделяли смесью метанола с СН₂Сl₂. Реакция ненасыщенных кислот с 2,4-динитробензосульфохлоридом с образованием окрашенных продуктов присоединения служила для хроматографического выделения производных линоленовой, линолевой, олеиновой и насыщенных кислот на MgSO₄ при использовании смеси бензола с эфиром 19 : 1 в качестве растворителя [97, 877]. Бромирование усиливает адсорбцию липидов и обеспечивает полное разделение эфиров кислот с разным е; диастереоизомеры с одинаковым содержанием брома почти не отделялись друг от друга. Метилолеат-J¹³¹ адсорбировался на кремнекислоте сильнее, чем метилолеат [403]. <\br> Насыщение цис-двойных связей липидов ацетатом двухвалентной ртути с образованием АОММО-производных позволяет отделить насыщенные компоненты при помощи петролейного эфира, бензола или эфира [371, 888]. Триглицериды и другие липиды разделяли по е смесями бензола, эфира, метанола и уксусной кислоты. Производные липидов с е > 3—4 полностью из колонки не элюируются. Исходные липиды регенерируют из АОММО-производных соляной кислотой, причем, как было показано, транс-изомеры при разделении и регенерации не образуются [588].

В настоящее время для разделения по е применяют колонки

Рис. 1. Изменение концентрации более полярного растворителя в бинарной смеси в зависимости от ее объема 1—3 — выпуклый, линейный и вогнутый непрерывные градиенты; 4, 5 — ступенчатое элюирование

с адсорбентами — силикагелем или катионообменными смолами, пропитанными AgNO₃ (стр. 24); растворителями обычно служат смеси петролейного эфира с бензолом, толуолом и хлороформом, а в случае ионообменных смол — смеси метанола с этанолом. Метиловые эфиры и триглицериды с Δе = 1, цис- и транс-изомеры этих липидов разделялись полностью, а чистота препаратов обычно превышала 95% [263, 820, 969, 970, 1002].

Кроме ступенчатого элюирования в колоночной хроматографии липидов широко применяют градиентное элюирование, особенно при разделении смеси из многих компонентов, не сильно различающихся по полярности [225]. Раствор полярного растворителя концентрации С в неполярном растворителе непрерывно поступает в течение времени t со скоростью R в неполярный растворитель, имеющий объем V. Смесь непрерывно перемешивается и с той же скоростью R подается в адсорбционную колонку. Концентрация Е полярного растворителя в растворе, поступающем в колонку, определяется уравнением Е = C — (C/e^(Rt/V)), где е — основание натуральных логарифмов. Изменяя величину V, можно выбрать требуемый для данного разделения градиент — выпуклый, линейный или вогнутый (рис. 1) [376, 1000].

Для разделения смесей липидов на классы применяли выпуклые («convex») градиенты: петролейный эфир → эфир → метанол, гексан → бензол и хлороформ → метанол; разделение было всегда эффективнее, чем при ступенчатом элюировании [998]. С помощью градиентного элюирования смесью гексан → эфир триглицериды высших жирных кислот частично отделили от глицеридов летучих кислот [838].

ΧΡΟΜΑΤΟΓРАФИЯ НА ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГЕ, ПРОПИТАННОЙ АДСОРБЕНТОМ

В 1950 г. был предложен новый способ адсорбционно-хроматографического разделения липидов — хроматография на фильтровальной бумаге, пропитанной кремнекислотой [576]. Для получения слоя адсорбента полосы толстой фильтровальной бумаги погружают в 30—40%-ный водный раствор силиката натрия или калия, удаляют избыток силиката с поверхности, а остальной силикат превращают в кремнекислоту или силикагель обработкой бумаги 4—6 н. НСІ или соответственно 5%-ным раствором NН₄CI [620, 687, 723]. Обычно при получении пропитанной бумаги стремятся достичь возможно большей концентрации кремнекислоты, поскольку снижение содержания адсорбента в бумаге вызывает удлинение пятен липидов на хроматограмме. Пропитанную бумагу промывают, высушивают, разглаживают под прессом и активируют при 110° в течение нескольких часов. При увеличении рН промывающего раствора получают кремнекислоту с возрастающим содержанием силиката — кислую, нейтральную или основную. Для равномерного нанесения смеси липидов на стартовый участок хроматограммы перед разделением используют растворители такой полярности, которые легко элюируют данную смесь с пропитанной бумаги [220, 833].

Оптимальную для данных условий концентрацию липидов (от нескольких микрограммов до миллиграмма) обычно определяют эмпирически. Хроматограмму с нанесенными липидами сразу же помещают в камеру с растворителем, иначе часть липидов может подвергнуться окислению. Для определения состава липидов сыворотку крови и другие жидкости биологического происхождения можно наносить непосредственно на хроматограмму без предварительной экстракции [688]. При разделении липидов применяют восходящую хроматографию в атмосфере инертного газа. Для хроматографии и насыщения камеры пользуются свежеприготовленными растворителями. Процесс разделения зависит от влажности окружающего воздуха и его температуры. Гидролиз липидов при разделении не наблюдается. Если эффективность разделения липидов в данном растворителе мала, то увеличение длительности разделения обычно не ведет к повышению эффективности; в таких случаях следует изменить состав хроматографического растворителя [932].

Условия проведения адсорбционной хроматографии на фильтровальной бумаге, пропитанной кремнекислотой, приведены в табл. 2. Природную смесь липидов разделяют на классы на кислой и нейтральной бумаге, используя смеси неполярных растворителей — петролейного эфира, бензола, эфира. Отдельные классы располагаются, начиная от старта, в обычной последовательности (стр. 24). Разделение липидов улучшается при отсутствии в бумаге ионов Na⁺ и СІ⁻. С увеличением полярности раствори- <\br> Таблица 2 Условия адсорбционной хроматографии липидов на фильтровальной бумаге Ватман № 1, пропитанной кремнекислотой

теля подвижность липидов на бумаге возрастает [219]. При помощи неполярных растворителей можно разделить по числу е эфиры холестерина и жирных кислот — насыщенных, олеиновой, линолевой и линоленовой + арахидоновой. Чистота полученных фракций была подтверждена газо-жидкостной хроматографией. Для разделения смеси эфиров холестерина в нижний левый угол квадрата бумаги, пропитанной кремнекислотой, помещали исследуемую пробу и разделяли смесь петролейным эфиром в одном направлении — по е. Затем среднюю и правую части квадрата пропитывали жидким парафином и проводили распределительную хроматографию по числу m в направлении, перпендикулярном первому, применяя смесь СН₃COOH, CHCl₃ и жидкого парафина (16 : 3 : 1) в качестве растворителя [286, 723]. Сочетание адсорбционного и распределительного метода в виде двумерной хроматографии использовали также для разделения липидов листьев, причем в одном направлении бумагу пропитывали ZnCO₃, а в другом направлении — жидким парафином. Нисходящую хроматографию на бумаге Ватман № 40, пропитанной кремнекислотой, применяли для эффективной очистки липидов от примесей нелипидной природы [100, 113].

Условия обнаружения насыщенных и ненасыщенных нейтральных липидов и жирных кислот приведены в табл. 2. Лучшим неспецифическим проявителем для всех липидов является Родамин 6 G в 2 н. растворе NaOН; после опрыскивания желтые пятна <\br> липидов на пурпурном фоне наблюдают и фотографируют в УФ-свете [427]. Абсолютная и относительная величины Rƒ при адсорбционной хроматографии сильно зависят от концентрации отдельных компонентов, свойств бумаги и других условий разделения. Индивидуальные классы или фракции липидов элюируют с бумаги метанольным раствором HCI или другими растворителями и подвергают гидролизу или метанолизу [583, 932].

ΧΡΟΜΑΤΟΓРАФИЯ НА БУМАГЕ ИЗ СТЕКЛЯННОГО ВОЛОКНА

В 1956 г. в лаборатории Дикерта было обнаружено, что фильтровальная бумага как носитель кремнекислоты может быть с успехом заменена бумагой из стеклянного волокна. С тех пор этот метод получил довольно широкое распространение в хроматографии липидов и других природных соединений [245, 722].

Марки наиболее часто используемых сортов стеклянной бумаги указаны в табл. 3. Перед пропиткой ее выдерживают при 600° в течение 30—60 мин. для очистки от органических веществ. Стеклянную бумагу пропитывают с обеих сторон кремнекислотой так же, как фильтровальную бумагу, а затем отмывают от органических примесей эфиром; содержание кремнекислоты в такой бумаге достигает 3,6 мг/см² [51, 221, 745]. При снижении концентрации кремнекислоты с 38 до 1—2% адсорбент равномернее распределяется среди волокон, а чувствительность проявления пятен возрастает; наблюдается также увеличение «фактора разделения» липидов — соотношения величин Rƒ двух соседних пятен. После пропитки разбавленным раствором силиката бумагу надо высушить при 100°, а затем обработать соляной кислотой; такая обработка способствует увеличению ее механической прочности [338].

Одно из преимуществ стеклянной бумаги состоит в возможности пропитки ее не только кремнекислотой, но также щелочным силикатом и силикагелем [338, 921]. Для получения пропитанной силикагелем бумаги, которая отличается высокой эффективностью разделения, полосы погружают в 20%-ный пересыщенный раствор ортокремневой кислоты, которая при высыхании бумаги в течение нескольких минут превращается в силикагель. Скорость образования геля пропорциональна содержанию NH₄CІ в растворе; соль удаляют с бумаги сублимацией или промыванием [339].

Высокая чувствительность хроматографии на бумаге из стеклянных волокон позволяет обнаруживать отдельные компоненты смеси в количестве 0,2 мкг; обычно вес пробы составляет 5—20 мкг, причем бумага, пропитанная силикагелем, обладает пониженной емкостью [338]. Для насыщения камеры парами растворителя ее внутренние стенки обкладывают фильтровальной бумагой и бумагу перед хроматографией выдерживают в такой камере в течение 10—60 мин. [246]. Для разделения применяют восходящую хроматографию; снижение скорости тока растворителя на бумаге увеличивает эффективность разделения. Окисления и гидролиза <\br> Таблица 3 Адсорбционная хроматография липидов на бумаге из стеклянного волокна, пропитанной кремнекислотой, силикатом или силикагелем

2*

липидов в процессе хроматографии не происходит. Стеклянную бумагу можно использовать и в качестве носителя для обращенно-фазовой хроматографии [745].

Условия адсорбционной хроматографии нейтральных липидов на бумаге из стеклянного волокна приведены в табл. 3. При разделении смеси липидов на классы стеклянная бумага применяется аналогично пропитанной фильтровальной (стр. 32), и последовательность классов остается прежней [170]. На бумаге, содержащей 1—2% кремнекислоты, глицериды располагались от старта следующим образом: моноглицериды, 1-ацетодиглицериды, диглицериды высших жирных кислот, 1,2-диацетотриглицериды, 2-ацетотриглицериды, триглицериды высших жирных кислот; внутри этих классов разделения не было достигнуто. На той же бумаге разделили метиловые эфиры гекса-, тетра- и дибромстеариновых кислот, а также насыщенных жирных кислот; свободные ди- и тетрабромстеариновые кислоты не отделялись друг от друга. Небромированные метиловые эфиры не разделялись между собой [766]. Метиловые эфиры ненасыщенных жирных кислот хорошо отделялись при хроматографии на бумаге, пропитанной силикагелем. По величине Rƒ эфиры ненасыщенных кислот совпадали с насыщенными эфирами, содержащими в цепи на шесть С-атомов меньше. Разделения насыщенных эфиров между собой не наблюдалось. Если растворителем при хроматографии на полоске с силикагелем служил изооктан, то холестерин обнаруживал большую подвижность, чем триглицериды; такая последовательность липидов еще не наблюдалась ни в одной адсорбционно-хроматографической системе. При добавлении к изооктану возрастающих количеств изопропилацетата, дихлорэтана, бензола или эфира холестерин занимает свое обычное место позади триглицеридов. Данную закономерность можно использовать для хроматографической идентификации липидов. Липиды, различающиеся только по m, на стеклянной бумаге не разделяются [339].

Желая обнаружить пятна липидов, бумагу опрыскивают концентрированной или 50%-ной серной кислотой и нагревают. При 200—300° и выше липиды обугливаются и выступают в виде темных пятен; метиловые эфиры жирных кислот, обладающие наибольшей устойчивостью к окислению, обугливаются в последнюю очередь. Для получения количественных данных оптическую плотность пятен измеряют денситометром [745]. Вместо серной кислоты можно использовать раствор К₂Cr₂O₇ в серной кислоте или хлорную кислоту [722]. Цветные реакции, применяемые на фильтровальной бумаге, вполне пригодны и для стеклянной бумаги, хотя по чувствительности они значительно уступают реакции с серной кислотой [221]. Обугливание липидов нагреванием с серной кислотой в сочетании с денситометрией использовали для количественного определения липидов в последовательных фракциях элюата хроматографической колонки и построения выходных кривых элюирования [980].

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Быстрое развитие биохимии липидов в течение последних 10 лет вызвало появление микрохроматографических методов разделения: газо-жидкостной хроматографии и обращенно-фазовой распределительной хроматографии. Для фракционирования сложной смеси природных липидов на отдельные классы возникла потребность в надежном, быстром и простом по выполнению микроадсорбционном методе. Отчасти эта потребность была удовлетворена использованием хроматографии на фильтровальной или стеклянной бумаге, пропитанной адсорбентом. Однако данные виды хроматографии не вошли в повседневную практику из-за необходимости длительной процедуры пропитывания для каждого определения, трудности препаративного выделения липидов и других причин. Начиная с 1959 г. в биохимии липидов широко применяется открытая Шталем хроматография в тонком слое адсорбента [681, 891], которая стала сейчас главным адсорбционно-хроматографическим методом. Общие сведения о принципах и аппаратуре тонкослойной хроматографии содержатся в имеющихся обзорах [6, 164a, 672a, 678a].

Слой адсорбента распределяют на обычной или матовой стеклянной пластинке. Поверхность стекла перед нанесением должна быть совершенно чистой. Иногда слои наносят на предметные стекла 7,6 × 2,5 см или на внутреннюю поверхность пробирок 150 × 13,5 см [65, 88, 380, 393, 626, 777, 778]. В качестве адсорбента для тонкослойной хроматографии липидов в большинстве случаев используют силикагель G, который содержит 85% силикагеля (200 меш) и 15% гипса — закрепителя слоя. Перед нанесением адсорбент перемешивают с двумя весовыми частями воды [682]. Реже применяют смеси силикагеля с 1—8% CaSO₄ или с 5% крахмала, а также суспензии силикагеля G в хлороформе [121, 236, 239, 392, 679, 967]. Из других адсорбентов для разделения служат Al₂O₃ без фиксатора, адсорбосил и гидроксилапатит, содержащий 8% CaSO₄ [381, 948].

Густую смесь силикагеля, воды и фиксатора нагревают до 70° или выдерживают в вакууме для удаления пузырьков воздуха и наносят аппликатором на пластинки при толщине слоя 250—500 мк. Пластинки подсушивают, активируют при 95—120° в течение 0,5—2 час. и хранят над Р₂О₅ [561, 920]. В случае неводных суспензий силикагеля пластинку или пробирку погружают для нанесения в эту суспензию на несколько секунд [626]. Для лучшего разделения удаляют адсорбент с краев пластинки, проделывают в нем бороздки, параллельные направлению тока растворителя, и промывают пластинку восходящим током СНСl₃ [682]. Для препаративного выделения нейтральных липидов наносят смесь силикагеля и 2—5% СаSО₄ с водой (1 : 1,57—1 : 1,70), слой подсушивают нагреванием, активируют 24 часа при 110° и промывают СНСl₃; при этих условиях слои до 3 мм толщиной не обра- <\br> зуют трещин при высыхании. Емкость таких пластинок достигает 25 мг для каждого компонента смеси на 1 мм толщины слоя [393].

При необходимости фракционирования смеси липидов, различающихся по е, применяют пластинки с тонким слоем силикагеля, содержащим ионы Ag⁺. Силикагель G перед нанесением перемешивают с 12—50%-ным раствором AgNO₃ и наносят на пластинки; иногда пластинки опрыскивают раствором AgNO₃ в воде или метаноле [9, 87, 637, 734, 735, 973]. Для разделения липидов, различающихся числом или положением ОН-групп, пластинки опрыскивают насыщенным раствором Н₃ВО₃, буры или арсенита натрия в метаноле [737]. В отдельных случаях силикагель до нанесения на пластинки пропитывали веществами, флуоресцирующими в УФ-свете, — цинк-кадмий-сульфидом или 2,7-дихлорфлуоресцеином; на таких хроматограммах положение липидов устанавливали без опрыскивания окрашивающим реактивом [149]. При обращенно-фазовой хроматографии пластинки обрабатывали растворами гидрофобных соединений (стр. 52) [554].

Липиды растворяют в наименее полярном из возможных растворителей и 0,5—200 мкг смеси наносят в 2—3 см от нижнего обреза пластинки в виде точек или полос; в случае препаративного разделения 0,5—10 мг смеси липидов помещают полосой в углублении слоя адсорбента, не достигающем поверхности стекла, избегая нанесения вблизи боковых краев пластинки [736]. При круговой хроматографии липиды наносят в центр пластинки. Разделение в тонком слое проводят в тех же условиях, что и разделение на стеклянной бумаге (стр. 34). При нисходящей или круговой хроматографии растворитель подают на пластинку «язычком» из фильтровальной бумаги. Пластинку выдерживают в камере в течение различного времени (до нескольких часов); при этом растворитель продвигается на 10—15 см [1016]. Липиды можно разделять многократно одним и тем же или другим растворителем в одном и том же направлении, благодаря чему зоны компонентов сужаются, или же фракционировать по двумерному способу, причем хроматография в другом направлении может быть и распределительной. Эффективность разделения увеличивается при непрерывном испарении растворителя с верхнего края пластинки [1015].

Для разделения нейтральных липидов чаще всего служат смеси петролейного эфира с более полярными растворителями. Раствор, содержащий 5—50% эфира в петролейном эфире, применяют при разделении метиловых эфиров насыщенных, ненасыщенных, окси-, кето- и бромзамещенных жирных кислот [683, 871], кислородсодержащих липидов [917], моно-, ди- и триглицеридов [308, 836] и озонидов триглицеридов [797, 799, 803], причем отдельные классы нейтральных липидов располагаются на пластинке в обычном порядке (стр. 24) [684]. При наличии в препарате свободных жирных кислот для разделения на классы используют тот же раствор, содержащий 1—3% уксусной кислоты или мета- <\br> нола [678, 834, 991], а также петролейный эфир : бензол 4 : 7 или 9 : 1 [555]. Смесь жирных кислот и моно-, ди- и триглицеридов разделяют в системе гептан : диизопропиловый эфир : уксусная кислота = 6 : 4 : 0,2 [381, 536]. В других исследованиях при разделении нейтральных липидов использовали растворители, не содержащие алифатических углеводородов. Так, для анализа восков применяли смеси бензола с CHCl₃ 1 : 1 или эфиром 4 : 1 [735]. Система CHCl₃ : ацетон : аммиак (45 : 5 : 0,1) была растворителем при разделении липидов сыворотки крови [239]. При помощи двумерной хроматографии, где растворителями были эфир и 1,5%-ный раствор уксусной кислоты в изопропиловом спирте, препарат липидов разделили на 11 различных классов [533]. Для отделения друг от друга 1(3)- и 2-моноглицеридов применяли смеси равных объемов диоксана с изоамилацетатом или бутиловым эфиром [381]. При разделении липидов в виде комплексов с Ag⁺ согласно их е использовали разнообразные системы растворителей. Например, для метиловых эфиров применяли гексан : эфир (41 : 9, 9 : 1, 3 : 2, 2 : 3), бензол : эфир (4 : 1), бензол : петролейный эфир (7 : 3, 8 : 2, 9 : 1) [9, 734]; для триглицеридов — хлороформ : уксусная кислота (149 : 1), CCl₄ : CHCl₃ : CH₃COOH : C₂H₅OH = 60 : 40 : 0,5 : 1,5 или бензол [87, 88]; для озонидов триглицеридов — петролейный эфир : эфир = 4 : 1 [797]. Продукты гидроксилирования эфиров жирных кислот фракционировали смесью CHCl₃ : CH₃OH : CH₃COОН (45 : 5 : 1) или CHCl₃ : CH₃OH (95 : 5—99 : 1) [737], а АОММО-производные — 1%-ным раствором уксусной кислоты в изопропаноле [683].

После аналитического разделения в тонком слое липиды можно обнаружить и количественно определить воздействием агрессивных реактивов (серной кислоты, хлорной кислоты и др.) при высокой температуре. Благодаря такой возможности тонкослойная хроматография по чувствительности, а следовательно, и по эффективности разделения превосходит другие адсорбционные и хроматографические методы и приближается к газо-жидкостной хроматографии. Обычно после улетучивания растворителя пластинки опрыскивают концентрированной серной кислотой, 50%-ной серной кислотой, насыщенным раствором К₂Сr₂O₇ в 80%-ной серной кислоте, 25%-ной хлорной кислотой или 5%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле с последующим нагреванием до 100—200° в течение 10—30 мин. до появления темных и голубых пятен. Таким способом можно обнаружить в пятне 0,5 мкг и менее липидов [537, 796, 798]. Интенсивность окраски темных пятен липидов определяли денситометрически без светофильтра. Достоверные количественные данные были получены при использовании раствора бихромата калия в 80%-ной серной кислоте с нагреванием до 180° в течение 25 мин.; при обугливании с серной кислотой ненасыщенные липиды дают более темную окраску по сравнению с насыщенными. Абсолютная ошибка определения составляла 1—3% [798]. Серную кислоту не сле- <\br> дует применять для обработки пластинок с Ag⁺; пятна глицеридов на таких пластинках обнаруживают и определяют количественно с 50%-ной фосфорной кислотой [88, 329].

Для универсального обнаружения липидов после препаративного разделения имеется ряд цветных реакций. Опрыскивание 0,2%-ным спиртовым раствором 2,7-дихлорфлуоресцеина и последующее облучение пластинок УФ-светом служат для определения отдельных классов неполярных липидов, в том числе метиловых эфиров жирных кислот и глицеридов; вместо 2,7-дихлор- иногда применяют дибромфлуоресцеин [106, 963]. Как и в хроматографии на бумаге, в тонкослойной хроматографии для проведения неспецифических реакций на липиды часто используют Родамин С или 6G и пары иода. После реакции с иодом липиды можно идентифицировать по скорости обесцвечивания; чувствительность проявления при 60° составляет 1 мкг [878, 881, 974, 976]. Если после разделения обработать силикагель на пластинке диметилдихлорсиланом, то при погружении в 20%-ный этанол триглицериды выступают в виде прозрачных пятен на матовом фоне [536]. АОММО-Производные ненасыщенных липидов обнаруживаются 0,1%-ным спиртовым раствором S-дифенилкарбазона. Все эти реакции используют и после аналитического разделения [683].

Препаративное получение липидов для количественного анализа и исследования их состава другими методами, а также для измерения радиоактивности осуществляется путем соскабливания соответствующего участка слоя с пластинки и элюирования пробы разными растворителями. Нейтральные липиды элюируют метанолом, хлористым метиленом, хлороформом или раствором сцинтиллятора. Эффективность элюирования достигает 90—97% [920]. Фотометрическое количественное определение липидов в элюате можно выполнять без удаления силикагеля. Для определения радиоактивности липидов проводят денситометрию радиоавтографов тонкослойных пластинок. Тонкослойные хроматограммы фотографируют сразу после окрашивания [736].

Последовательность расположения нейтральных липидов на пластинке с силикагелем в системах растворителей, содержащих уксусную кислоту, была указана выше (стр. 24). Если уксусная кислота в подвижной фазе не содержится, то жирные кислоты в ряду полярности занимают место между фосфолипидами и стеринами [218, 330]. Тонкослойной хроматографией можно очистить триглицериды жирных кислот от углеводородов, а также выделить из пчелиного воска некоторые липиды, например жирные кислоты, рицинолеиловый спирт, парафины, стеарилстеарат, стеарилрицинолеат, дистеарилсебацинат, стеарил-9,10-диоксистеарат и холестерин [231, 514]. На пластинке с силикагелем G разделили липиды с Δm = 4. Этот метод часто используют при оценке чистоты метиловых эфиров жирных кислот для газо-жидкостной хроматографии и других целей [779]. <\br> Благодаря разному числу полярных групп были разделены смеси моно-, ди- и триглицеридов — свободных и ацетилированных, смесь моно-, ди- и тририцинолеотриглицеридов, окси- и диоксистеариновые кислоты, окси- и эпоксижирные кислоты, а также метиловые эфиры этих жирных кислот [678, 684]. Из масла Sapium sebiferum выделили глицериды 2,4-декадиеновой кислоты [675] (стр. 192). Сродство липидов к адсорбенту определяется не только числом, но и положением полярных групп в молекуле. Так, достигнуто разделение 9,10-диокси-, 6-, 14- и 2-оксистеаратов, 9-окси-9,12-октадекадиеноата и 13-окси-9,11-октадекадиеноата, а также 12,13- и 9,10-эпоксиоктадеценоата [741, 742, 744]. Полученные глицеролизом 1(3)- и 2-моно- и 1,3- и 1,2(2,3)-диглицериды разделяли на силикагеле; при движении моноглицеридов в слое гидроксилапатита 2-изомер из-за ацильной миграции превращался в 1(3)-моноглицерид. Чтобы избежать этого, смесь 1(3)- и 2-изомеров до разделения окисляли периодатом; при этом 1(3)-моноглицерид превращался в эфир гликолевого альдегида, который хорошо отделялся от 2-изомера [795].

Большой интерес представляют те исследования, в которых для разделения липидов с разным е и различным положением двойных связей в цепи создавали новый градиент полярности путем присоединения к ненасыщенным связям тех или иных заместителей. После бромирования эфиров олеиновой, линолевой и линоленовой кислот их отделяли от насыщенных эфиров и разделяли между собой [871]. Озониды триглицеридов кукурузного, оливкового и соевого масел разделяли на силикагеле по е. Отдельные фракции элюировали и восстанавливали водородом над PdO₂. При этом цепи ацилов ненасыщенных кислот у девятого атома углерода разрывались, и в этих положениях возникали альдегидные группы. Насыщенные ацилы в данных условиях не изменялись. Продукты восстановительного озонолиза разделяли для определения [S₃], [S₂U], [SU₂] и [U₃] в типовом составе этих масел [797]. АОММО-Производные ненасыщенных метиловых эфиров разделяли по е, регенерировали исходные эфиры соляной кислотой и жирнокислотный состав каждой е-фракции определяли методом газо-жидкостной хроматографии [444].

Весьма эффективным оказалось фракционирование липидов на пластинке с силикагелем, пропитанным AgNO₃. Метиловые эфиры жирных кислот и триглицериды разделяются на таких пластинках в основном по олефиновому составу (Δе = 1). Этот метод может быть препаративным, а также использоваться для количественного определения триглицеридов [973]. Однако деление не всегда происходит строго по величине е, поскольку комплексообразующая способность ацилов с разным е не прямо пропорциональна величине е. Если у S-ацилов эту способность принять равной нулю, то у олеата она равна 1, у линолеата 2 + а, а у линолената 4 + 4а, где а < 1. Можно видеть, что линолеат по этому признаку превосходит два остатка олеата, а линоленат — <\br> два остатка линолеата; триолеин (е = 3) совпадает по положению на хроматограмме с дипальмитолинолеином (е = 2), а стеародилиноленин (е = 6) превосходит по подвижности дилинолеолиноленин с семью двойными связями [318].

В ряду метиловых эфиров с е = 1 и 2 и одинаковым значением m, но с разным положением двойной связи в цепи, величина Rƒ возрастала при увеличении расстояния между ненасыщенной связью и сложноэфирной группой [9]. Разделялись 1,3- и 1,2-позиционные изомеры диолеина, а также 1(3)- и 2-олео- и -линолеодистеарины [87]. Для метиловых эфиров моно-, ди- и триеновых кислот, а также триглицеридов различие в геометрической конфигурации только одной двойной связи обеспечивало разделение, причем транс-изомеры двигались на пластинке, содержащей ионы Ag⁺, дальше, чем соответствующие цис-изомеры [734].

Диастереоизомеры насыщенных липидов также могут разделяться на силикагеле, не содержащем комплексообразующих агентов. Цис-изомеры озонидов моноеновых эфиров двигались быстрее транс-изомеров, а эритро-формы бромированных метилстеаратов — впереди соответствующих трео-форм; в то же время в ряду эфиров жирных оксикислот трео-изомеры отличались большей подвижностью, чем эритро-формы [871]. Пропитывание адсорбента борной кислотой, бурой, арсенитом натрия или другими комплексообразующими агентами не изменяет последовательности элюирования стереоизомерных диоксистеаратов, но значительно увеличивает его эффективность; появляется также возможность фракционирования метиловых эфиров эритро-, трео-изомеров три- и тетраоксистеариновой кислоты [734, 737, 803, 871].

ЗНАЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ РАЗНОВИДНОСТЕЙ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Обилие и некоторая разноречивость приведенных выше данных требуют оценить и подытожить достоинства и недостатки каждой разновидности адсорбционной хроматографии липидов.

Использование вытеснительной хроматографии с носителем ограничивается сложностью требуемой аппаратуры, а также тем, что качественный состав анализируемой смеси надо знать до разделения. Носители обычно подбирают так, чтобы после проведения опыта их можно было легко отделить от исследуемых соединений. В настоящее время активированный уголь уступил место более эффективным адсорбентам.

Адсорбционная хроматография на колонках используется теперь главным образом как препаративный метод, поскольку в аналитической области она не может конкурировать по быстроте и эффективности разделения с другими хроматографическими методами. На адсорбционных колонках сравнительно легко получить до грамма отдельных классов липидов, причем даже для наиболее лабильных соединений выход обычно близок к 100%. <\br> Разделение и количественное определение фракций легко поддаются автоматизации; в этом отношении адсорбционный метод уступает только газо-жидкостной хроматографии. По емкости адсорбционные колонки далеко превосходят распределительные, поскольку удельная поверхность у адсорбента всегда значительно больше, чем у жидкой фазы в распределительно-хроматографической системе. Слабыми сторонами адсорбционного разделения на колонках являются его недостаточная эффективность и большая длительность; кроме того, метод еще маловоспроизводим в разных лабораториях. Препаративная работа на колонках возможна лишь при строгом контроле за всеми параметрами опыта [376].

Хроматография липидов на пропитанной адсорбентом фильтровальной бумаге имеет ряд преимуществ перед другими способами адсорбционной хроматографии. По сравнению с бумагой из стеклянных волокон целлюлозная бумага дешевле и удобнее в обращении [687]. Поскольку тонкослойная хроматография отличается более высокой эффективностью, отдельный класс липидов может давать более чем одно пятно. Это обстоятельство затрудняет разделение смесей неизвестного состава [833]. Адсорбционная хроматография на бумаге, в отличие от тонкослойной хроматографии, обычно не дает пятен с «хвостами», обеспечивает большую воспроизводимость величины Rƒ и не вносит ошибки, связанной с препаративным выделением вещества с пластинки вместе со слоем адсорбента [427]. В настоящее время этот метод довольно широко применяется для разделения липидов.

Преимущества бумаги из стеклянных волокон как носителя адсорбента в хроматографии липидов состоят в большой чувствительности проявления, устойчивости к высокой температуре и агрессивным веществам, в быстроте анализа, а также в возможности проведения количественных измерений. Высокая цена стеклянной бумаги и недостаточная механическая прочность несколько ограничивают ее применение.

Тонкослойная хроматография, как уже упоминалось, обладает многими преимуществами по сравнению с другими видами адсорбционной хроматографии. Изменяя в широких пределах свойства применяемого адсорбента, исследователь получает возможность анализировать смеси липидов различного состава и происхождения. Вследствие большой скорости движения растворителя по пластинке тонкослойная хроматография является самым быстрым из всех видов адсорбционной хроматографии; в отдельных случаях разделение смеси и универсальное разделение липидов занимают не более 7 мин. [777], что исключает разрушение липидов в процессе анализа. Как отмечалось выше, высокая чувствительность цветных реакций (< 0,1 мкг) позволяет работать в ультрамикроаналитическом масштабе, благодаря чему эффективность и четкость разделения малых количеств многокомпонентных смесей приближаются к соответствующим показателям га- <\br> зо-жидкостной хроматографии. Денситометрия отдельных зон после разделения дает возможность быстро получать количественные результаты с удовлетворительной точностью. Фракционирование на пластинках широко используется для выделения липидов в препаративном масштабе (0,5 г и более) и не уступает в этом отношении разделению на колонке. Параллельный адсорбционно-хроматографический анализ одной и той же смеси липидов на препаративной пластинке и на колонке дал аналогичные качественные и количественные результаты [106, 121].

Особенно эффективным является сочетание тонкослойной хроматографии с другими видами анализа (см. табл. 1). Так, при хроматографии на колонке разделение на пластинках успешно применяли для контроля состава липидов во фракциях элюата [833]. Наоборот, закономерности тонкослойного разделения можно широко использовать при осуществлении анализа на колонке. Распределительную хроматографию нередко проводят на той же самой пластинке до или после адсорбционного разделения, что позволяет фракционировать отдельные классы липидов по длине цепи входящих в их состав алифатических остатков [514, 533, 537, 554, 555, 679]. Тонкослойную хроматографию часто используют для очистки липидов отдельных классов [779, 973].

Наряду с очевидными достоинствами тонкослойной хроматографии, как и всякому другому методу, свойственны определенные ограничения. Скорость миграции липидов и порядок их расположения на пластинке в большой степени зависят от количества и сорта адсорбента, способа нанесения адсорбента, активации и охлаждения пластинки, насыщения камеры парами растворителя и количества пластинок в камере, длительности выдерживания пластинок в парах растворителя до разделения и температуры разделения. Поэтому для достоверной идентификации рядом с исследуемой пробой следует наносить растворы «свидетелей». Препаративное разделение липидов на пластинке обычно менее эффективно, чем аналитическое.

Глава 2. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ΧΡΟΜΑΤΟΓΡΑФИЯ С ПОЛЯРНОЙ НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗОЙ

Придерживаясь исторической последовательности, мы рассмотрим вначале системы, где неподвижная фаза более полярна, чем протекающий растворитель, хотя в настоящее время эти виды хроматографии применяются в области липидов значительно реже обращенно-фазовых систем.

В 1948 г. Рамсай и Паттерсон предложили использовать силикагель в качестве носителя для распределительной хроматографии <\br> жирных кислот. Этот метод был стандартизирован с С¹⁴-кислотами и неоднократно применялся для разделения липидов. Силикагель с этой целью суспендируют в нижней фазе системы и под давлением заполняют колонку. Пробу (3,3—3,8 мг липидов на 1 г носителя) растворяют в верхней фазе и вносят в колонку. Растворитель (верхнюю фазу) пропускают со скоростью 0,6—1,2 мл/мин [186, 253, 274, 570, 649, 650, 754, 809, 1013]. Кислоты разделяли в системах ¹: фурфуриловый спирт : 2-аминопиридин = 1 : 1/гексан, 0,25 н. раствор NН₄ОН в СН₃ОН/изооктан, 0,2 н. раствор NН₄ОН в смеси метилового эфира этиленгликоля и воды 9 : 1/гексан, 0,3 н. раствор NaOH в СН₃ОН/циклогексан. Таким образом, жирные кислоты двигались по колонке в виде солей [274]. Для разделения оксикислот использовали системы: 0,1 н. раствор NН₄ОН в 95% СН₃ОН/петролейный эфир или СН₃ОН : гексан : ацетон = 2 : 10 : 1, а для дикарбоновых кислот — продуктов окислительного расщепления липидов по двойным связям — системы 0,2 н. раствор NН₄ОН в смеси метилового эфира этиленгликоля и воды 9 : 1/смесь гексана и дибутилового эфира 1 : 1, 1 М раствор цитрата натрия, рН 5,4/CHСl₃-бутанол или СН₃ОН : вода : гексан : ацетон = 7,7 : 1,9 : 77 : 34 [173, 188, 241]. Продукты окисления триглицеридов смесью KMnO₄-КЈО₄ разделяли в системе 90%-ный этанол : петролейный эфир. Сложные эфиры кислот фракционировали в системах: нитрометан : петролейный эфир или 2-феноксиэтанол : гептан [254, 1008]. Время анализа на колонках с силикагелем достигало 20 час. Для количественного определения отдельные фракции элюата титровали 0,05 н. раствором NaOН с фенолфталеином или феноловым красным. В элюате содержалось 95—105% исходных липидов. Силикагель можно пропитать индикатором до разделения; в этом случае кислоты мигрируют в виде окрашенных полос. Производные жирных кислот образуют окрашенные зоны на колонке и при отсутствии индикаторов [1013].

Липиды выходили из колонки в порядке возрастания полярности. «Четные» насыщенные одно- и двухосновные кислоты с m = 10—22 хорошо разделялись между собой; для разделения дикарбоновых кислот с m = 6—10 было достаточно различия на СН₂-группу. Рицинолевая и диоксистеариновая кислоты отделялись друг от друга и от остальных кислот [173, 188]. Продукты окисления глицеридов делились на фракции SSS + SSAz и SAzAz + AzAzAz, где S и Az — ацилы насыщенных кислот и азелаиновой кислоты (стр. 170) [1008]. В ряду n-фенилазофенациловых эфиров насыщенных кислот с m = 2—18 и 2,4-динитрофенилгидразонов (2,4-ДНФГ) этих эфиров полностью разделялись гомологи, различающиеся на СН₂-группу. На колонке, приготовленной по методу Рамсая, было достигнуто фракционирование гомологического ряда 2,4-ДНФГ алифатических альдегидов с m = 2—18

¹ Неподвижная фаза/подвижная фаза. <\br> [254]. Согласно основному уравнению Мартина для распределительной хроматографии, логарифм удерживаемого объема Vᵣ этих соединений в колонке находился в линейной зависимости от длины цепи. Эта закономерность была использована для идентификации липидов [252].

ОСОБЕННОСТИ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ЛИПИДОВ

Выше рассматривалась хроматография липидов в обычных распределительных системах, где неподвижной является более полярная фаза системы. Между тем для эффективного распределительно-хроматографического разделения в качестве неподвижной фазы желательно использовать такое вещество, в котором все анализируемые компоненты имеют более высокую растворимость; в ходе хроматографического процесса эти соединения медленно элюируются большим объемом подвижной фазы, где они растворимы в меньшей степени. Липиды с m > 10 в воде малорастворимы, но отличаются высокой растворимостью в неполярных веществах. Последняя определяется взаимодействием между алифатическими цепями липидов и жидкой фазы в результате возникновения сил Ван-дер-Ваальса, значение которых возрастает с увеличением длины цепи и снижается при появлении двойных связей в молекуле. Транс-двойные связи в меньшей степени влияют на силы Ван-дер-Ваальса по сравнению с цис-связями, сильно сокращающими эффективную длину молекулы, что позволяет разделить геометрические изомеры. Появление двойной связи в цепи заметно увеличивает растворимость липидов в полярной фазе, благодаря возникновению дипольных взаимодействий (см. также стр. 77).

Таким образом, для разделения липидов лучше применять системы, в которых неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная. Эти системы, в которых липиды располагаются на хроматограмме в порядке, обратном приведенному выше (стр. 24), называются «обращенно-фазовыми» системами. Данный термин отражает историческое развитие хроматографии, поскольку системы с «нормальным» соотношением полярности отдельных фаз были разработаны раньше, чем обращенно-фазовая хроматография, впервые использованная Болдингом в 1948 г. для разделения метиловых эфиров жирных кислот [111], а затем развитая в работах Ховарда и Мартина [402], Кауфмана [501], Иноуэ [415], Шленка [852], Ганстоуна [326], Бьюкенена [156] и других исследователей.

Большую роль в разработке современной обращенно-фазовой хроматографии сыграл созданный ранее нехроматографический метод противоточного распределения, основанный на непрерывном автоматическом фракционировании смеси липидов в подвижной двухфазной системе растворителей. После уравновеши- <\br> вания концентраций разделяемых веществ в верхней и нижней фазах первой пробирки автомата верхняя фаза передается во вторую пробирку, содержащую только нижнюю фазу; там снова достигается уравновешивание концентраций, и этот процесс повторяется еще многократно. Вследствие разной величины коэффициента распределения α отдельных компонентов, в противоточной системе они разделяются на фракции различной полярности. Содержание вещества во фракциях описывается отдельными членами разложения бинома Ньютона {[1/(α + 1)] + [α/(α + 1)]}ⁿ, а концентрация в r-й пробирке после n переносов Tₙ,ᵣ = = {n!/[r!(n—r)!]} [1/(α + 1)]ⁿ × αʳ [689].

Разделение в обращенно-фазовых распределительных системах, как и в противоточных, происходит согласно величине α, но отличается меньшей величиной требуемой пробы и большей эффективностью. Метод распределительной хроматографии, который может применяться в виде хроматографии на бумаге, на колонке и в тонком слое, незаменим для фракционирования полиненасыщенных триглицеридов с е > 6, поскольку использование адсорбционной тонкослойной хроматографии комплексов с ионами Ag⁺ не обеспечивает достаточной четкости разделения этих глицеридов. Величина α в обращенно-фазовой системе определяется полярностью веществ, зависящей в пределах данного класса от числа «эффективных метиленовых групп» алифатического радикала, соединенных между собой простыми σ-связями. Другими словами, появление двойной связи в ацильном остатке (на достаточном удалении от концов цепи) и укорочение алифатического радикала на две СН₂-группы обычно в одинаковой степени увеличивают полярность липида, которую можно выразить константой полярности К = 100^(m—2e) или предложенным позднее «числом распределения» РN = m — 2е. Величины К и РN можно вычислить для каждого вида триглицерида. Триглицериды одинаковой полярности равны по значению α и в совокупности образуют «группу полярности», дающую одну зону смешанного состава при обращенно-фазовом разделении. Глицериды группы полярности с наименьшим значением PN элюируются из обращенно-фазовой системы в первую очередь, а с наибольшим — в последнюю. Поскольку положение двойных связей не влияет на α, можно, исходя из видового состава кислот в отдельных видах триглицеридов, предсказать хроматографическое поведение последних. Вычисленная величина PN = m — 2е для данной группы полярности должна равняться значению РN, найденному из жирнокислотного состава этой группы после ее элюирования: PN = Σ[(PN)₁ × p₁ + (PN)₂ × p₂ + ... + (PN)ₙ × pₙ]/100, где p₁, p₂, ... pₙ — содержание жирных кислот в триглицеридах данной группы полярности в мол. %. Величины (PN)₁, (PN)₂, ... (PN)ₙ для отдельных видов кислот были равны m — 2е. Вычисленные и найденные величины РN триглицеридов масла эфедры почти полностью совпадали [635].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Для экспериментального определения значения α жирных кислот в системе водный ацетон : парафиновое масло 2 мг кислоты растворяли в 0,5 мл неполярной фазы, смешивали с 0,5 г носителя (кизельгура) и прибавляли 5 мл водного ацетона. Систему уравновешивали несколько минут при 35°, центрифугировали и пробы верхней фазы по 2 мл оттитровывали А мл 0,001 н. КОН в СН₃ОН. К остатку прибавляли 5 мл 95% ацетона, который полностью элюирует кислоты из неполярной фазы, и пробы по 2 мл титровали Р мл щелочи. Величину α (соотношение концентраций кислоты в подвижной и неподвижной фазах) вычисляли по формуле α = AV/(6P — А), где V — объем неполярной фазы. Точность определения (Т в %), которую находили по уравнению Т = 100NE (2A+3P)/W, где N — нормальность щелочи, W и Е — соответственно вес и эквивалент кислоты, обычно составляла ± 5%. Откладывая в системе координат величину lg 100 α для различных жирных кислот в зависимости от концентрации ацетона в растворителе, получали семейство параллельных прямых. Для кислот одинаковой полярности эти прямые совпадали между собой. Оптимальные условия разделения обеспечиваются при такой концентрации растворителя, когда α данной кислоты равен 0,16, а значение α следующего высшего гомолога 0,08 [324].

Для математического описания обращенно-фазовой системы разделения пальмитиновой и стеариновой кислот рассматривалась колонка, содержащая р тарелок. Считая, что каждая тарелка действует подобно делительной воронке в процессе противоточного распределения, количество растворенного вещества Тр+1,ₙ определяли по формуле, приведенной на стр. 47. После р переносов фронт растворителя достигает последней р-й тарелки, а затем известное количество растворенного вещества Еₐ₊₁ выходит из колонки с (а + 1)-й фракцией элюата (каждая фракция элюата имеет тот же объем, что и объем подвижной фазы в теоретической тарелке обращенно-фазовой хроматографической системы):

Eₐ₊₁ = [(p+a)! / (p! a!)] × [(α')ᵃ / (α' + 1)ᵖ⁺ᵃ⁺¹] = α'/(α' + 1) × Eₐ, (1)

где: а — номер фракции элюата; Eₐ — количество растворенного вещества в элюате а; α' — коэффициент распределения жирной кислоты в условиях хроматографического разделения.

Фракция растворенного вещества в элюате достигает максимума (Емакс) в элюате ƒ, когда α' = р/а. Отношение а/р эквивалентно общему объема элюата f × v, который необходим для достижения максимума, выраженному в объемах подвижной фазы колонки Vₘ:

f/α' = a/p = f × v/Vₘ (2) <\br> Используя уравнение (2), а также величины положения и высоты каждого пика на экспериментальной выходной кривой, полученной с применением 67%-ного ацетона в качестве растворителя, вычисляли фактический коэффициент распределения α' для пальмитиновой (0,50) и стеариновой кислот (0,22). Разделив величины α' на соотношение между жидкими фазами в колонке (2,5), получали истинные значения коэффициентов распределения α, равные соответственно 0,20 и 0,09, что согласуется с найденными экспериментально величинами 0,16 и 0,08.

Из уравнений (1) и (2) можно получить уравнение (3)

p = 2π (1 + α') (Eмакс × Vₘ / α'v)² = 2π/(1 + c) (Eмакс)², (3)

где: v — объем каждого элюата; с — объем подвижной фазы в обращенно-фазовой колонке, выраженный числом фракций элюата в опыте (с = Vₘ/v). Уравнение (3) позволяет вычислить число тарелок р для каждой кислоты по положению и высоте максимума элюата на выходной кривой. Для пальмитиновой и стеариновой кислот величина р равнялась соответственно 70 и 114. Подставляя вычисленные значения α' и р в уравнение (1), построили теоретическую выходную кривую, которая удовлетворительно совпадала с кривой, полученной по экспериментальным данным.

Процент загрязнения каждого пика веществом соседнего пика (η) определяли по уравнению нормальной кривой ошибки:

η = 100 (0,5 - Aᵥ √(Vₐᵥ / (√B - √A)²)),

где: Aᵥ {x} — площадь нормальной кривой ошибки для аргумента x; А = 1 + 1/αₐ и В = 1 + 1/αᵥ. Таким образом, для достижения заданной чистоты фракции (η ≤ 0,2%) при отделении кислоты с α' = 0,50 в обращенно-фазовой системе с числом теоретических тарелок р = 100 от другой кислоты значение α' последней не должно превышать 0,23. Можно видеть, что использованная система обеспечивает практически полное разделение пальмитиновой (α' = 0,50) и стеариновой (α' = 0,22) кислот [324].

Математическая трактовка системы обращенно-фазовой хроматографии позволяет выбрать состав растворителя и оптимальные условия эффективности колонки для разделения смеси липидов.

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВАЯ КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В 1950 г. Ховард и Мартин предложили использовать гидрофобный, обработанный диметилдихлорсиланом Целит в качестве носителя неподвижной фазы. Целит смешивали с очищенным на окиси алюминия парафиновым маслом (1 : 0,8, 1 : 1 или 1 : 1,4 по весу), суспендировали в подвижной фазе и вносили в колонку. Парафиновое масло можно заменить силиконовым маслом (тем- <\br> пература кипения 195—230°/0,25 мм), ацетилированным касторовым маслом, изооктаном, гептаном или циклогексаном [103, 290, 295, 402, 802, 847, 949]. Порошок каучука после набухания в бензоле, петролейном эфире или ацетоне мог служить одновременно и носителем, и неполярной фазой. К каучуку близок по свойствам порошок полимеризованного с S₂Cl₂ соевого масла («фактис»). По эффективности разделения фактис не уступает Целиту с парафиновым маслом [25, 112, 375, 382, 465]. В отличие от вышеуказанных жидких фаз, которые могут использоваться не более 3—8 раз подряд, полиэтилен после набухания в ацетоне или полиэтилен на Целите могут многократно использоваться для разделения [307, 574, 936]. Применяли также обычную целлюлозу, пропитанную парафиновым маслом, и нейлоновые волокна, на которых 2—6 мкг кислот разделяли смесью ацетона, воды и этанола и отдельные компоненты обнаруживали бромкрезоловым зеленым [336, 673].

Пробу, содержащую 1—10 мг каждого липидного компонента для колонок диаметром 1—2 см или 150—250 мг смеси для колонок большего диаметра, вносят в виде раствора в жидкой фазе — подвижной или неподвижной в зависимости от растворимости данной смеси липидов [708, 876]. Объем вносимого раствора не должен превышать объема одной теоретической тарелки [103]. Скорость пропускания подвижной фазы изменяется в пределах от 4 до 300 мл/час. При меньшей скорости эффективность колонки несколько возрастает [227, 692]. Разделение проводят при постоянной температуре. Ненасыщенные кислоты обычно разделяют при 10° [876], смеси кислот — на колонках с каучуком и полиэтиленом — при 20—25° [112], а колонки с парафиновым маслом термостатируют при 35° [227]. Элюат собирают автоматическим коллектором и содержание липидов во фракциях учитывают гравиметрически или титрованием 0,01 н. КОН в СН₃ОН с бромтимоловым синим [227, 326, 949]. В других случаях для измерения концентрации липидов к элюату добавляют два объема воды и мутность эмульсии пробы и стандарта (S и S₀ соответственно) определяют нефелометром. В пределах от 2 до 20 мкг зависимость lg (S/S₀) от массы липидов была линейной [66]. Содержание глицеридов можно определить и колориметрически с гидроксиламином и ионами Fe³⁺ [103]. Для непрерывной регистрации триглицеридов на выходе колонки применили дифференциальный рефрактометр; площадь пиков хроматограммы не была пропорциональна массе [375]. В элюате обнаруживали 97—103% исходных липидов [465]. Чистота выделенных препаратов достигла 99—100% [852].

В качестве растворителей при разделении липидов обычно применяли водные растворы ацетона, насыщенные неполярной фазой. Для элюирования насыщенных кислот использовали следующие концентрации ацетона (указаны число атомов С и концентрации в %) C₈30, C₈40, C₁₀50, C₁₂53, C₁₄58—60, C₁₆ 65—67, C₁₈ 70—73, C₂₀ 75—78, C₂₂80—83, C₂₄ 85—90 [402]. Растворитель <\br> для разделения триглицеридов кокосового масла состоял из смеси ацетона, гептана и воды [103], а для глицеридов масла льна представлял собой 95%-ный ацетон [375]. Повышение концентрации воды увеличивает Vᵣ и эффективность колонки [103]. Для разделения кислот и их производных применяли также смесь СН₃ОН с ацетоном 3 : 1 [112], 65—100% CH₃OH [949], 40—70% этанола [574], смесь ацетонитрила с СН₃ОН 17 : 3 [802] и смесь CH₃COOH, НСООН и воды = 2 : 2 : 1 [336]. Кислоты и их метиловые эфиры разделяли в системе ацетонитрил : вода = 3 : 1 [295]. Применение водного этанола для фракционирования 2-моно- и 1,2(2,3)-диглицеридов приводило к их превращению в устойчивые 1(3)-моно- и 1,3-ди-изомеры; в водном ацетоне миграцию ацилов не наблюдали [847].

Насыщенные жирные кислоты, отличающиеся друг от друга на СН₂-группу, хорошо разделяются и выходят из колонки в порядке уменьшения константы К [402]. Разветвленная лактобацилловая кислота (11, 12-метиленоктадекановая кислота) по величине Rƒ совпадала со стеариновой кислотой [382]. Ненасыщенные кислоты разделяются между собой, но не отделяются от насыщенных кислот с тем же значением К [326].

Для количественного анализа смеси часть кислот гидрируют 24 час. с 5—20% Pd на угле; продукты гидрирования (насыщенные кислоты) хорошо разделяются на колонке [466, 651, 712, 789]. Другую часть кислот расщепляют по двойным связям 5%-ным раствором КМnО₄, гидроксилируют надмуравьиной кислотой или подвергают озонолизу в метилацетате при —40° в течение 5 мин. [71, 651]. Результаты одновременного определения исходных кислот и продуктов их гидрирования и окисления позволяют достаточно точно установить состав данной смеси. Так, олеиновая и петрозелиновая кислоты не разделяются в обращенно-фазовой системе, а возникшие при их окислении пеларгоновая и лауриновая кислоты в этой системе делятся хорошо [227].

Окси-, эпокси- и кетокислоты благодаря высокой полярности хорошо отделяются от обычных кислот и могут разделяться между собой как в незамещенном виде, так и в виде ацетатов на колонках с ацетилированным касторовым маслом. Оксистеариновая кислота по величине Vᵣ совпадала с лауриновой кислотой [326]. Хлорфенациловые эфиры разделялись подобно незамещенным кислотам [574]. На колонках с парафиновым маслом разделялись моно-, ди- и триглицериды, а также триглицериды, различающиеся между собой на четыре СН₂-группы или на две двойные связи; глицериды, отличающиеся на две СН₂-группы или на двойную связь, разделялись не полностью [103]. На колонке фактиса метиловые эфиры, эфиры холестерина и триглицериды разделялись на фракции с одинаковой К; величины lg Vᵣ находились в линейной зависимости от числа атомов углерода в этих соединениях [375].

ТОНКОСЛОЙНАЯ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Хроматография в тонком слое адсорбента, закрепленном на стеклянных пластинках, получила сейчас весьма широкое распространение как метод адсорбционного разделения липидов (стр. 37). Одновременно пластинки с силикагелем используются в хроматографии липидов в качестве носителя неполярной фазы.

Для разделения с обращенной фазой активированные пластинки обрабатывали 10—15%-ным ундеканом в петролейном эфире, 10%-ным додеканом в гексане [9, 524, 533, 537], 5%-ным тетрадеканом [513, 514, 527, 535, 538, 555], 0,5 и 10%-ным парафиновым маслом [536, 554, 556, 721, 723] или 5%-ным силиконовым маслом в эфире [679]. Тяжелые масла не могут быть удалены с пластинки нагреванием. Липиды разделяют и отдельные зоны обнаруживают методами, принятыми в тонкослойной хроматографии [6].

Распределительная хроматография на пластинках по своим результатам в общем не отличается от других видов обращенно-фазовой хроматографии; однако возможность работы в ультрамикромасштабе позволяет в ряде случаев достичь более высокой скорости и эффективности разделения. Пластинки часто используют для двумерной хроматографии; липиды разделяют в одном направлении на классы без нанесения неполярной фазы, а затем часть пластинки пропитывают углеводородами и липиды каждого класса разделяют на фракции различной полярности [9].

Жирные кислоты C₁₀—₁₈ (0,5—20 мкг) разделяли смесью CH₃COOH : CH₃CN (1 : 1) или 85%-ной СН₃СООН в течение часа. Для разделения кислот с одинаковой константой К в полярную фазу прибавляли 0,5% брома: присоединение брома по двойным связям ненасыщенных кислот значительно повышало их подвижность [524]. Липиды одинаковой полярности можно разделить и после гидрирования: кислоты на пластинке опрыскивают 1—2%-ной суспензией палладия, гидрируют Н₂ в эксикаторе, промывают 5%-ной НСІ и разделяют после пропитывания пластинки ундеканом [554]. Насыщенные кислоты с m = 18—34 разделяли в системе изопропанол : этанол : СН₃СООН : вода (8 : 3 : 4 : 1, 3)/тетрадекан при 42° и определяли количественно с ацетатом Сu (стр. 58) [514]. С 80%-ной СН₃СООН разделили C₁₃—₂₅-2-метил-4-кетокислоты и C₁₂—₂₂-оксикислоты [527]. Растворителями для C₁₂—₃₄-жирных спиртов служили 85%-ная СН₃СООН или 90%-ный ацетон [555].

Метиловые эфиры кислот разделяли в смеси СН₃COOH : CH₃CN : вода (2 : 14 : 5) или ацетон : CH₃CN (7 : 10) [9]. Насыщенные и ненасыщенные эфиры одинаковой полярности разделяли при 4—6° или в присутствии надуксусной кислоты. Метиловые и этиловые эфиры разделяли по числу двойных связей на непропитанной пластинке кремнекислоты четырехкратным пропусканием смеси петролейного эфира с бензолом (4 : 1); затем пластин- <\br> ку пропитывали парафиновым маслом и разделяли полученные фракции по числу атомов С. Метиловые эфиры отделялись от этиловых эфиров тех же кислот [554].

Триглицериды разделяли смесью ацетон : CH₃CN (4 : 1) или уксусной кислотой; за 35—100 мин. масло льна делилось на девять, а масло сои — на шесть фракций. Разделение триглицеридов одинаковой полярности обычно не происходило [721]. Однако подвижность глицеридов с одной и той же величиной К не всегда абсолютно одинакова. Многократное проявление пластинок одним растворителем с подсушиванием после каждого проявления приводит к разделению 1—2 мкг компонентов одинаковой полярности. Так, ЛеЛеЛе отделяется от ЛаЛаЛа, ЛЛЛ — от МММ, ООЛ — от МОО, ООЛ — от ППЛ, ООО — от ПОО, ООО — от ППП, ППО — от ППП и т. д. При трехкратном проявлении удалось разделить смесь ООО, ПОО, ППО и ППП, а также отделить глицериды олеиновой кислоты от соответствующих глицеридов элаидиновой кислоты. Масло льна разделяется при этом уже не на 9, а на 15 фракций, масло сои — на 13, арахиса — на 12 и т. д. [513]. Таким образом, двойная связь триглицеридов компенсируется не точно 2 СН₂-группами, как считали ранее, а приблизительно 2,4 группы; с увеличением различия в числе двойных связей между липидами одинаковой полярности Rƒ более ненасыщенного компонента возрастает. Снижение молекулярного веса неподвижной фазы, неблагоприятное соотношение между компонентами пробы и повышение ее веса отрицательно сказываются на эффективности разделения глицеридов [558]. Раствор 0,5%-ного брома в смеси пропионовой кислоты : CH₃CN = 3 : 2 вполне пригоден для разделения триглицеридов одинаковой полярности; применяют также описанный выше метод гидрирования [538].

ПОЛУЧЕНИЕ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ

Для разделения пригодны такие сорта хроматографической бумаги, которые обладают достаточной прочностью во время промывания в воде. Этим требованиям отвечают бумаги Ватман № 1, 3, 4 [81, 275, 310, 584, 854, 880, 905], Тойо № 2, и Машери Нагель № 214 [372, 978], Шлейхер и Шюлль № 595, 598, 2040, 2043 b и 2043 b Mgl [232, 302, 430, 460, 512, 530, 548]. Применяют также бумагу Б или М Ленинградской фабрики № 2 или № 69 «Гознак»; эти сорта менее удовлетворительны, чем перечисленные выше [2, 4, 13, 14, 28, 29, 32, 35]. Бумагу очищают промыванием 0,5—10%-ной НСІ, 3%-ной HNO₃, 20%-ной НСООН, 95%-ной СН₃СООН, водным ацетоном, этанолом, эфиром или бензолом, отмывают водой, сушат при 90—120° и сохраняют над СаСl₂ [3, 216, 534].

В ранних работах для придания бумаге гидрофобных свойств целлюлозу пытались превратить в ее эфиры. Для получения октадецилоксиметилового эфира бумагу обрабатывали 3 часа при <\br> 90° 0,5%-ным хлоридом октадецилоксиметилпиридиния в толуоле [80]. Гидроксаматы кислот разделяли на бумаге, ацетилированной (СН₃СО)₂О в бензоле при 70° или пальмитилированной тем же способом [725, 726]. Эфиры целлюлозы не получили распространения в хроматографии, поскольку гидрофобную бумагу легче получить пропитыванием обычной бумаги высококипящими липофильными веществами. Для разделения C₁₀—₂₀-жирных кислот бумагу обычно пропитывают ундеканом, насыщенным подвижной фазой, отжимают 10—30 мин. фильтровальной бумагой под грузом и выдерживают 10 мин. на воздухе [373, 416, 542—545, 625, 757, 762, 975]. Оптимальная концентрация ундекана равна 100—250 мг/г [1012]. После разделения содержание ундекана у фронта вдвое превышает исходную величину, а на старте падает почти до нуля. Стекание ундекана можно ослабить путем понижения его исходной концентрации, применения гидрофобной бумаги в качестве носителя и горизонтального проявления хроматограммы. Если не пропитывать начальный участок полосы, то скорость подвижной фазы заметно возрастает. Ундекан можно удалить с бумаги при 80—95° [542].

Как правило, с уменьшением полярности разделяемых липидов приходится использовать неподвижные фазы с более высоким молекулярным весом и пониженной полярностью. Благодаря меньшей растворимости таких веществ в подвижной фазе эффективность разделения и предельный вес пробы возрастают; однако удаление фазы перед обнаружением липидов становится невозможным. Для разделения насыщенных и ненасыщенных кислот и метиловых эфиров применяли 10%-ный тетрадекан в петролейном эфире, 5—10%-ное вазелиновое масло в бензоле, эфире или ССl₄ или 10%-ную смесь вазелинового и парафинового масла в бензоле [11, 30]. На бумаге, пропитанной 5—15%-ным парафиновым маслом (d = 0,895—0,890) в бензоле, эфире или петролейном эфире, разделяли насыщенные кислоты, начиная от C₂₀ и выше, а также триглицериды [68, 86, 169, 281, 563, 786, 965, 996]. Пропитывание обычно проводили протягиванием полосы через раствор или восходящим и горизонтальным насасыванием. Неполярная фаза составляла 10—15% от веса бумаги [889].

Бумага, пропитанная 10—30%-ным латексом каучука, после набухания в ацетоне могла служить для разделения кислот и метиловых эфиров в системах СН₃ОН — ацетон (1 : 1) и 80% СН₃ОН — изооктан. Применяли также смесь 0,5%-ного каучука и 30%-ного нафталина в бензоле (4 : 1) [26, 111]. С тетралином и декалином разделяли 2,4-ДНФГ n-бромфенациловых эфиров («бромазоны»), 2,4-ДНФГ, ацетол- и ацетоксимеркуриметокси-(АОММО)-производные ненасыщенных метиловых эфиров и глицеридов, а также жирные кислоты [413, 414, 417—421, 829, 857]. Растительные масла применяли для пропитывания только в ранних работах; лишь касторовое масло при разделении оксистеариновых кислот превосходит углеводородные фазы по <\br> эффективности [394, 763]. Из кремнийорганических соединений применяют силиконовое масло (1—5%-ный Родорсил 240, Доу Корнинг 200, Тип-2 в циклогексане или эфире), малорастворимое в подвижных фазах [844].

Концентрация неподвижной фазы в системе определяет длительность опыта: при содержании ундекана 150 мг/г бумаги анализ кислот занимает 1—2 час., а при 600—700 мг/г движение полярной фазы прекращается. Если содержится 0,1% фазы, то насыщенные кислоты до C₂₆ можно разделить без нагревания камеры [193, 541]. При снижении содержания фазы разности значений Rƒ (ΔRƒ) возрастают; следовательно, обращенно-фазовая система является истинно распределительной системой, где нет адсорбции. Для воспроизводимости Rƒ содержание фазы по длине полосы должно быть равномерным [541].

Если содержание отдельных липидов в смеси мало, их необходимо препаративно выделить до разделения. Высшие C₂₀—₃₆-кислоты из воска концентрировали кристаллизацией с мочевиной. Полиненасыщенные кислоты из рыбьих жиров фракционировали в виде Li-солей [732]. Жирные кислоты из древесины отделяли хроматографией от смоляных кислот [519]. Спирты на бумаге, пропитанной КОН, мигрировали вместе с фронтом толуола, а кислоты оставались на старте [529].

На стартовую линию в 2—6 см от края наносят по 10—100 мкг каждого компонента или 100—500 мкг смеси липидов в растворе хлороформа, спирта, эфира, ацетона или бензола в виде полосы или точек [428]. Насыщенные кислоты с m = 20—30 для предотвращения кристаллизации следует до разделения выдержать при 80—90°. Ненасыщенные кислоты с сопряженными связями, во избежание полимеризации, следует наносить сразу перед разделением. Ненасыщенные кислоты с изолированными двойными связями также разрушаются на бумаге при отсутствии растворителя [552].

Полосу выдерживают в парах подвижной фазы и проявляют нисходящим, восходящим, горизонтальным или круговым способом; последний метод обеспечивает препаративное разделение липидов (более 10 мг) [92, 522, 546, 604]. Подвижная фаза обычно продвигается от старта на 20—35 см. Эффективность разделения возрастает, если верхней части полосы придать клиновидную форму по Маттиасу. Для быстрого анализа кислот применяли восходящую хроматографию в пробирках [503].

ПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ И ТЕМПЕРАТУРА ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОГО РАЗДЕЛЕНИЯ

Подвижная фаза должна обладать высокой полярностью и низкой летучестью, хорошо растворять липиды пробы и мало смешиваться с неполярной фазой. С увеличением полярности фазы ΔRƒ возрастает, а растворимость липидов снижается. Если умень- <\br> шить количество воды, то длительность и эффективность разделения снизятся. Подвижные фазы непременно содержат неподвижную фазу системы (80—90% от насыщения).

Уксусная кислота почти всегда присутствует в подвижной фазе. Система 90%-ная СН₃СООН — ундекан разделяет C₁₆—₁₈-насыщенные и ненасыщенные кислоты, циклопентенил-жирные кислоты и жирные спирты. Иногда 90%-ную СН₃СООН используют с парафиновым и вазелиновым маслом. Для C₂₀—₃₄-насыщенных кислот и полиненасыщенных глицеридов применяют 95—100%-ную СН₃СООН, а для C₁₀—₁₄-насыщенных кислот и C₁₀—₁₈-окси-, -эпокси- и кетокислот, роданидов кислот, моноглицеридов и оксимов C₈—₁₈-альдегидов — 50—75%-ную СН₃СООН [74, 516, 521, 528, 532]. Если в пробе содержатся C₁₀—₂₄-жирные кислоты, используют разделение с градиентом концентрации СН₃СООН от 50 до 90%; концентрацию Сₜ в момент времени t вычисляют по формуле Cₜ = C₀e^(-Bt/V), где: C₀ — исходная концентрация кислоты; V — объем камеры смесителя; B — скорость поступления кислоты в камеру [281]. Применение муравьиной кислоты для разделения жирных кислот (98% CH₃COOH : 85% HCOOH : вода = 30 : 10 : 1; 85% CH₃COOH : 88% HCOOH = 1 : 1) увеличивает эффективность разделения и компактность зон [294]. Системы с ацетонитрилом или ацетоном хорошо растворяют нейтральные липиды, увеличивают скорость разделения и ΔRƒ и выдерживают температуру до 45°. Для анализа кислот использовали смеси СH₃COOH : CH₃CN (5 : 7), ацетон : СН₃СООН : вода (8 : 2 : 1), ацетон : СН₃СООН (3 : 1) или 85%-ный ацетон : 90%-ную СН₃СООН (3 : 2) [232, 541, 732], для триглицеридов — ацетон : CH₃CN (4 : 1), ацетон : CH₃OH (9 : 1) [534, 548, 563], для АОММО-производных аллиловых эфиров насыщенных кислот и аллилуретанов высших спиртов, а также оксимов сложных диэфиров диоксиацетона — СН₃СОOH : CH₃CN (3 : 1) [523]. Водные 80—90%-ные растворы ацетона служили для разделения моно- и триглицеридов и жирных кислот [183].

Для разделения «бромазонов» и АОММО-производных ненасыщенных липидов применяли системы, содержащие метанол — CH₃OH : CH₃COOH = 30 : 1; 90% CH₃OH : CH₃COOH (30 : 1); CH₃OH : CH₃COOH (5 : 1); 90% CH₃OH : CH₃COOH (5 : 1); 70% CH₃OH : CH₃COOH (3 : 2) [857]. Насыщенные кислоты с m = 20—36 разделяли в системе метилацетат : СН₃СООН : вода (5 : 20 : 2); 99,5%-ный изопропанол : 96%-ный этанол : СН₃COOH : вода (8 : 2,5 : 4 : 1,25) или СH₃OH : CH₃COОН : вода (5 : 4 : 1). Водный 75—95%-ный СН₃ОН и этанол, 55—65%-ный изопропанол и изопропанол : СН₃ОН : вода (11 : 5 : 4) в настоящее время почти не используют для разделения кислот вследствие низкой величины ΔRƒ и «взаиморастворения», т. е. поглощения зон с малым содержанием липидов более крупными соседними зонами [387]. Смеси СН₃ОН с хлороформом 1 : 3 или с тетрагидрофура- <\br> ном и ССl₄, и смесь СН₃СООН : CHCl₃ (16 : 3) применяли для разделения триглицеридов [334]. 2,4-ДНФГ C₈—₁₈-альдегидов разделяли в системе диметилформамид : формамид (5 : 2)/ углеводороды с температурой кипения 150—180°, а их АОММО-производные — в той же системе с тетралином [525, 526].

Взаимное насыщение фаз и хроматографическое разделение обычно проводят при 20 ± 2°. Подъем температуры увеличивает Rƒ и скорость разделения, но вызывает стекание неполярной фазы. Охлаждение до 17° останавливает разделение насыщенных кислот, растворимость которых (в г на 100 г СН₃СООН) при 20 и 30° равна, соответственно: C₁₂ — 81,8, 297; C₁₄ — 10,2, 51,1; C₁₆ — 2,14, 8,11; C₁₈ — 0,12, 1,68 [541]. Уменьшение растворимости с понижением температуры используют для разделения насыщенных и ненасыщенных кислот одинаковой полярности. Насыщенные кислоты можно осадить до разделения из петролейного эфира при —20° [431]. В системе ацетон : ундекан при —20° на старте остаются насыщенные кислоты от C₁₈ и выше, при —30° — C₁₆ и выше, при —38° — C₁₄ и выше, при —50° — C₁₂ и выше, а кислоты, подвижные при данной температуре, разделяются между собой [541]. После нанесения кислот полосу выдерживали при —30°, а затем проявляли 20 час. в системах: 1) ацетон : пропионовая кислота : вода (4 : 3 : 0,5)/ундекан при —30° или 2) 85% CH₃COOH : 85% НСООН : вода (10 : 10 : 1)/силиконовое масло при —10°. Насыщенные кислоты, начиная с C₁₄, в этих случаях не сдвигались со старта [854, 966]. При двумерной хроматографии в первом направлении применяют систему 2, а во втором — 93% СН₃СООН при 20°. При разделении цис-, транс-изомеров система 1 элюирует олеиновую кислоту, а элаидиновая кислота остается на месте [586, 720]. Для повышения растворимости C₂₀—₂₆-насыщенных кислот температуру в камере приходится поднимать до 30°, для C₂₄—₂₈ — до 45—55°, а для C₂₆—₃₄ — до 55—85° [996].

ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИЙ КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП

Окрашенные производные липидов, например «бромазоны» жирных кислот, можно сразу определить количественно при помощи фотометра [421]. Однако большинство липидов алифатического ряда бесцветно. Для их обнаружения и количественного определения применяют цветные реакции, даваемые карбоксильными и другими функциональными группами.

Жирные кислоты и другие кислые липиды легче всего определить неспецифической реакцией с индикаторами: 0,2—0,4%-ным бромтимоловым синим в спирте, рН 8—8,3, бромфеноловым синим или бромкрезоловым зеленым, 0,05%-ным крезоловым красным и крезолфталеином в 0,8%-ном NaOН, малахитовым зеленым, нильским голубым, тимолфталеином и феноловым красным. С пирогаллоловым красным наименьшее количество липида, которое <\br> можно визуально определить на распределительной хроматограмме z = 15 мкг [190, 429, 602, 603, 605]. Данные титрования кислот 0,005 н. NaOH по бромтимоловому синему после их экстрагирования с бумаги совпадали с результатами роданометрического определения [429, 681].

Обычно жирные кислоты определяют в виде солей тяжелых металлов. Например, после получения радиоактивных солей кобальта-60 количество жирных кислот можно установить с точностью до ± 2,5% [505, 507, 768].

Основной ацетат меди (II) используют чаще других солей. Полосу погружают на 20 мин. в смесь насыщенного ацетата меди и воды (1 : 49), промывают водой, подкисленной СН₃СООН, и обнаруживают бледно-зеленые зоны кислот. Для получения темно-бурой окраски ферроцианида меди применяют 1—1,5%-ный ферроцианид калия (z = 5 мкг). Если этот раствор подкислить, то соли переходят в свободные жирные кислоты. Таким образом, реакцию с ацетатом меди — ферроцианидом калия можно проделать многократно для повышения чувствительности. Под действием 5%-ного FeCl₃ ферроцианид калия дает голубые зоны FeCu[Fe(CN)₆] [541]. В реакции Си-солей, обработанных парами NН₃, с основным 0,03%-ным спиртовым дитиооксамидом (рубеановой кислотой) z = 0,1 мкг меди. Применяя многократное окрашивание, обнаружили C₃₀—₃₄-кислоты воска, способные разделяться только в очень малых количествах. Эту же реакцию дают альд- и кетоксимы [304, 549]. Соли меди можно обнаружить по выделению О₂ и вспениванию с Н₂О₂ и NH₄OH (z = 5—10 мкг). Окраску Си-солей жирных кислот усиливают 0,5%-ный родамин С и анилин : этанол = 1 : 1 [504, 507, 553].

Для определения жирных кислот измеряют площадь пятна Т' и вычисляют количество кислот С' по формуле Т' = klgC' + b, где для олеиновой кислоты k = 182, b = 166, а для линолевой — k = 134, b = 189 [428].

Обычно количественное соотношение зон определяют фотоэлектрическим денситометром. Над 1-миллиметровой целью фотоэлемента протягивают окрашенные хроматограммы или их фотографии и отмечают поглощение света. Площадь пиков на кривой пропорциональна молярной концентрации кислот [35]. Для получения равномерного низкого фона светопоглощения необходимо очистить бумагу (стр. 53) и возможно полнее удалить неподвижную фазу, СН₃СООН (без нагревания) и раствор Си-соли, рН которого не должен превышать 5 [347, 864]. Если нельзя удалить с бумаги неполярную фазу, то кислоты с низкой К не полностью переходят в Си-соли и при расчете надо вводить поправку. Когда светопоглощение между пиками не возвращается к нулю, площадь для каждого компонента находят при помощи вспомогательных линий. Закон Беера соблюдался в пределах от 1 до 60 мкг кислот. Точность определения кислот, содержание которых превышало 2%, достигала ± 3% [865, 866]. Стехиометрию реакции дока- <\br> зали методом полярографии и колориметрии. Ионы меди элюировали 0,06—1 н. раствором H₂SO₄. Линейность высоты ступени на полярограмме от количества меди наблюдалась в диапазоне 1—7 мкг меди на 1 мл. При колориметрии с 0,1 М тетраэтилтиурамдисульфидом или 0,001%-ным дитизоном закон Беера выполнялся от 10 до 30 мкг/мл. Точность обоих методов равна ± 5% [378, 500, 515, 760].

Соли серебра получали за 5—30 мин. в 1%-ном растворе аммиачного AgNO₃, избыток соли отмывали и фиксировали Ag разбавленной НСІ. Для C₂₀—₃₄-кислот раствор нагревали до 55—85°. Соли Ag окрашивали 10 мин. нагреванием до 140—150°, сульфидами NН₃ и Na, сероводородом, фенилгидразином и 0,03—0,5%-ным n-диэтиламинобензилиденроданином [275, 763, 780]. Точность денситометрии C₁₆—₁₈-кислот на МФ-4 с дополнительным проектирующим объективом была достаточно высокой, тогда как фотографии хроматограммы C₂₄—₃₄-кислот сканировали на приборе МФ-2 с неудовлетворительным результатом. После озоления бумаги точность анализа 0,2—2 мкмолей Ag с дитизоном составляла ± 5%. Жирные кислоты можно также определить радиометрически с Ag¹¹⁰ [432].

Соли ртути — 0,1%-ный ацетат Hg (II) и 0,5%-ный раствор CH₃COOH, 15 мин. — оказались устойчивее к гидролизу, чем соли меди, а фон бумаги был светлее. Соли окрашивали 0,2%-ным S-дифенилкарбазоном, окраску элюировали СН₃ОН с толуолом (1 : 1) и измеряли при 530 ммк. Радиометрическое определение проводили с Hg²⁰³ [432, 965]. Свинцовые соли (1—3%-ный ацетат Pb, pH 5,3—5,7, 20—40°) окрашивали H₂S, 1,5%-ным сульфидом NH₃ или раствором 2 г Na₂S, 100 г NH₄NO₃ и 30 мл Н₂О₂ в 1 л (z = 0,5 мкг кислоты). Не обнаруживаются Pb 2-оксикислоты. После экстракции с бумаги 10%-ным раствором HNO₃ свинец определяли с дитизоном при 520 ммк. Благодаря тщательной очистке бумаги, реактивов и кварцевой посуды от следов тяжелых металлов, достигалась удовлетворительная точность измерения [2]. Реакция кислот с нитратом Bi (при 70—80°) и сульфидом NН₄ по величине z не уступала реакции с Pb-солями [880].

ДРУГИЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

Вицинальные ОН-группы моноглицеридов и полиоксистеариновых кислот обнаруживали реакцией Шиффа: 1%-ным периодатом, SO₂ и n-розанилином (z = 10—20 мкг) или раствором 35% буры, 0,8%-ного КЈ, 0,9%-ного Н₃ВО₃ и 3% крахмала (липиды давали белые пятна на синем фоне). Для радиометрического определения моно- и диглицериды ацетилировали (C¹⁴H₃CO)₂O [199, 681, 994].

Ненасыщенные липиды обнаруживали путем реакций окисления или присоединения по двойным связям. При окислении <\br> в 0,1—1%-ном щелочном КМnО₄ ненасыщенные липиды за 1,5—5 мин. образуют бурые пятна МnO₂; кислый КМnО₄ дает белые пятна на розовом фоне [70]. Пятна, полученные после обработки щелочным КМnО₄, денситометрировали в отраженном свете; содержание жирных кислот, глицеридов и эфиров стеринов определяли по высоте или площади пиков с точностью 3—5%. Ненасыщенные кислоты окисляли 1%-ным NaJO₄ и 1%-ным КМnО₄ и сканировали на микрофотометре [918]. При озонировании полосу обрабатывали NaHSO₃, затем 20—60 мин. озоном и, наконец, реактивом Шиффа [283].

Ненасыщенные и в меньшей степени насыщенные липиды давали в парах иода пятна, коричневые или желтые при разном рН. Хроматограмму сканировали с синим фильтром. Присоединенный по двойным связям иод обнаруживали с 0,5—1%-ным крахмалом в виде синих пятен на светлом фоне (z = 3—4 мкг) или с 0,2 н. AgNO₃ и фотографическим проявителем эйкобромом [89]. Бром и родан можно частично отщепить от двойных связей в парах NH₃; Вr обнаруживали с феноловым красным и хлорамином (z = 0,1 мкг), а CNS⁻ — с солями Fe³⁺ [75]. Для радиометрического микроопределения массы и иодного числа липидов использовали растворы и пары J¹³¹Br [43, 506].

Для присоединения по двойным связям солей и эфиров жирных кислот применяют также ацетат Hg (II) в СН₃ОН:

—CH=CH— → —CH(OCH₃)—CH(HgOCOCH₃)—

АОММО-Производные эфиров синтезируют до разделения; производные солей получают на бумаге в 2%-ном ацетате Hg²⁺, содержащем 1%-ную СН₃СООН, только после разделения. Связанную Hg обнаруживают 0,1—0,2%-ным спиртовым S-дифенилкарбазоном и парами NH₃; H₂S окрашивает Hg после ее вытеснения из производных парами HCl (z = 1 мкг линолената) [547]. Для количественного анализа применяют колориметрическое определение ртути в виде ее комплексов с S-дифенилкарбазоном или дитизоном, а также полярографию и денситометрию [546]. Кауфман использовал АОММО-производные для определения насыщенных и ненасыщенных кислот с одинаковой К, например пальмитиновой и олеиновой. Параллельные хроматограммы окрашивали ацетатами Сu или Hg. Поскольку СООН-группа эквивалентна 1/2 атома Си и Hg, а двойная связь — одному атому Hg, С' (содержание насыщенной кислоты в %) вычисляли по формулам:

C' = [(2e+1—x)/2e] × 100; x = F_Hg^Cu : F_Cu^Hg = F_Hg^пр : F_Hg^ст (F_Cu^ст : F_Hg^ст),

где: е — число двойных связей ненасыщенной кислоты, которая не определяется от данной насыщенной кислоты; F_Cu и F_Hg — площади пиков неразделяющейся смеси насыщенной и ненасыщенной кислот, полученные при сканировании хроматограмм, окрашенных соответственно солями Си или Hg; F_Cu^ст и F_Hg^ст — площади для стандарта (стеариновой кислоты) [547]. <\br> При помощи паров OsO₄ обнаруживают 5 мкг олеиновой и 2,5 мкг линолевой кислоты в виде серых пятен на светлом фоне [501, 762].

Ряд методов обнаружения липидов основан на селективной адсорбции липофильных красок и других веществ из водно-спиртовых растворов и на образовании соединений включения. Из флуоресцирующих красок обычно применяют 0,05%-ный родамин С, который обнаруживает моно-, ди- и триглицериды и жирные спирты в виде белых пятен, флуоресцирующих синим, на розовом фоне (z = 2 мкг). Под действием КМnО₄ цвет пятен переходит в желтый. Окраску родамина усиливают нильским голубым, хинином, акридиновым оранжевым и т. д. [508, 509]. Родамин С был применен для приближенного определения моноглицеридов по площади пятна. Протопорфирин обнаруживает фосфолипиды, кислоты и глицериды в виде флуоресцирующих красных пятен на светлом фоне (z = 1 мкг) [919].

Комплексы липидов с жировыми красителями, хорошо заметные в видимом свете, образуются только после удаления углеводородов с бумаги. Испытывали судан IV, масляный красный О и другие красители; лучшим оказался судан черный Б, который обнаруживает эфиры многоатомных спиртов и стеринов, но, в отличие от родамина, не окрашивает эфиры одноатомных спиртов. Ненасыщенные липиды лучше связывают судан, чем насыщенные; на прямом свету окраска переходит в розовато-бурую [234, 518, 601]. Растворы жировых красителей в 50%-ном диацетате глицерина использовали для денситометрии глицеридов; пропитывание полосы парафиновым маслом, α-бромнафталином и эмульгирующим веществом повышало точность измерений [925]. Липиды, благодаря их поверхностно-активным свойствам, можно обнаружить по изменению гидрофильности отдельных участков полосы после разделения. На бумаге с парафиновым маслом триглицериды давали прозрачные пятна в растворе КОН. Триглицериды можно омылить на бумаге 10—20%-ным раствором КОН при 95°, а затем обнаружить солями меди. При полном омылении окрашивание суданом прекращается [510, 531, 557].

Циклодекстрин, связываемый липидами по типу реакций включения, не окрашивается парами иода, а дает белые пятна на синем фоне. Ди- и триглицериды, не образующие соединений включения, надо предварительно гидролизовать панкреатином на бумаге. Реакцию включения использовали для денситометрии триглицеридов и метиловых эфиров кислот [294, 681, 854].

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ПРЕДЕЛАХ ОТДЕЛЬНЫХ ГОМОЛОГИЧЕСКИХ РЯДОВ

В обращенно-фазовой системе разделяются гомологи, различающиеся между собой на одну СН₂-группу, а для рядов с одинаковой длиной цепи — на двойную или тройную связь, окси- или <\br> кетогруппу и т. д. До настоящего времени разделили гомологические ряды н-насыщенных жирных кислот с m = 10—36, «четных» и «нечетных» [156, 532, 880], моно-, ди-, три- и полиненасыщенных кислот с m = 11—28 [4, 544, 732], моно- и диацетиленовых кислот, циклопентенилненасыщенных кислот [81, 516]; н-насыщенных 2-оксикислот с m = 14—24 [880], миколевых кислот с m = 30 [786], окси-, диокси- и кетонасыщенных и ненасыщенных кислот [417], насыщенных 2-метил-4-кетокислот с m = 14—26 [528]; ди-, тетра- и гексабромстеариновых кислот [545], аддуктов малеинового ангидрида с кислотами, содержащими сопряженные двойные связи [190]; «бромазонов» н-насыщенных и ненасыщенных кислот, альдегидов и кетонов и их АОММО-производных с m = 2 — 26 [418], АОММО-производных ненасыщенных кислот и аллиловых эфиров насыщенных кислот с m = 20 — 30 [546], насыщенных и ненасыщенных спиртов с m = 10—18 и их аллилуретанов [529], АОММО-производных аллилуретанов насыщенных и ненасыщенных спиртов с m = 10 — 30 [523], 2,4-ДНФГ насыщенных и ненасыщенных альдегидов и их АОММО-производных [525], оксимов сложных эфиров диоксиацетона с m = 8 — 18 и высших альдоксимов [521]; эфиров насыщенных и ненасыщенных кислот с одно- и многоатомными алифатическими и ароматическими спиртами [518], моно-, ди- и триглицеридов одной кислоты или разных кислот [373, 430, 854], триглицеридов синтетического и природного происхождения, содержащих остатки C₈—₂₄-насыщенных и ненасыщенных кислот [530], а также АОММО-производных глицеридов [420].

Туберкулостеариновая и нонадекановая кислоты совпадают по Rƒ; следовательно, разветвление цепи в данном случае не влияет на подвижность [516]. Если двойная связь достаточно удалена от концов цепи, действует правило полярности (стр. 47). Двойная связь рядом с карбоксилом не изменяет Rƒ; так, 2-октадеценовая и стеариновая кислоты не разделяются между собой. Положение двойной связи в цикле или ряду, изолированное или сопряженное, цис- или транс-, не влияет на подвижность. Замена двойной связи в цепи тройной связью увеличивает Rƒ [81, 544]. Полярность ОН-группы выше, чем у СО-группы, поэтому 12-окси- и 12-кетостеариновые кислоты отделяются друг от друга. В ряду окси- и кетокислот приближение функциональной группы к карбоксилу вызывает снижение хроматографической подвижности [528, 545].

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ РАЗНЫХ ГОМОЛОГИЧЕСКИХ РЯДОВ И РАЗНЫХ КЛАССОВ

Если члены разных гомологических рядов совпадают по величине К и значению Rƒ, то для разделения таких липидов надо либо элиминировать ненасыщенные компоненты, либо сместить равновесие полярности в смеси насыщением двойных связей гидрофильными или гидрофобными заместителями. Жирные кислоты перед хроматографией разделяли на насыщенные и ненасыщенные <\br> старыми методами Твитчелла и Бертрама, а также кристаллизацией Си-солей из этанола или кристаллизацией кислот из 55%-ного ацетонитрила. Ненасыщенные компоненты обнаруживали и определяли параллельным разделением исходных и окисленных 1%-ным основным КМnО₄ липидов. Подвижную фазу CH₃COOH : HCOOH : H₂O₂ = 9 : 1 : 1 или 6 : 1 : 1 при 37°, содержащую надмуравьиную кислоту, применяли для полного разрушения ненасыщенных кислот во время разделения; насыщенные кислоты в этой фазе не окислялись [64, 156]. При гидроксилировании перманганатом и роданировании двойных связей Rƒ кислот возрастали, а при галоидировании JBr — снижались. Подвижность ненасыщенных кислот увеличивалась после бромацетокси- и бромметоксилирования с N-бромсукцинимидом, а также после образования АОММО-производных «бромазонов» этих кислот. Диастереоизомеры бром-ацетокси- и метоксипроизводных полиненасыщенных кислот образуют на хроматограмме по две зоны [459, 502, 585].

Жирные кислоты с одинаковым Rƒ разделяли путем гидрирования двойных связей с образованием соответствующих насыщенных кислот более низкой полярности. В одних случаях кислоты разделяли до и после гидрирования с PdO₂ на BaSO₄ в этаноле или с PtO₂ по Адамсу в СН₃СООН. Если в липидах присутствовала пальмитолеиновая кислота, то гидрировали не общую смесь кислот, а выделенную хроматографией фракцию, содержащую пальмитолеиновую, миристиновую и линолевую кислоты; продукты гидрирования разделяли повторно [551]. В других случаях гидрирование проводили непосредственно на бумаге (стр. 52), а затем разделяли гидрированные и негидрированные смеси [191, 511, 1004, 1005]. Для определения линоленовой и α-элеостеариновой кислот, совпадающих по Rƒ, получают аддукты элеостеариновой кислоты с малеиновым ангидридом в присутствии иода, смесь кислот гидрируют и разделяют повторно [189, 192]. Карбонильные группы липидов восстанавливают раствором NaBH₄ в тетрагидрофуране [520]. Для определения кислот одинаковой полярности применяют также низкотемпературную хроматографию (стр. 57) и реакцию взаимодействия двойных связей с солями Hg (стр. 60) [519—522].

Таким образом, правило полярности вносит значительные трудности в проведение анализа липидов. В то же время расшифровка сложных смесей, например смесей триглицеридов, где фракция определенной полярности может содержать 6, 7 и более компонентов, подчас сильно облегчается благодаря тому, что липиды известного строения двигаются в данной хроматографической зоне на основе строгой закономерности.

Обращенно-фазовые системы почти не применяются для фракционирования смеси липидов на классы: различия в полярности столь велики, что разделение в какой-либо одной системе становится невозможным. Кроме того, липиды различных классов, характеризуемые разными значениями К, часто совпадают по величине <\br> Rƒ. Так, олеиловый спирт не отделяется от миристиновой кислоты, а диглицериды накладываются на зону стеариновой кислоты [387]. Для сопоставления классов по абсолютной величине полярности ввели понятие «всеобщей» константы полярности — Квс. Системой отсчета служил гомологический ряд эфиров одноатомных спиртов и «четных» н-жирных кислот: значения Квс и К у них совпадали. Для липидов другого гомологического ряда Квс равна величине К того вещества системы отсчета, которое имеет одинаковое с этим липидом значение Rƒ. Инкремент і, т. е. разность между Квс и К данного липида, постоянен для определенного ряда. Аддитивная величина і зависит от числа СН₂-, СООН, ОН-групп, двойных или сложноэфирных связей, положения функциональных групп и других факторов. Для триглицеридов значение і равно 14, для сложных эфиров ненасыщенных кислот — 12, для 2-оксикислот — 10, для сложных эфиров ароматических спиртов — 2 и т. д. Такая абсолютная шкала полярности весьма полезна для идентификации липидов по их принадлежности к конкретному гомологическому ряду [518].

Как видно, подвижность липидов при разделении зависит от их состава. Связь величины Rƒ в различных системах [92, 232, 584] с параметрами молекулы насыщенных жирных кислот выражали эмпирическими уравнениями:

Rƒ = 1,671—0,1326m + 0,0028m²; Rƒ = 1,42 + (—0,062)m; Rƒ = 1,50—0,00625m,

а для ненасыщенных кислот — уравнениями:

Rƒ = 1,42—(—0,062) (m—2); Rƒ = 1,57—0,06m.

Зависимость значений Rƒ от m жирных кислот или их n-фенилазофенациловых эфиров была линейной [532]. Для триглицеридов такой зависимости не обнаружили [534]. Величина Rƒ ненасыщенных кислот с m = 18 была линейной функцией числа двойных связей в цепи [430].

ЗНАЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ РАЗНОВИДНОСТЕЙ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

В настоящее время методы распределительной хроматографии широко используются для разделения липидов природного происхождения. Однако не все эти методы равноценны.

Хроматография на колонках с полярной неподвижной фазой применима для анализа отдельного гомологического ряда алифатических соединений или их полярных производных; для разделения смеси нескольких рядов липидов нужны более эффективные методы. <\br> Значительно шире распространены обращенно-фазовые системы, которые применяют в колоночной хроматографии для препаративного выделения липидов, в частности липидов с кислородсодержащими функциональными группами в цепи. Этот метод, не требующий сложного и дорогого оборудования, в мягких условиях позволяет получить несколько граммов чистого препарата с достаточно высоким выходом. Для аналитического разделения этот вид хроматографии менее пригоден, поскольку для работы нужно несколько десятков миллиграммов материала, а сами рабочие операции довольно трудоемки [709].

Тонкослойная обращенно-фазовая хроматография в последнее время используется для аналитического разделения. При сочетании ее с высокоэффективными методами тонкослойной хроматографии, особенно с разделением на силикагеле, пропитанном AgNO₃, липиды определенного класса можно охарактеризовать по величине m и е на одной пластинке. Возможности препаративного выделения и количественного определения липидов здесь, по-видимому, более ограниченны, хотя и имеются указания на работы подобного рода [558].

Ведущее положение среди других распределительно-хроматографических методов исследования липидов продолжает сохранять обращенно-фазовая хроматография на бумаге. Изменяя состав неподвижной и подвижной фазы, температуру, длительность опыта и другие факторы, можно сравнительно быстро найти оптимальные условия разделения конкретной смеси липидов. По быстроте разделения (несколько часов) и чувствительности обнаружения липидов (доли микрограмма) хроматография на бумаге в ряде случаев приближается к тонкослойной и газо-жидкостной хроматографии. Для идентификации липидов имеется много качественных реакций, проводимых непосредственно на бумаге. Аналитическое разделение хорошо сочетается с денситометрическим количественным определением и автографическим измерением радиоактивности отдельных зон.

Простота и воспроизводимость разделения — главные преимущества хроматографии на бумаге: анализ может быть выполнен без значительных затрат труда и средств в каждой лаборатории с минимально необходимым оборудованием и реактивами. Данный метод не только очень удобен для быстрой оценки состава отдельных функций элюата хроматографической колонки, но и сам по себе может быть использован в препаративном масштабе для выделения липидов в количестве 1—50 мг.

Таким образом, обращенно-фазовая распределительная хроматография вполне пригодна для анализа классов и гомологических рядов липидов несложного состава. В целях расшифровки многокомпонентных природных смесей липидов и идентификации отдельных соединений этот метод необходимо сочетать с адсорбционной и газо-жидкостной хроматографией и другими современными методами анализа липидов.

Глава 3. ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

РАЗДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Газо-жидкостная распределительная хроматография была предложена в 1952 г. Джеймсом и Мартином как метод разделения летучих C₁ — C₁₂-свободных жирных кислот [436]. Для работы служила колонка с кизельгуром, пропитанным смесью силиконового масла и стеариновой кислоты 9 : 1; последнюю включали в состав жидкой фазы для подавления димеризации жирных кислот, молекулы которых отличаются повышенной полярностью. Ассоциацию карбоксильных групп и образование димеров, которые снижают летучесть кислот и приводят к появлению несимметричных размытых зон на хроматограмме, можно также несколько уменьшить, изменяя величину исследуемой пробы, концентрацию жидкой фазы в колонке и рабочую температуру [160]. В настоящее время в свободном виде разделяют главным образом низшие жирные кислоты [21, 540]. Имеется лишь несколько работ, посвященных газовой хроматографии свободных высших жирных кислот. Условия разделения этих кислот приведены в табл. 4.

Как показывают данные табл. 4, димеризацию свободных жирных кислот подавляли путем использования полярных жидких фаз, содержащих нелетучую минеральную кислоту [461, 717]. Свободные жирные кислоты в малых концентрациях разделялись на колонках с неполярной фазой; при этом повышение рабочей температуры снижало асимметрию пиков [93]. На полиэфирной колонке асимметрия пиков возрастала при увеличении температуры и снижении концентрации жидкой фазы [912]. При всех условиях разделения наблюдалось значительное растягивание нисходящей части пика (образование «хвостов»).

По сравнению с соответствующими метиловыми эфирами свободные кислоты имели более высокие значения удерживаемых

Условия анализа свободных высших жирных кислот методом газо-жидкостной хроматографии

УСЛОВИЯ РАЗДЕЛЕНИЯ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

В 1953 г. было обнаружено, что для газохроматографического разделения лучше применять не свободные жирные кислоты, а их менее полярные производные — метиловые эфиры. Благодаря такой замене достигли более высокой эффективности разделения при меньших температуре и времени анализа, а также большей точности идентификации и количественного определения [228, 229]. В настоящее время газо-жидкостную хроматографию метиловых эфиров высших жирных кислот можно считать стандартным методом исследования состава и строения природных липидов [359]. При помощи этого метода можно анализировать различные жирные кислоты от C₁ до C₃₀ и выше: насыщенные, разветвленные, ненасыщенные (цис- и транс-изомеры), окси-, эпокси-, кето-кислоты и т. д. Применение современных методов позволяет быстро превратить все эти кислоты в метиловые эфиры с количественным выходом. Полученные эфиры разделяют на насадочных или капиллярных колонках, нагретых до 150—300°; колонку наполняют твердым носителем (обычно разными сортами кизельгура) с нанесенной на него высококипящей неполярной или полярной жидкой фазой. В качестве газа-носителя используют азот, гелий или аргон, которые проходят через колонку со скоростью 30—100 мл/мин. Метиловые эфиры детектируют и количественно определяют при помощи катарометра, β-ионизационного или пламенно-ионизационного детекторов. В табл. 5 приведено несколько примеров разделения метиловых эфиров.

Таблица 4

ПОЛУЧЕНИЕ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Существуют две группы методов получения метиловых эфиров жирных кислот для хроматографических целей: 1) каталитическая переэтерификация липидов в растворе метанола (метанолиз); 2) омыление липидов, выделение жирных кислот и их последующая этерификация.

До проведения метанолиза липиды растворяют в абсолютном метаноле, содержащем тот или иной катализатор этой реакции; в случае неполного растворения прибавляют бензол или толуол [909]. Чтобы обеспечить количественный выход эфиров, все применяемые реактивы должны быть тщательно очищены от сопутствующих загрязнений [627]. Условия реакции, используемые различными авторами, приведены в табл. 6. Как видно из данных табл. 6, метанолиз в основной среде обычно заканчивается гораздо быстрее, чем в кислой; при этом НСІ и H₂SO₄ не различаются по каталитической активности, а калий превосходит натрий [657]. В 1%-ном растворе Nа в первичных спиртах алкоголиз триглицеридов проходит полностью за 2ᵐ мин., где m = 1—6 — число атомов углерода в молекуле спирта [291]. В отсутствие кислорода выход метиловых эфиров несколько повышается. Окончательная очистка эфиров перед хроматографией может быть достигнута фракционной перегонкой [671], возгонкой в вакууме [235, 909] или же адсорбционной хроматографией на колонке с силикагелем, либо в тонком слое [291, 657]. Полученные метиловые эфиры можно полностью защитить от окисления в течение длительного времени пу- <\br> тем хранения их бензольного раствора в темноте в атмосфере инертного газа при температуре ниже 0° [412].

Условия переэтерификации вполне пригодны и для превращения жирных кислот, выделенных омылением липидов, в их метиловые эфиры (см., например, [935]). Однако существуют и более быстрые методы этерификации, занимающие не более нескольких минут [793, 794]. Уже в течение ряда лет метиловые эфиры получают этерификацией кислот диазометаном. Для проведения реакции к эфирному раствору жирных кислот (100 мг) при-

Таблица 6 Условия получения метиловых эфиров жирных кислот методом метанолиза

Недостаток этого метода состоит в том, что диазометан ядовит и взрывоопасен. Кроме того, он может давать артефакты — продукты присоединения CH₂N₂ к двойным связям жирных кислот [909]. В последнее время было обнаружено, что свежеприготовленный раствор СН₂N₂ в смеси СН₃ОН и эфира 1 : 9 позволяет получать метиловые эфиры за 10 мин. с количественным выходом и без примеси продуктов разрушения или полимеризации. По-видимому, метанол играет в данной реакции роль катализатора [851]. В другой работе рекомендуется синтезировать эфиры, выдерживая жирные кислоты в слабом растворе диазометана при —34° в течение двух с половиной дней [101]. Этерификация жирных кислот в растворе трехфтористого бора в метаноле заканчивается всего за 2 мин., но выход метиловых эфиров не превышает 90—95%; эпоксикислоты и кислоты с сопряженными двойными связями не могут быть этерифицированы этим методом [718]. Активность CH₂N₂, HCI и BF₃ в реакции образования эфиров высших жирных кислот приблизительно одинакова [412, 693]. Наиболее удобным методом получения метиловых эфиров, обеспечивающим количественный выход эфиров независимо от жирнокислотного состава масла, можно считать омыление жира с последующей этерификацией возникших в этой реакции жирных кислот метанолом в присутствии хлористого водорода. Для получения количественного выхода более летучих эфиров низших кислот C₁—C₁₀ следует применять диазометан [693] и использовать докозан в качестве растворителя [539] или же вместо метиловых эфиров получать этиловые эфиры [62].

В цереброзидах мозга содержатся жирные 2-оксикислоты. Для этерификации этих кислот и их 2-ацетоксипроизводных применяют реакцию с 2,2-диметоксипропаном в подкисленном метаноле [578, 807]. Эпоксикислоты при омылении разрушаются и переходят в соответствующие диоксикислоты; при наличии эпоксикислот в липидах следует использовать метанолиз в присутствии натрия [944].

Существуют и другие методы получения летучих производных липидов для газо-жидкостной хроматографии. Так, гидрогенолизом триглицеридов с алюмогидридом лития получен свободный глицерин и высшие спирты, соответствующие отдельным жирным кислотам. Продукты ацетилирования этих соединений — триацетин и ацетаты жирных спиртов — определяли газо-жидкостной хроматографией [399]. Для получения эфиров летучих и нелетучих органических кислот предложена реакция солей серебра с иодистым метилом в атмосфере инертного газа в течение 5 час.; выход метиловых эфиров составлял 96—100% [292].

ВВОД ПРОБЫ И ТЕМПЕРАТУРА РАЗДЕЛЕНИЯ

Летучие компоненты жидкой фазы и пары воды удаляют из колонки при температуре на 5—10° выше рабочей в токе газа-носителя в течение 48—96 час. [631]. Иногда колонку с твердым носителем, содержащим 10—25% жидкой фазы, стабилизируют нагреванием до 300° при 10 мм рт. ст. в течение 5 час. [160].

Ввод пробы в колонку производят с максимальной быстротой, предпочтительно без перерыва потока газа-носителя. Обычно метиловые эфиры вводят в хроматограф в виде раствора в летучих органических веществах [434]. Описано приспособление для ввода малых проб метиловых эфиров в хроматографическую колонку с замкнутой системой инъекции [821].

Для успешного разделения метиловые эфиры высших жирных кислот необходимо сразу же после их введения в хроматограф перевести в газообразное состояние [499, 793, 794, 944]. Для этого многие модели хроматографов снабжены испарительными камерами, где поддерживается температура на 50—100° выше температуры колонки [631]. При использовании капиллярных колонок эта разность температур может достигать 150° [644, 765]. Если испарение пробы на входе колонки не происходит достаточно быстро, то эффективность разделения снижается, особенно для компонентов с большой величиной удерживаемого объема Vᵣ [821]. Эфиры насыщенных и ненасыщенных кислот обычно при испарении химически не изменяются [910]. Однако ненасыщенные кислоты с сопряженными двойными связями и гидроксильными группами в испарительной камере могут подвергаться цис,транс-изомеризации или дегидрироваться [743]. Эфиры кислот тунгового масла, содержащего более 70% элеостеариновой кислоты, полимеризуются в хроматографической колонке при высоких температурах [793]. Поэтому для проведения газохроматографического определения кислот с указанными выше особенностями строения необходимо применять минимально возможную температуру и использовать для разделения более устойчивые производные кислот.

Правильный выбор рабочей температуры и ее регулирование в течение всего опыта во многом определяют успех работы. Раньше высокую температуру в колонке создавали при помощи паровой бани, содержащей высококипящие жидкости (типа этиленгликоля, температура кипения 197°) [93]; сейчас обычно пользуются воздушным термостатом.

Температурный режим газохроматографического разделения зависит от состава метиловых эфиров пробы и химической природы жидкой фазы колонки. Наилучшие результаты разделения эфиров кислот от C₁₆ до C₃₀ включительно на неполярных жидких фазах (апьезонах М и L, силиконовом масле) достигаются при температуре колонки 250—300° [94, 573, 794]. При более высоких температурах скорость хроматографии возрастает, но эффективность разделения снижается [434, 644]. Для полиэфирных фаз температу- <\br> ра редко превышает 200—210° [62, 101, 794], так как дальнейшее нагревание вызывает деструкцию неподвижной фазы [397]. В ряде случаев разделение одной и той же смеси на капиллярных колонках достигалось при более низких температурах, чем на насадочных колонках [614, 632, 633, 644].

Температура колонки оказывает значительное влияние на удерживаемый объем отдельных компонентов. Так, на полиэфирной колонке метилстеарат не отделяется от метилолеата при 125°, но хорошо отделяется при 158—168° [632]. «Фактор разделения» — отношение удерживаемого объема Vᵣ данного компонента смеси к Vᵣ предыдущего гомолога ¹ [437] — для эфиров насыщенных кислот и кислот с разветвленной цепью с повышением рабочей температуры обычно снижается, а для ненасыщенных эфиров (по отношению к предшествующим насыщенным эфирам с той же длиной цепи) — возрастает [614]. Эту закономерность можно использовать для хроматографической идентификации жирных кислот. При разделении смеси метиловых эфиров на полярной колонке без предварительной калибровки катарометра повышение температуры приводило к завышенным результатам для легколетучих компонентов и заниженным значениям для эфиров с большим временем удерживания. С падением температуры анализа ошибка определения снижалась [631, 765] (стр. 85).

Если смесь метиловых эфиров содержит компоненты, резко различающиеся по своей летучести, то анализ такой смеси при одной температуре колонки становится невозможным. В подобных случаях проводят два анализа: более летучие эфиры с m = 2—10 определяют при 100—120°, а метиловые эфиры высших жирных кислот разделяют при 180—200°; при этом эфиры низших кислот выходят как один пик в начале хроматограммы [280, 437, 793, 968].

В последнее время хроматографию производных низших и высших кислот осуществляют в условиях программирования рабочей температуры [793, 801]. Температуру колонки от начального значения (130—170°) повышают согласно заданной программе со скоростью 3—5° в минуту, пока из колонки не выйдет последний компонент разделяемой пробы. При этом температура детектора поддерживается на постоянном уровне, находящемся около середины выбранного температурного диапазона. Анализ жирнокислотного состава с программированием температуры имеет ряд преимуществ по сравнению с изотермическим. Эффективность разделения метиловых эфиров, особенно их наиболее летучих компонентов, возрастает, а сам анализ ускоряется благодаря снижению величины Vᵣ менее летучих фракций. В условиях программирования пики всех эфиров имеют оптимальную симметричную форму и приблизительно одинаковую ширину, что позволяет с большей точностью определять их площадь. В то же время при работе на

¹ В отечественной литературе это понятие обозначают «относительная летучесть». <\br> колонках с полярной жидкой фазой в программированном температурном режиме в конце разделения может наблюдаться дрейф нулевой линии. Для устранения дрейфа применяют систему из двух колонок и двух детекторов, в которой унос жидкой фазы из рабочей колонки компенсируется такой же потерей из параллельной колонки, не используемой для разделения. Кроме того, программирование затрудняет идентификацию эфиров по Vᵣ, а постепенное повышение скорости газа-носителя при нагревании колонки может сказаться на точности количественного определения метиловых эфиров [47а, 315, 689].

Для получения достоверных количественных данных катарометр следует тщательно термостатировать [765]. Обычно температура катарометра на 25—75° превышает температуру колонки [631]. В некоторых случаях такой температурный градиент создают и для ионизационных детекторов [499, 644].

Срок работы колонки значительно увеличивается, если в нерабочее время снижать ее температуру [272, 644].

ТВЕРДЫЙ НОСИТЕЛЬ

В различных исследованиях по газо-жидкостной хроматографии липидов применяли твердые носители с размером частиц 50—150 меш; диапазон зернения для одной колонки не должен превышать 20 меш. В качестве твердого носителя чаще всего использовали различные сорта кизельгура (диатомовой земли) — Целит-545 [93, 223, 612], Хромосорб [397, 498, 671, 771, 894], Стерхамол [573] и Эмбасел [235]; иногда применяют и другие материалы — толченый огнеупорный кирпич [944], стеклянные шарики [396], хлористый натрий [229] и др. Перед нанесением жидкой фазы твердый носитель отмывают концентрированной соляной кислотой, затем раствором КОН, раствором NН₄ОН, водой и тщательно высушивают [222, 765]. Для увеличения термостойкости колонки и снижения ее адсорбирующей способности носитель рекомендуют обрабатывать парами диметилдихлорсилана [396, 830, 895].

В хроматографические колонки вносят твердый носитель с нанесенной на него жидкой фазой. Наполнитель уплотняют при помощи вибратора. В отдельных случаях для уплотнения применяют давление того газа, который используется в процессе анализа [631, 765], либо при заполнении выходное отверстие колонки соединяют с вакуумным насосом [93].

Разделяющая способность колонки в большой степени зависит от качества ее приготовления. Природа твердого носителя также влияет на характер разделения метиловых эфиров: так, полиэтиленгликоль-сукцинат на Целите не обеспечивает разделения эфиров линоленовой и арахиновой кислот; если ту же фазу нанести на Хромосорб W, то эфир арахиновой кислоты выходит на хроматограмме между пиками линолеата и линолената [792]. В то же время применение Хромосорба В и Целита-545, пропитанных по- <\br> ливинилацетатом, дало сходные результаты при разделении искусственной смеси метиловых эфиров жирных кислот [396]. Значительного разрушения метил-цис-9,10-эпоксиоктадеканоата на колонке с силиконовым маслом при 235° можно избежать при использовании в качестве твердого носителя Целита вместо огнеупорного кирпича С-22 [944].

Метиловые эфиры насыщенных и ненасыщенных кислот могут адсорбироваться при разделении на колонке со Стерхамолом или иными сортами кизельгура, пропитанного неполярной или полярной жидкой фазой. Так, при использовании Стерхамола 8% радиоактивности меченого метилпальмитата-1-C¹⁴ задерживается в колонке и элюируется позже основного пика. Для понижения адсорбирующей способности Стерхамол обрабатывали гексаметилдисилазаном или 2%-ным раствором лаурата Na, а кизельгур промывали соляной кислотой и раствором КОН в метаноле. После такой обработки адсорбция метилпальмитата-1-C¹⁴ снижалась до 4% [159].

ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА НЕПОЛЯРНЫХ ЖИДКИХ ФАЗАХ

В работах по газовой хроматографии метиловых эфиров высших жирных кислот раньше других жидких фаз стали применять не содержащие полярных групп высококипящие вакуумные смазки кремнийорганической или парафиновой природы — силикон ДС-550, апьезоны М и L и др. [93, 94, 228, 436, 437, 613].

Значения удерживаемого объема метиловых эфиров определяются различиями в парциальном давлении пара этих соединений, когда они растворены в жидкой фазе колонки; парциальное давление в свою очередь зависит от природы и величины сил взаимодействия между молекулами эфира и жидкой фазы. При концентрации паров органического вещества 3—5 мкг/мл и ниже между эфирами высших жирных кислот и молекулами неполярных фаз действуют исключительно дисперсионные силы Лондона, которые ослабевают при снижении молекулярного веса и разветвлении алифатической цепи [434]. Эти фазы обеспечивают полное разделение эфиров н-насыщенных кислот, различающихся по m на единицу (фактор разделения 1,56), в диапазоне m = 1—24 [1, 437]. Время удерживания сравнительно велико и для метилстеарата при 250° обычно превышает 60 мин. Эфиры кислот с разветвленной цепью выходят из колонки раньше неразветвленных эфиров с тем же числом атомов углерода [434, 540]; изоформы разветвленных кислот движутся быстрее соответствующих антеизоформ (у изоформ алифатическая цепь оканчивается изопропильной, а у антеизоформ — изобутильной группой) [272, 444, 997].

Для отделения эфиров ненасыщенных кислот перед хроматографией используют бромирование; бромированные эфиры (кроме бромидов мононенасыщенных эфиров) не летучи при температуре разделения [437]. Длину цепи ненасыщенной кислоты можно <\br> определить препаративным выделением данного эфира и последующим каталитическим гидрированием; полученный насыщенный эфир идентифицируют по величине удерживаемого объема [439]. Переэтерификации метиловых эфиров при гидрировании с катализатором Адамса можно избежать, проводя реакцию в метаноле [790]. Другие методы идентификации изложены на стр. 79.

При разделении на колонке с неполярной жидкой фазой эфиры ненасыщенных кислот располагаются на хроматограмме впереди эфиров соответствующих насыщенных кислот. Насыщенные и мононенасыщенные эфиры разделяются полностью; ди- и триненасыщенные эфиры образуют смешанный пик, который частично отделяется от пика мононенасыщенных эфиров [433]. Разделение метиллинолеата и метиллинолената не было достигнуто даже на капиллярной колонке с апьезоном L эффективностью в 200 тысяч теоретических тарелок [633]. При сокращении расстояния между карбоксильной группой и двойной связью величина удерживаемого объема Vᵣ мононенасыщенных эфиров несколько возрастает [434, 437]. На капиллярной колонке с полибутеном частично разделены изомеры метиллинолеата — эфиры 8,11-, 9,12-, 10,13- и 11,14-октадекадиеновых кислот [613]. Полиненасыщенные эфиры с сопряженными двойными связями хорошо разделялись на колонке с апьезоном L, в то время как эфиры с изолированными двойными связями совершенно не отделялись друг от друга в этих условиях [235].

Неполярные жидкие фазы с успехом применяют для разделения геометрических изомеров ненасыщенных кислот, образующихся при неполном гидрировании в промышленных условиях; при этом величина Vᵣ цис-изомеров моно-, ди- и триненасыщенных эфиров с изолированными и сопряженными двойными связями меньше, чем у соответствующих транс-изомеров [93, 434, 437, 498, 632]. На капиллярной колонке с апьезоном L геометрические изомеры метиллинолеата разделены на цис, цис-, цис, транс- и транс, цис- → транс, транс-формы; цис, цис, цис-метиллиноленат элюировался впереди транс, транс, транс-изомера. Достигнуто также разделение геометрических изомеров октадекадиеновых кислот с сопряженными двойными связями [644].

На колонке с силиконовым маслом метиловый эфир цис-9,10-эпоксиоктадекановой кислоты из уредоспор ржавчинного гриба отделяли от продукта ацетилирования — ацетоксиоктадеканоата [944]. Было описано также разделение метиловых эфиров 2-оксикислот [573].

В настоящее время неполярные жидкие фазы применяют главным образом для сравнительной идентификации жирных кислот (стр. 80), для предварительного препаративного фракционирования метиловых эфиров по числу атомов углерода и для определения цис- и транс-изомеров. При изучении состава сложных смесей жирных кислот из природных источников чаще всего используют хроматографию на полярных жидких фазах.

ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ПОЛЯРНЫХ ЖИДКИХ ФАЗАХ

Полярные жидкие фазы предложены для разделения эфиров насыщенных и ненасыщенных кислот в 1958 г. [628, 764]. Первые полярные фазы, производные адипиновой кислоты — полиэтиленгликольадипат (LAC-1-296) и полипропиленгликольадипат (Реоплекс-400) — широко применяются до сих пор. Подобные полиэфиры [—О—СО—(CH₂)ₙ—CO—О—]ₘ синтезируют поликонденсацией янтарной [223], адипиновой [434, 461] и других дикарбоновых кислот с этиленгликолем или иным многоатомным спиртом при 150—180°, обычно в присутствии катализатора (n-толуолсульфокислоты, хлористого цинка и т. д.) и в атмосфере инертного газа; продукт растворяют в спирте или ацетоне и очищают от примеси катализатора и свободных кислот ионообменной хроматографией на Амберлите IR-120 или Дуолите А-4 [222, 223, 467, 613, 771]. Для выделения более термостойкой высокомолекулярной фракции полиэфиры можно переосадить гексаном из ацетонового раствора [223]; упругость пара жидкой фазы при рабочей температуре не должна превышать 0,5 мм рт. ст. [629].

В качестве полярной жидкой фазы для аналитического и препаративного разделения используют также поливинилацетат (Винилит АYАС) с молекулярным весом 1500—23 000. В отличие от вышеупомянутых полиэфиров, образующих высокомолекулярные продукты разложения, поливинилацетат при нагревании выделяет только небольшое количество уксусной кислоты, которую после препаративного разделения легко удалить из собранных фракций; уровень фона катарометра в таких условиях не превышает 0,2 мв [397]. На колонках с поливинилацетатом происходило разложение диметилмалоната; при использовании силиконового масла распада не наблюдалось [48]. В последние годы для хроматографии метиловых эфиров применены ацилированные β-циклодекстрины, которые отличаются низким содержанием кислорода, отсутствием полярных концевых групп, однородным молекулярным весом и повышенной термостойкостью [842, 853].

Полярную жидкую фазу в количестве 5—25% наносят на твердый носитель и материал колонки стабилизируют как описано на стр. 71. В данном случае стабилизацию колонки следует проводить особенно тщательно, поскольку полиэфиры неустойчивы при высоких температурах. При недостаточной стабилизации колонки или излишне высокой температуре разделения большие количества жидкой фазы могут попасть в детектор и вывести его из строя. Унос фазы из колонки приводит к снижению эффективности разделения, а также вызывает дрейф и «шум» нулевой линии детектора. Поступающий в колонку газ-носитель следует тщательно высушивать во избежание гидролиза полиэфиров [222, 223]. Если колонка хорошо стабилизирована и правильно эксплуатируется, срок ее службы может достигать нескольких месяцев [434]. <\br> Рассмотрим теперь физико-химические основы разделения эфиров ненасыщенных жирных кислот на полиэфирных жидких фазах. Разделение этих соединений становится возможным благодаря возникновению межмолекулярного взаимодействия между их поляризуемыми двойными связями и сложноэфирными группами полярных жидких фаз. Это взаимодействие, усиливающееся с ростом числа двойных связей в алифатической цепи, избирательно замедляет движение ненасыщенных метиловых эфиров по колонке. Поэтому на хроматограмме они располагаются после соответствующих насыщенных эфиров, т. е. в порядке, обратном тому, который наблюдается при хроматографии на неполярных жидких фазах [434].

На полиэфирных колонках величина удерживаемого объема метиловых эфиров насыщенных кислот при равной температуре и одинаковом весовом содержании жидкой фазы снижается в 2—3 раза по сравнению с колонками с апьезоном L, а хроматографическое разделение соответственно ускоряется [793]. Свободная энергия сольватации СН₂-групп также снижается, и величина фактора разделения эфиров, различающихся на СН₂-группу, становится меньше, чем на неполярных колонках: 1,40 вместо 1,56 [434]. Эфиры разветвленных насыщенных кислот располагаются впереди соответствующих насыщенных эфиров с прямой цепью, как и в случае неполярных фаз [354, 671]. Геометрическая конфигурация двойных связей оказывает на величину Vᵣ значительно меньшее влияние, чем при использовании неполярных жидких фаз [434].

С увеличением числа двойных связей в цепи полярность метиловых эфиров ненасыщенных жирных кислот и их растворимость в полярных жидких фазах возрастают. По этой причине моно-, ди- и триненасыщенные эфиры выходят из колонки (в указанном порядке) вслед за насыщенными эфирами с тем же числом атомов углерода. В то же время различия в полярности полиэфиров разного состава оказывают сильное влияние на эффективность разделения.

При уменьшении числа атомов углерода в остатке дикарбоновой кислоты, связанном с полиэтиленгликолем, или при укорочении монокарбонового кислотного остатка в ацилированных β-циклодекстринах полярность полиэфира и разделяющая способность колонки возрастают; одновременно снижаются термостойкость жидкой фазы и абсолютный удерживаемый объем насыщенных метиловых эфиров [540, 853]. Метилолеат можно полностью отделить от метилстеарата на колонках с полиэтиленгликольсукцинатом и частично — на колонках с полиэтиленгликольадипатом [223, 631, 632, 765]. На колонках с сильно полярными фазами относительное удерживание ненасыщенных эфиров возрастает до такой степени, что пик триненасыщенного метилового эфира накладывается на пик насыщенного эфира, содержащего на два атома углерода больше. Так, на колонках с полиэтиленгликольсукцинатом или полиэтиленгликольпентаэритритадипатом (LAC-2-P446) соотношение удерживаемых объемов метиллинолената и метилового <\br> эфира арахиновой кислоты равно единице; с возрастанием полярности колонки при увеличении содержания жидкой фазы и рабочей температуры это соотношение больше единицы. Для разделения подобных пар метиловых эфиров обычно используют менее полярные полиэфирные фазы — полиэтиленгликольадипат, бутандиолсукцинат и диэтиленгликольсебацинат [223, 623, 631, 765].

Выдерживание полиэфирной колонки при высокой температуре в течение нескольких недель приводит к снижению полярности фазы [793]; при этом появляется возможность разделения на выдержанной колонке таких пар метиловых эфиров, которые не отделялись бы друг от друга на «свежей» колонке того же полиэфира [671].

Применение полиэфирных фаз дало наилучшие результаты при анализе метиловых эфиров жирных кислот растительного и животного происхождения, которые в разных объектах могут различаться по длине цепи от C₁ до C₃₀ и по числу двойных связей от 0 до 6 [540].

На колонках β-циклодекстрин-валерата, -бутирата, -пропионата и -ацетата разделены девять разветвленных метил-, диметил- и триметилизомеров метилгептадеканоата [653].

Ненасыщенные эфиры с одинаковым числом атомов углерода и двойных связей, различающиеся по расположению связей в цепи, плохо делятся на насадочной колонке, но могут быть разделены при использовании капиллярной колонки. Так, 8,11-, 9,12-, 10,13- и 11,14-изомеры метиллинолеата на капиллярной колонке полиэтиленгликольглутарата полностью отделялись друг от друга и от метиловых эфиров стеариновой, олеиновой и линоленовой кислот; на обычной колонке с полиэтиленгликольадипатом происходило лишь разделение 11,14-изомера и суммы 8,11- + 9,12-изомеров. При удалении двойной связи от карбоксила величина Vᵣ несколько возрастала, но метиловые эфиры олеиновой и петрозелиновой кислот на обеих колонках не могли быть разделены [613]. Метиловые эфиры линоленовой и линолевой кислот с сопряженными двойными связями хорошо отделялись от соответствующих эфиров с изолированными связями [235].

На заполненной сорбентом колонке цис, транс-изомеры ненасыщенных кислот не разделяются [498, 632]. На капиллярной колонке с полиэтиленсукцинатом удалось отделить метилолеат от метилэлаидата, у которого величина Vᵣ была меньше. Геометрические изомеры метиллинолеата разделены на транс, транс-, цис, цис- + цис, транс- и транс, цис-формы, а изомеры метиллинолената — на транс, транс, транс-, моно-транс-, ди-транс-, цис, цис, цис- + ди-транс- и моно-транс- + моно-цис- формы. Разделение геометрических изомеров метиллинолеата с сопряженными двойными связями было столь же эффективным, как и на неполярной колонке [644].

Описана хроматография метил-цис-9,10-эпоксиоктадеканоата <\br> и его производных на полиэфирной колонке [944]. На колонке с полиэфиром сукцината разделены метиловые эфиры эритро- и трео-дибромоктадекановых кислот, из которых трео-формы с большим дипольным моментом обнаруживали более высокое значение удерживаемого объема. Величина Vᵣ трео-формы в 20 раз превышала значение Vᵣ метилстеарата [894].

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Методы идентификации жирных кислот, входящих в состав сложной природной смеси, можно разбить на две основные группы: 1) идентификацию по хроматографическим данным, полученным при различных условиях в зависимости от полярности жидкой фазы, состава твердого носителя, вида детектора, температуры разделения, скорости газа и т. д.; 2) идентификацию путем сочетания хроматографических и нехроматографических методов (окислительное расщепление, галоидирование или каталитическое гидрирование двойных связей, спектрофотометрия в ИК- или УФ-свете, масс-спектрометрия и т. д.).

Величины удерживаемых объемов Vᵣ метиловых эфиров жирных кислот в значительной степени зависят от параметров разделения; в целях идентификации отдельные компоненты смеси обычно характеризуют численным значением относительного удерживаемого объема Vᵣᵒᵗʰ, которое равно отношению Vᵣ данного эфира к Vᵣ известного вещества (метилового эфира миристиновой, пальмитиновой или стеариновой кислот [765]). Величину Vᵣ измеряют от вершины пика газа, не адсорбируемого при данных условиях разделения (на практике при анализе эфиров высших жирных кислот таким газом обычно служит воздух) [422]. Наиболее простой метод хроматографической идентификации — это идентификация по величине Vᵣᵒᵗʰ; однако ввиду возможного содержания в одной хроматографической полосе двух или нескольких различных компонентов такая идентификация при анализе сложных смесей жирных кислот иногда оказывается недостаточно надежной [540]. Идентификация разветвленных и ненасыщенных кислот по величине фактора разделения описана на стр. 72.

Газохроматографическое разделение липидов, как и всякий процесс распределительной хроматографии, подчиняется правилу аддитивности [437, 690, 968]. Согласно этому правилу, прибавление новой функциональной группировки в цепи изменяет величину коэффициента распределения вещества только соответственно природе этой группировки и ее распределению в фазах хроматографической системы, но независимо от состава остальной части молекулы. Поэтому на неполярных и полярных фазах для гомологических рядов метиловых эфиров насыщенных н-жирных кислот [765], разветвленных насыщенных кислот, изо- и (+-)-антеизо-разветвленных кислот [354], мононенасыщенных кислот [354, 765], ди-, три- и полиненасыщенных кислот [434], бромированных <\br> жирных кислот [894], моно- и дикарбоновых кислот с короткой цепью [439] и других липидов [306, 595, 706] в системе координат lg Vᵣᵒᵗʰ — число атомов углерода в алифатической цепи (m) получается семейство прямых, которые в диапазоне C₈ — C₂₆ практически параллельны между собой. Для метиловых эфиров с одинаковой длиной цепи установлена линейная зависимость между lgVᵣᵒᵗʰ и числом двойных связей [765]. Функциональная зависимость для жирных кислот описывается уравнением вида lg Vᵣᵒᵗʰ = a + bm, где а и b — константы, зависящие от параметров опыта [229, 573]. При увеличении температуры разделения тангенсы углов наклона между параллельными прямыми и осью абсцисс уменьшаются [730]. Жирные кислоты, принадлежащие к известному гомологическому ряду, можно идентифицировать, используя линейную зависимость между lg Vᵣᵒᵗʰ и m.

Если гомологическая принадлежность неизвестна, то метиловый эфир идентифицируют по величине Vᵣᵒᵗʰ на колонках с неполярной и полярной жидкими фазами на основе закономерности, обнаруженной Джеймсом для н-насыщенных кислот и н-ненасыщенных кислот с изолированными двойными связями. Джеймс показал, что между отложенными на осях координат величинами lg Vᵣᵒᵗʰ метиловых эфиров данного гомологического ряда на колонках с апьезоном L, с одной стороны, и на колонках с полиэтиленгликольадипатом — с другой, существует линейная зависимость, причем насыщенные, моно-, ди-, три- и полиненасыщенные жирные кислоты образуют ряд параллельных прямых. Положение точки, в которой линия, проведенная параллельно оси абсцисс или оси ординат из найденного для данной кислоты значения lg Vᵣᵒᵗʰ, пересекается с той или иной из этих прямых, позволяет характеризовать неизвестную кислоту по числу атомов углерода и двойных связей. Точки пересечения, соответствующие эфирам с одинаковой длиной цепи, но различающимся по ненасыщенности, лежат вдоль перпендикуляра, который проведен к прямой для эфиров насыщенных кислот в точке, соответствующей метиловому эфиру насыщенной жирной кислоты с данным числом атомов углерода [434]. Аналогичные закономерности получены при разделении смеси жирных кислот на двух полиэфирных колонках различной полярности [853].

Вместо Vᵣᵒᵗʰ для идентификации жирных кислот можно использовать другую относительную величину, которая получила название «углеродного числа» [997] или «эквивалентной длины цепи» (ЭДЦ) [731]. Для нахождения ЭДЦ неидентифицированного пика хроматограммы строят эталонную прямую зависимости lg Vᵣᵒᵗʰ метиловых эфиров нормальных насыщенных жирных кислот от числа атомов углерода m для данных условий разделения, а затем по этой прямой определяют величину m, соответствующую найденному значению lg Vᵣᵒᵗʰ идентифицируемого компонента; получен- <\br> ная величина m и является ЭДЦ данного метилового эфира. При отсутствии эталонной прямой ЭДЦ можно вычислить из уравнения ЭДЦ = (s₂—s₁) lg (tₓ : tₛ₁) : lg (tₛ₂ : tₛ₁) + s₁, где s₁ и s₂ — ЭДЦ стандартных метиловых эфиров; tₓ, tₛ₁ и tₛ₂ — Vᵣᵒᵗʰ исследуемого эфира и стандартов [730]. Очевидно, что для насыщенных эфиров величины ЭДЦ на полярных и неполярных фазах совпадают и равны числу атомов углерода в алифатической цепи. Включение двойной связи или определенной функциональной группы в молекулу дает известный инкремент ЭДЦ по сравнению с ЭДЦ насыщенного эфира с той же длиной цепи, характеризующий данную связь или группу. Величины инкрементов ЭДЦ для некоторых заместителей приведены в табл. 7. С помощью ЭДЦ неизвестного компонента на колонках с неполярной и полярной жидкими фазами можно идентифицировать данный компонент и входящие в его состав функциональные группы. Величины ЭДЦ были использованы для идентификации девяти изомеров разветвленных жирных кислот с m = 17 на полярных фазах — ацилированных β-циклодекстринах [296].

Таблица 7 Величины инкрементов эквивалентной длины цепи для различных функциональных групп при газо-жидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот на неполярных и полярных жидких фазах

• На колонке с силиконовым маслом. ** На колонке с 1,4-бутандиолсукцинатом.

В последнее время разработаны методы, позволяющие определить не только число (е), но и расположение изолированных двойных связей в цепи жирных кислот по величине Vᵣᵒᵗʰ на жидких фазах, обладающих высокой полярностью [47, 49, 50]. Значение Vᵣᵒᵗʰ на полиэфирных фазах при «смещении» двойных связей из цен- <\br> трального положения к карбоксильному или метильному концу алифатической цепи возрастает. Откладывая в системе координат величины lg Vᵣᵒᵗʰ метиловых эфиров ненасыщенных кислот против числа атомов углерода (см. выше), заметили, что это возрастание носит закономерный характер. Оно происходит таким образом, что прямые между точками, полученными в системе координат и соответствующими гомологическому ряду ненасыщенных эфиров с одинаковым числом несопряженных двойных связей, будут параллельны между собой лишь при определенном условии. Параллельность будет наблюдаться только в том случае, когда при возрастании длины цепи в каждом гомологическом ряду число атомов углерода от центра двойной связи, наиболее удаленной от карбоксильной группы, до концевой метильной группы включительно остается одинаковым. Иными словами, прямые будут параллельны лишь при условии, что наращивание метиленовых групп в каждом гомологическом ряду ненасыщенных эфиров идет только с карбоксильного конца цепи [47]. Аналогичные ряды параллельных прямых получены группированием ненасыщенных жирных кислот с одинаковым числом атомов углерода между центром ближайшей к карбоксилу двойной связи и СООН-группой, а также кислот одинаковой ненасыщенности с равным числом атомов углерода, у которых двойные связи регулярно смещаются от карбоксильного конца алифатической цепи к метильному [49]. Сравнивая при помощи таких графиков найденные величины lg Vᵣᵒᵗʰ со значениями lg Vᵣᵒᵗʰ эфиров с известным расположением двойных связей, определили строение полиненасыщенных кислот китового жира [50].

При газо-жидкостной хроматографии на неполярных жидких фазах почти не происходит разделения эфиров с одинаковым числом атомов углерода и двойных связей, но с различным положением связей в цепи; на насадочных колонках с полиэфирными фазами разделение таких эфиров (например, метилолеата и метилпетрозелината) также невозможно. Для идентификации ненасыщенных кислот в подобных случаях служит окисление по двойным связям с последующим газо-хроматографическим определением получаемых продуктов.

Олеиновую, линолевую и другие жирные кислоты окисляли КМnО₄ в уксусной кислоте при ~70°, избыток перманганата разрушали метабисульфитом, а полученные ди- и монокарбоновые кислоты в виде их метиловых эфиров разделяли на колонке с апьезоном М. В продуктах окисления олеиновой кислоты обнаружили азелаиновую и пеларгоновую кислоты. Наличие многочисленных побочных продуктов окисления показывает, что в данном случае разрыв цепи ненасыщенных кислот происходил не только по двойным связям [439]. Этот же метод использовали для идентификации ненасыщенных кислот из рыбьих жиров [830]. Окисление смесью КМnO₄-KJO₄ также давало много вторичных продуктов разрушения [761]. При окислении ненасыщенных кислот надму- <\br> равьиной кислотой, гидрировании полученных ненасыщенных диоксикислот с Pd-катализатором и разрыве диоксигрупп смесью KMnO₄-KJO₄ с образованием всех возможных моно- и дикарбоновых кислот побочные продукты окисления не возникали. Жирные кислоты с тройными связями в этой системе реакций почти не подвергались разрушению [325].

Разрыв цепи ненасыщенных кислот можно осуществить при помощи окислительного или восстановительного озонолиза. В первом случае жирные кислоты озонируют в растворе хлороформа при —60° и озонид разлагают водой с одновременным окислением конечных атомов углерода до карбоксила под действием Ag₂O. Полученные кислоты превращают в метиловые эфиры и разделяют при помощи газо-жидкостной хроматографии с программированным температурным режимом [166, 908]. Окислительным озонолизом продуктов распада полиненасыщенных жирных кислот с несопряженными двойными связями можно выделить малоновую кислоту, которая образуется при отщеплении группы —CHCH₂CH—; периодатное окисление разрушает малоновую кислоту [175].

Наиболее достоверные данные для установления структуры ненасыщенных кислот получены методом восстановительного озонолиза. Образовавшиеся при низкой температуре озониды разлагают Н₂ в присутствии Pd-катализатора или путем восстановления трифенилфосфином; при этом в местах разрыва двойных связей возникают альдегидные группы. Газо-жидкостную хроматографию альдегидов и диальдегидов проводят на приборе с пламенно-ионизационным детектором, так как малоновый диальдегид плохо обнаруживается β-ионизационным детектором [799, 801, 895].

В нескольких работах для идентификации кислот после разделения использована инфракрасная спектроскопия (обнаружение транс-изомеров) [671] и масс-спектрометрия [337], а также сочетание газо-жидкостной хроматографии с другими видами хроматографии [444, 671].

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Газо-жидкостная хроматография позволяет проводить количественное определение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с гораздо большей быстротой и точностью, чем другие аналитические методы. Однако чтобы количественный анализ смеси жирных кислот стал возможным, необходимо существование прямой пропорциональности между величиной сигнала хроматографического детектора, с одной стороны, и концентрацией отдельных метиловых эфиров жирных кислот различного строения — с другой [435]. Мерой количества компонента в газовой хроматографии обычно служит площадь соответствующего пика дифференциальной хроматограммы, выраженная в процентах к сумме площадей всех пиков. Существует ряд методов измерения площа- <\br> дей пиков: 1) определение веса бумаги после вырезания пика из хроматограммы; 2) планиметрия; 3) вычисление произведения высоты пика на ширину пика на половине высоты; 4) непрерывное определение при помощи интегратора во время хроматографического анализа. Наиболее широким распространением, вследствие простоты и достаточной надежности, пользуется метод 3 [280], однако интегрирование превосходит другие методы по быстроте и высокой точности достигаемых результатов [550].

В первой работе по газо-жидкостной хроматографии Джеймс и Мартин определяли свободные жирные кислоты, используя фотометрическую кювету, содержащую раствор щелочи и кислотноосновной индикатор; изменение окраски последнего при поглощении выходящих из колонки кислот регистрировали в виде интегральной кривой при помощи записывающего колориметра. Высота каждой ступени этой кривой соответствовала молярному содержанию данной кислоты [436].

Позднее те же исследователи применили в качестве детектора весы Мартина для измерения плотности газа [437]. Весы дают показания, прямо пропорциональные массе разделяемых метиловых эфиров, и, следовательно, не требуют калибровки; однако на практике весы Мартина применяются сравнительно редко [93, 94, 422].

В настоящее время для количественного определения метиловых эфиров используют в основном три вида газохроматографических детекторов — катарометр, аргоновый (β-ионизационный) и пламенно-ионизационный.

Катарометр, измеряющий разность между теплопроводностью неорганического газа-носителя и органического вещества, впервые был использован для газохроматографического анализа метиловых эфиров высших жирных кислот раньше других детекторов, в 1953 г. [228]. Чувствительность катарометра 10⁻⁶ г. С повышением температуры разделения детектор теряет чувствительность, что вынуждает увеличивать объем пробы [793]. Для определения абсолютного количества жирных кислот в пробе применяют метод внутреннего стандарта. К определенному объему образца перед анализом прибавляют аликвотное количество метилгептадеканоата, который обычно не содержится в биологических материалах, и вычисляют соотношение площадей пиков метиловых эфиров пробы и стандарта [412, 765, 935].

В гомологическом ряду эфиров жирных кислот между логарифмами площади пика и массы эфира существует линейная зависимость [442]. Количественное определение состава жирных кислот проводили при помощи хроматографии с катарометром и одновременно стандартными нехроматографическими методами [311, 677]. Сравнение полученных данных показало, что на полиэфирных жидких фазах при измерении более летучих насыщенных компонентов катарометр давал завышенные результаты, а для эфиров с высоким значением удерживаемого объема — заниженные <\br> [223, 357, 719]. Это явление пытались объяснить более интенсивной переэтерификацией высококипящих компонентов с полиэфирами колонки при высокой температуре разделения; действительно, при снижении температуры колонки до 200° различие в результатах, полученных разными методами, значительно уменьшалось [765]. Однако позднее тот же эффект наблюдался при хроматографии на неполярной жидкой фазе (апьезоне), где возможность переэтерификации была исключена [116, 575]. Другие исследователи объясняли наблюдаемые различия неточным измерением площадей пиков при большой величине удерживаемого объема [631].

В результате подробного исследования стандартных смесей метиловых эфиров известного состава было установлено, что в гомологическом ряду жирных кислот отсутствует пропорциональность между молекулярным весом и удельной теплопроводностью. Так, если площадь пика, приходящуюся на 1 мг вещества, для метилкаприната принять за 1,00, то для метилстеарата эта величина составит только 0,84 [575]. Были предложены следующие эмпирические уравнения для внесения поправки на теплопроводность: lg A = m × lg M + lg К, где А — площадь пика, М — вес вещества, m — число атомов углерода и К — константа [887]; R = 24,68 + 5,79 m + 0,075 m², где R — относительный молярный сигнал детектора по отношению к сигналу для метилпальмитата [400]; lg y = 0,001007 х — 0,161, где y — поправочный фактор, х — относительный удерживаемый объем [260]. В работе Кауфмана обнаружена линейная зависимость между величиной калибровочного фактора (отношения весового содержания метилового эфира к площади пика) и числом атомов углерода в данном гомологическом ряду жирных кислот [550].

Все эти исследования показали, что при работе с катарометром точные количественные результаты можно получить только после тщательной калибровки детектора при помощи стандартной смеси метиловых эфиров для данных условий: величины пробы, силы тока в чувствительном элементе, скорости тока газа-носителя, температуры и природы колонки [292, 412]; после длительной работы на одной и той же колонке калибровку повторяют или же определяют по графику поправки [260]. В качестве эталона при калибровке детектора можно использовать весы Мартина [272].

В 1958 г. Лавлок предложил новый тип детектора [653], где органические вещества обнаруживаются и количественно определяются за счет их ионизации метастабильными атомами аргона. Эти атомы, возникающие при облучении проходящего через детектор аргона β-частицами стронция-90, имеют потенциал возбуждения (11,6 eV), который выше потенциала ионизации большинства органических веществ. Ионизация органических веществ приводит к усилению тока ионизации, которое регистрируется самописцем прибора. Высокая чувствительность ионизационного детектора (10⁻⁹ г) позволяет применять для разделения малые количества веществ, что значительно увеличивает эффективность <\br> разделения. Для эфиров с молекулярным весом 150 и выше площадь пика пропорциональна массе метилового эфира, поэтому детектор обычно не требует калибровки [412, 632, 654].

Линейная зависимость сигнала детектора от концентрации вещества в пробе в пределах 10⁻⁷—10⁻⁵ г была подтверждена при анализе стандартных смесей метиловых эфиров высших жирных кислот [15, 40, 498]. Относительная ошибка измерения концентрации для максимального пика не превышала 1% [412]. Для проверки линейности сигнала C₄—C₁₀-свободные жирные кислоты разделяли на колонке с апьезоном L; при увеличении весового содержания кислорода в молекулах кислот относительный сигнал ионизационного детектора снижался [116]. В другой работе отмечалось, что площади пиков низших жирных кислот пропорциональны их молярному проценту [654]. Заметное отклонение от нормы неоднократно наблюдалось при анализе образцов, содержащих метиллиноленат [968]. Так, содержание линоленовой кислоты в масле льна, по данным спектрофотометрии, в УФ-свете составляло 48,5%, а по данным газовой хроматографии с ионизационным детектором — 54,2% [499]. Причина такого поведения линоленовой кислоты остается пока нераскрытой.

Несмотря на перечисленные осложняющие обстоятельства, β-ионизационный детектор, благодаря высокой чувствительности, простоте и надежности в работе, широко используется при количественном определении метиловых эфиров высших жирных кислот.

Количественное определение с помощью пламенно-ионизационного детектора основано на определении относительной концентрации ионов в пламени путем непрерывного измерения электропроводности последнего. Этот детектор был разработан в 1958 г. [670а]. Выходящий из колонки газ-носитель (обычно азот) смешивается в определенном соотношении с водородом, и полученная газовая смесь сгорает в специальной горелке, работа которой поддерживается потоком сжатого воздуха. Находящиеся в пламени платиновые электроды, соединенные с источником напряжения постоянного тока, служат для измерения электропроводности горящего газа. Проводимость водородного пламени в воздухе невелика, однако она значительно возрастает при сгорании выходящих с газом-носителем паров органических веществ, образующих большое количество ионов. Изменение силы ионизационного тока регистрируется самописцем прибора. Наибольшая чувствительность детектирования достигается при использовании параллельной горелки, отличающейся от основной тем, что в нее не поступают пары органических соединений [394а, 670a, 689].

К преимуществам пламенно-ионизационного детектора относятся высокое соотношение сигнала и фона, стабильность нулевой линии при не слишком большом изменении температуры и концентрации паров воды, широкий диапазон линейности сигнала, а также простота конструкции и эксплуатации. Скорость газа-но- <\br> сителя сравнительно мало влияет на работу прибора, однако чувствительность, линейность и величина относительного сигнала детектора удовлетворительно воспроизводятся только при поддержании постоянного соотношения между поступающими в горелку неорганическими газами [47a, 394a, 670a]. По абсолютной чувствительности к метиловым эфирам жирных кислот (как правило, более 10 мвольт мл/мг) пламенный детектор превосходит лучшие катарометры, но обычно уступает β-ионизационному детектору. Однако меньший уровень «шума» при ионизации в пламени приводит к тому, что в практической работе оба ионизационных детектора сходны по чувствительности детектирования метиловых эфиров. Недостаток пламенно-ионизационного детектора по сравнению с другими состоит в том, что выходящие из колонки эфиры разрушаются в пламени горелки [47а, 670а].

Сигнал эфиров жирных кислот в пламенно-ионизационном детекторе обусловлен ионами, возникающими при сгорании в пламени так называемых «активных» атомов углерода, в число которых не входят атомы С карбонильных и карбоксильных групп. В то же время насыщенные эфиры с m > 20 сгорают в детекторе не полностью. Поэтому при калибровке весового определения метиловых эфиров, где сигнал для метилстеарата принимается равным 1,00, площадь пика 12 : 0 умножают на поправочный коэффициент 1,08, а для пика 20 : 0 — на 1,20 [47а, 394а]. В практической работе с природными смесями насыщенных кислот с m, равным 8—22, определение их весового процента только по площади пиков, без применения поправочных факторов, дает относительную ошибку, не превышающую ±3%. Величина сигнала для метиловых эфиров с определенной длиной алифатического радикала почти не зависит от числа двойных связей в цепи [47a, 267, 394а]. В работах по количественному определению метиловых эфиров жирных кислот с применением пламенно-ионизационного детектора были получены удовлетворительные по достоверности и точности данные [394б]. Использование этого детектора для определения эфиров гомологического ряда в условиях программирования температурного режима разделения дало лучшие результаты, чем использование детекторов другого типа [786а]. В настоящее время пламенно-ионизационный детектор в основном заменил аргоновый в качестве главного детектора при газо-жидкостной хроматографии липидов [47a].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ МЕЧЕНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ПОСРЕДСТВОМ ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Для биологических исследований с использованием меченых атомов необходимо не только качественное и количественное определение отдельных соединений, но и измерение их радиоактивности. Предложен ряд методов решения этой задачи в применении к газо-жидкостной хроматографии. Все эти методы можно разбить <\br> на две группы: 1) препаративное получение отдельных фракций и определение их радиоактивности после окончания хроматографического разделения; 2) одновременное измерение и регистрация массы и радиоактивности фракций на выходе колонки в процессе самого разделения.

Ловушками для препаративного сбора фракций служат обычно стеклянные коллекторы с градиентом охлаждения [855], змеевиковые холодильники с нанесенным на внутренние стенки стеклянным порошком [830] или специальные микропористые фильтры [333]; применяют также короткие стеклянные трубки, наполненные покрытыми силиконовым маслом кристаллами антрацена [467, 469], и трубки, содержащие смоченную толуолом вату и выдерживаемые при комнатной температуре [912]. При использовании ионизационного детектора разрушение пробы практически не происходит; это дает возможность полностью собирать метиловые эфиры, вышедшие из колонки [653]. По мере улавливания фракций ловушки меняют от руки [469, 716] или при помощи автоматического коллектора фракций [467]. Собранные метиловые эфиры вымывают раствором сцинтилляторов (2,5-дифенилоксазола и n-втор-2,5-фенилоксазолилбензола) в толуоле и просчитывают на сцинтилляционном спектрометре до достижения заданной точности. Обычно улавливается 90% радиоактивности, введенной в колонку [716]; остальная часть выходит из колонки позже вследствие поглощения, вызванного переэтерификацией метиловых эфиров с полиэфирной жидкой фазой колонки и их адсорбцией на твердом носителе [159, 771]. Это поглощение можно понизить, если перед нанесением жидкой фазы обработать носитель соляной кислотой и раствором щелочи, удалить из жидкой фазы катализатор переэтерификации (n-толуолсульфокислоту, использованную для получения полиэфира) и проводить разделение при минимально возможной температуре [159, 467, 771]. Метод сбора фракций применяется для работы с образцом, обладающим низкой удельной радиоактивностью.

Если активность отдельных метиловых эфиров превышает 1000 имп/мин, следует использовать более быстрые методы непрерывной регистрации радиоактивности [255]. Выходящие из колонки пары сгущаются в охлажденном растворе сцинтиллятора, циркулирующем с большой быстротой под действием тока газа в замкнутой системе трубок между окошками одного или двух фотоумножителей спектрометра. Радиоактивность раствора регистрируется в виде интегральной кривой, где высота отдельной ступени пропорциональна активности данного метилового эфира. Эту кривую совмещают во времени с дифференциальной кривой регистрации массы, идентифицируют пики и определяют удельную радиоактивность каждого эфира. Эффективность счета на такой установке достигает 80% для C¹⁴ и 28% для Н³ [787, 788]. Если удерживаемые объемы соседних компонентов на дифференциальной хроматограмме близки по величине (метилстеарат — метило- <\br> леат), то такие эфиры не могут быть раздельно определены на интегральной кривой радиоактивности [467].

По другому методу метиловые эфиры после выхода из колонки сжигают над СиО до СО₂ и воды, воду поглощают активированным MgClO₄ или восстанавливают до водорода, а активность C¹⁴O₂ определяют на пропорциональном или сцинтилляционном счетчике, получая дифференциальную кривую записи радиоактивности [438, 468].

РАЗДЕЛЕНИЕ ГЛИЦЕРИДОВ

Все изложенное выше показывает, что для липидов, содержащих по одной алифатической цепи в молекуле, газо-жидкостная хроматография стала сейчас стандартным методом качественного и количественного анализа; этого нельзя еще сказать о триглицеридах, хотя за последние годы эффективность их разделения и точность количественного определения их углеродного состава методом газовой хроматографии значительно возросли. В использовании этого наиболее современного аналитического и препаративного метода для исследования триглицеридов достигнуты определенные успехи. Кроме того, этот метод уже сейчас имеет большое практическое значение для высокочувствительного контроля качества пищевых и технических жиров. Он позволяет, например, обнаружить примесь растительного масла или свиного жира в сливочном масле в количестве 1—5% [596]. Уже достигнуто разделение триглицеридов с m = 6—66 и с Δm = 2, а в последнее время — с Δm = 1 [639, 640] (рис. 2).

Работы по газохроматографическому разделению триглицеридов начали появляться с 1960 г. [284, 411, 595]. До сих пор газо-жидкостная хроматография применялась для определения углеродного состава триглицеридов сливочного масла и его молекулярных дистиллятов (рис. 3) [592, 597]; свиного жира [279]; жировой ткани крысы [639]; пяти гидрированных рыбьих жиров [351]; пальмоядрового и кокосового масел; масел 17 видов растений из сем. Lauraceae, Lythraceae и Ulmaceae [641]; масел диких тропических растений Cuphea miniata, Myrica carolinensis и Virola surinamensis, богатых насыщенными кислотами с m = 8—14 [233, 350, 638]; масла какао [639]; масел рапса и других растений из сем. Cruciferae и Tropaeolaceae, богатых эруковой кислотой [351]; масел арахиса, хлопчатника, кунжута, сафлора и сои, оливкового масла, масел Acanthsyris spinescens и Hydnocarpus wightiana и других природных жиров [273, 279].

Рис. 2. Хроматограмма смеси C₄₅-, C₄₆-, C₄₇- и C₄₈-триглицеридов Условия разделения см. стр. 91 <\br> Рис. 3. Газо-жидкостные хроматограммы триглицеридов молекулярного дистиллята молочного жира, полученные в программированном температурном режиме а — исходный дистиллят; б, в — фракции триглицеридов с е = 0 и е = 1 соответственно, выделенные тонкослойной хроматографией комплексов триглицеридов с ионами Ag⁺. Цифры у пиков — число атомов углерода данной фракции

Триглицериды разделяют на колонках, содержащих 1—3% термостойких полиметилсилоксановых неполярных жидких фаз следующих марок (в порядке возрастания полярности): апьезон L, SE-30, JXR, QF-1-0065, OV-1, SE-52 и OV-17 [273, 590, 639]. С целью снижения значительных потерь триглицеридов с m > 48 при разделении колонку стабилизируют нагреванием до 350—400° в течение 6—8 час. в токе азота или гелия; о полноте стабилизации судят по времени выхода, по количеству вышедшего из колонки стандарта (тристеарина) и по эффективности разделения [279, 351, 593, 594, 640]. Однако даже длительная стабилизация не предотвращает потери жидкой фазы из колонки из-за очень высокой температуры последней. Поэтому устойчивость нулевой линии хроматограммы можно обеспечить только применением системы компенсации из двух спаренных колонок и их одновременной стабилизацией, с тем чтобы унос фазы из них был одинаков. При разделении триглицеридов с m = 30—56 на стабилизированной колонке с SE-30 ее диаметр составлял 3 мм, а длина — 35—45 см; уменьшение длины вело к снижению эффективности разделения, а увеличение — к росту потерь глицеридов в колонке [590, 592—594]. Стеклянные колонки по эффективности превышали стальные; описан способ плотного соединения стеклянных колонок с металлической испарительной камерой и детектором при 400° [639]. Вес аналитической пробы триглицеридов не превышает 1—100 мкг; применение минимальной пробы приводит к наилучшим результатам разделения [638—641]. Скорость тока газов-носи- <\br> телей (N₂ или He, обычно 100—300 мл/мин) мало влияет на точность определения, а применение гелия обеспечивает более высокую эффективность колонки [592—594, 639]. Нагретый до 250° газ-носитель поступает в испарительную камеру, которая по температуре выше колонки на 50—75°; увеличение температуры камеры с 285 до 385° не изменяет величину сигнала [279, 351, 590, 641]. Экстраполированная к атмосферному давлению температура кипения триглицеридов приближается к температуре их крекинга; однако для газохроматографического разделения триглицеридов вполне достаточна температура 200—350°. В изотермических условиях разделение природной смеси триглицеридов обычно невозможно из-за резко различной летучести крайних членов их гомологического ряда. Поэтому температуру колонки обычно программируют в диапазоне 170—350°, применяя линейный градиент

Рис. 4. Диаграмма измерений газовой хроматограммы, используемых для вычисления разделяющей способности колонки

2—3° в 1 мин. (стр. 72). В этих условиях анализ занимает не более 30—60 мин. [273, 590, 640]. Таким образом, оптимальное разделение триглицеридов достигается на стеклянных колонках 183 см × 2,5 мм, содержащих 3% полимера JXR на носителе Gas Chrom Q 100—120 меш, при скорости гелия 100 мл/мин, температуре колонки, испарительной камеры и пламенно-ионизационного детектора 170—375 (2—4° в 1 мин.), 320—350 и 300—340° соответственно и весе пробы 10—20 мкг [639].

Как уже упоминалось выше, при помощи газо-жидкостной хроматографии можно полностью разделить триглицериды с Δm = 2 [212]. Оптимальная эффективность разделения наблюдается в диапазоне m = 42—48, а при m > 48 она снижается. При анализе на высокоэффективных колонках природных жиров до m = 56, имеющих «нечетные» ацилы, достигнуто полное разделение глицеридов с Δm = 1 (см. рис. 2) [639, 640]. В обычных условиях триглицериды молочного, рыбьего и других природных жиров из-за содержания в них остатков «нечетных» и разветвленных кислот разделяют менее эффективно, чем растительные триглицериды. Это выражается в неполном возврате к нулевой линии между «четными» пиками и в их расширении [590—594]. Эффективность данной колонки в указанном оптимальном диапазоне значений m можно охарактеризовать величиной ΔC — минимальной разностью числа атомов углерода двух триглицеридов, разделяющихся с полным возвратом к нулевой линии (рис. 4): ΔC = 9,6 × (Wₕₐₙ + Wₕₐₙ) : Δt. При оптимальных условиях разделения (см. <\br> выше) ΔС = 1,6, в то время как разделение «четных» триглицеридов требует колонки с ΔС = 2, а отделение «нечетных» триглицеридов от соседних «четных» гомологов — колонки с ΔC = 1 [639].

Триглицериды с Δm = 0 обычно не отделяются друг от друга; это правило относится и к позиционным изомерам, за исключением тех, у которых разность между длиной отдельных ацилов очень велика, например 1-ПМаМа и 2-ПМаМа (Ma — остаток масляной кислоты) [248, 279, 590, 592]. Другое исключение составляют триглицериды, содержащие циклопентановое кольцо, которые задерживаются сильнее, чем их алифатические аналоги с тем же m [279, 624]. Кокосовое масло или другие растительные масла разделяются хуже, чем искусственные смеси однокислотных триглицеридов. Снижение эффективности вызвано тем, что в каждой «четной» фракции природной смеси содержится 10 и более насыщенных и ненасыщенных компонентов [590—594]. Расширения и деформации «сложных» пиков можно избежать путем применения в одной колонке смеси нескольких жидких фаз различной полярности или путем исчерпывающего гидрирования пробы [351, 640]. В обычных условиях даже частичного разделения по числу двойных связей внутри отдельных фракций с Δm = 0 не происходит, хотя после уноса большей части жидкой фазы из колонки в результате длительной стабилизации иногда наблюдается некоторая деформация хвостовой части отдельных «четных» пиков [593, 597]. В последнее время, используя колонки с упомянутыми уже смесями апьезона L, JXR и OV-17, удалось частично отделить О₃ от С₃, а также По₃ от П₃; однако практического значения для анализа природных ненасыщенных жиров эти работы пока не имеют, поскольку разделения глицеридов с разностью числа двойных связей Δе = 1 не происходило [640].

Отдельные пики хроматограммы идентифицировали при помощи стандартов или после препаративного выделения [350, 638]. В последнем случае газовый поток на выходе колонки делили, направляя 90% пробы в коллектор. При фракционировании искусственных смесей были получены достаточно однородные триглицериды, но фракции, выделенные из природных жиров, были в той или иной мере загрязнены соседними глицеридами. Загрязнение вызывалось сложностью точной синхронизации детектора и коллектора при отделении расположенных рядом острых пиков и трудностью точной регулировки температуры в соединениях между испарительной камерой, колонкой и коллектором [594, 639]. За 10—20 инъекций собирали 10—50 мг глицеридов, которые затем очищали от вынесенной из колонки жидкой фазы адсорбционной хроматографией; продукты окисления глицеридов в хроматографическом элюате отсутствовали [71, 594]. Выход более летучих фракций составлял 95% и выше, а глицериды с m > 48 сильно поглощались в колонке [594, 640]. Выделенные триглицеридные фракции подвергали дальнейшему исследованию (см. табл. 1, стр. 16). <\br> Для количественного определения триглицеридов обычно служит пламенно-ионизационный детектор. В отличие от катарометра, он достаточно чувствителен к этим соединениям, а по сравнению с аргоновым детектором значительно более устойчив к засорению жидкой фазой, уносимой из колонки [233]. При вычислении площадей пиков методом триангуляции или интегрирования обычно принимают в расчет только «четные» компоненты; минорные пики триглицеридов, содержащих «нечетные» или разветвлен-

Рис. 5. Зависимость калибровочных факторов от числа атомов углерода простых насыщенных триглицеридов Условия разделения см. стр. 91

ные кислоты, учитывают редко [640]. Расчет пиков сложного состава основан на допущении, что независимо от величины е равные концентрации глицеридов с одинаковым m дают одинаковый сигнал детектора. Правильность этого предположения была показана путем количественного определения триглицеридов до и после гидрирования природной смеси [351, 590—598]. Разделение глицеридов, особенно их высших гомологов, как правило, связано со значительной потерей вещества в колонке или в испарительной камере, поэтому для определения углеродного состава необходима тщательная и повторная калибровка детектора по каждому компоненту. Простое добавление внутреннего стандарта обычно не достигает цели, поскольку глицериды стандарта могут также задерживаться колонкой [590, 639]. В случае препаративного разделения для оценки потери сравнивают жирнокислотный состав пробы, найденный непосредственно, с вычисленным из состава кислот в отдельных глицеридных пиках [638]. Для аналитического разделения наилучшие результаты дала калибровка со смесью известных количеств 16 однокислотных «четных» триглицеридов с m = 36—54; расчет глицеридного состава вели при помощи относительных поправочных факторов f_w и f_m (рис. 5), равных соответственно отношению вес% или мол% данного глицерида в смеси к площади его пика, выраженной в % от суммарной площади пиков. Для трилаурина, который обычно не поглощается колонкой, значения f_w и f_m принимали равными единице и соответственно вычисляли относительные факторы для других глицеридов. На колонке с ΔС = 1,6 линейная зависимость между введенным количеством тристеарина и его найденным содержанием, рассчитанным путем умножения площади соответствующего пика на f_w, наблюдалась в диапазоне 2—20 мкг. Следовательно, в указанных пределах потеря тристеарина была пропорциональна весу введенной пробы. Как показывает рис. 5, глицериды до тримиристина <\br> (m = 42) включительно почти не поглощаются колонкой; с увеличением m с 42 до 56 пропорциональная поглощению величина f_w возрастает. Потеря насыщенных и ненасыщенных высших триглицеридов могла достигать 25—50%, причем для тристеарина и триэруцина эта величина составила 6 и 24% соответственно [639]. В работах лаборатории Куксиса потерю триглицеридов природных жиров характеризовали величиной возврата атомов углерода триглицеридов после газохроматографического разделения Y = Y_ex × 100/Y_t, где Y_ex — найденное число атомов С в 100 молекулах триглицеридов, Y_t — рассчитанное число атомов С в 300 молекулах жирных кислот, которые получены омылением 100 молекул триглицеридов. При расчете учитывали только «четные» жирные кислоты, причем насыщенные и ненасыщенные кислоты с одинаковым m рассматривали как одну кислоту. Если в углеродном составе кислот данного жира содержится n видов кислот с длиной цепи m₁, m₂, ..., mₙ атомов углерода и концентрацией (в мол%) M₁, M₂, ..., Mₙ, то Y_t = 3 [(M₁m₁) + (M₂m₂) + ... + (Mₙmₙ)]. Если углеродный состав глицеридов того же жира, найденный по данным их газохроматографического определения, насчитывает n' различных фракций (например, C₅₂, C₅₄ и т. д.), у которых суммарное количество атомов углерода равно m'₁, m'₂, ..., m'ₙ', а концентрация (в мол%) M'₁, M'₂, ..., M'ₙ', то Y_ex = M'₁m'₁ + M'₂m'₂ + ... + M'ₙ'm'ₙ'. Точность анализа можно также оценить сравнением рассчитанного (m_t = Y_t/300) и экспериментально найденного (m_ex = Y_ex/300) среднего числа атомов углерода жирнокислотного остатка триглицерида. Найденные и вычисленные величины для сливочного масла, кокосового масла и других растительных и животных жиров с преобладанием кислот с m = 8—14 или с m = 16—24 совпадали в пределах 96—100%. Суммирование данных анализа отдельных фракций молекулярного дистиллята молочного жира также привело к результату, в основном отвечающему углеродному составу жира до дистилляции [590, 592—598].

Для определения других категорий состава кроме углеродного состава газо-жидкостную хроматографию триглицеридов необходимо сочетать с другими методами анализа (см. табл. 1) [212, 558, 590]. Так, установление U-видового состава в 5—20 мг жира требует предварительного окисления триглицеридов по Рудлоффу (стр. 45) и этерификации диазометаном СООН-групп образовавшихся моно-, ди- и триазелаотриглицеридов. Окисление хлопкового, оливкового и соевого масел не приводило к гидролизу сложноэфирных групп при остатке глицерина. Метиловые эфиры азелаоглицеридов, имеющие меньший, чем у исходных триглицеридов, молекулярный вес, разделяли на колонке длиной 1,2 м в программированном температурном режиме. При идентификации пиков исходили из того, что по величине инкремента Vᵣ остаток азелаиновой кислоты эквивалентен лаурату. Сочетание разделения азелаоглицеридов с их препаративным выделением и липаз- <\br> ным гидролизом позволяет определить позиционно-U-видовой состав триглицеридов. Для расчета мол% азелаоглицеридов площадь каждого пика делили на m. После калибровки пламенно-ионизационного детектора с каждым азелаоглицеридом были получены точные количественные данные состава их смеси (± 0,5%). Весь анализ занимает 4 часа. Этот метод особенно применим к жирам, содержащим только жирные кислоты с m = 16 и 18, поскольку при газо-жидкостной хроматографии без предварительного окисления эти жиры обычно дают не более 2—3 главных глицеридных пиков. Разделение в виде азелаоглицеридов позволило определить внутри каждого из S₃-, S₂U- и SU₂-типов 14 растительных и животных жиров до 10 различных компонентов, отличающихся разными сочетаниями стеарата и пальмитата. Свиной жир после окисления дал 24 пика (рис. 6) [913, 915, 1010].

Газовая хроматография азелаоглицеридов не обеспечивает разделения триглицеридов с одинаковым m, но разным е [606]. Поэтому для определения углеродно-фракционного и видового состава жира требуется сочетание газо-жидкостной хроматографии природных триглицеридов (без окисления) с их предварительным разделением на адсорбенте, пропитанном AgNO₃ [248, 318]. Непосредственное определение этих категорий состава газохроматографическими методами невозможно из-за отсутствия достаточно термостойкой полярной жидкой фазы. Каждую из выделенных в тонком слое глицеридных фракций определяли количественно методом внутреннего стандарта, устанавливали ее жирнокислотный состав, а затем элюировали с адсорбента и подвергали препаративному газохроматографическому разделению [639]. В некоторых случаях полученные препараты были достаточно просты для того, чтобы позиционный состав их ацилов можно было определить липазным гидролизом [273, 594]. Однако для большинства природных жиров глицеридный состав внутри выделенных препаратов отличается сложностью. Поэтому даже в сочетании с фракционированием по величине е количественное определение этого состава не представляется возможным, так как число неизвестных величин превышает число независимых уравнений, которые можно составить из данных анализа [558]. В подобных случаях в расчет вводят допу-

Рис. 6. Газо-жидкостные хроматограммы метиловых эфиров азелаоглицеридов, полученных окислением свиного жира а — исходный жир; б—е — фракции жира с 0, 1, 2, 3 и 4 двойными связями соответственно, полученные хроматографией комплексов триглицеридов с ионами Ag⁺. Пики хроматограмм: 1 — S₃Az₃; 2 — П₂Az₂; 3 — C₂Az₂; 4 — ПСAz₂; 5 — ПС₂Az; 6 — C₃Az + П₃; 7 — П₂С; 8 — ПС₂ <\br> щения (стр. 17) [638, 639]. Так, масло Virola surinamensis разделили на 28 компонентов, ни один из которых не был отдельным глицеридным видом. Для расчета видового состава этого масла вычислили все возможные для е, m и жирнокислотного состава данного типа триглицериды, затем исключили из расчета триглицериды, содержащие минорные жирные кислоты, и, наконец, установили минимально и максимально возможные величины содержания главных триглицеридов масла [233, 350]. Для предварительного фракционирования триглицеридов применяют также кристаллизацию [212, 590].

Газо-жидкостная хроматография моно- и диглицеридов осуществляется только после перевода их в летучие производные, например ацетаты. В виде ацетатов удалось разделить моноглицериды до моноарахина и диглицериды до пальмитомиристина. При этом ацетаты 1 (3)-моно- и 1,3-диглицеридов элюировались позже, чем производные 2-моно- и 1,2 (2, 3)-диглицеридов соответственно [410]. Для определения 2- и 1(3)-моноглицеридов в их смеси последние разрушали периодатным окислением, а 2-изомеры хроматографировали в виде аллиловых эфиров жирных кислот [670]. Этот метод может найти применение при изучении специфического гидролиза триглицеридов липазой поджелудочной железы [160].

Для количественного определения продуктов липазного гидролиза триглицеридов, содержащих кислотолабильные группы в алифатической цепи, использовали также газо-жидкостную хроматографию оставшихся нерасщепленными триглицеридов и триметилсилильных (ТМС) производных моно- и диглицеридов и свободных жирных кислот. Для получения ТМС-производных к продуктам гидролиза прибавляли 20%-ный раствор бис-(триметилсилил)ацетамида в пиридине. Смесь простых ТМС-эмиров моно- и диглицеридов и сложных ТМС-эфиров жирных кислот

  CH₂OH             OSi(CH₃)₃
  |                  |
R-CO-O-CH + RCOOH + 3CH₃-C=N-Si(CH₃)₃ →
  |                  |
  CH₂OH              CH₂OH

  CH₂O-Si(CH₃)₃
  |
→ R-CO-O-CH + R-CO-O-Si(CH₃)₃ +
  |
  CH₂O-Si(CH₃)₃
+ 3CH₃-CO-NH-Si(CH₃)₃

сразу же разделяли в программированном температурном режиме. Этот метод служил для позиционного анализа глицеридов вернолиновой кислоты, содержащей цис-12,13-эпоксидную группу, диморфеколиновой кислоты, содержащей транс-10,12-диен-9-ольную группу, и α-элеостеариновой (9-цис, 11-транс, 13-транс-октадекатриеновой) кислоты; продукты распада, образующиеся при использовании других методов силилирования, здесь не обнаруживались [924]. <\br> Можно видеть, что газо-жидкостной хроматографии триглицеридов свойственны как недостатки, так и преимущества. На имеющихся в настоящее время жидких фазах невозможно разделить между собой преобладающие в природных жирах ненасыщенные триглицериды, а также триглицериды, изомерные по положению ацильных групп. Для разделения триглицеридов требуется высокая температура, что приводит к значительным потерям глицеридов в колонке. Воспроизводимость метода в целом еще недостаточна. С другой стороны, газохроматографический анализ триглицеридов отличается высокой чувствительностью, дает возможность получить достаточно достоверные количественные данные и может быть автоматизирован. При анализе природных жиров использование этого метода наиболее оправдано в случае смесей с широким диапазоном m, например сливочного или кокосового масла. В то же время нельзя сомневаться в применимости газовой хроматографии ко всем природным триглицеридам. Последовательно сочетая различные методы разделения, можно получить глицеридные фракции значительно более простого состава, чем исходный жир. На этом этапе анализа триглицериды можно разделить газохроматографически с наибольшей пользой [212, 351, 590, 606]. В будущем газовая хроматография триглицеридов, по-видимому, сможет стать прочной методической основой для создания теорий распределения ацилов в природных жирах [208].

Последние годы ознаменовались быстрым развитием газохроматографического метода в теоретическом и экспериментальном направлениях, а также широким применением этого вида хроматографии к изучению разнообразных проблем химии и биохимии липидов.

Тем не менее газохроматографическое разделение не является универсальным средством, которое позволяло бы решать любые вопросы, поставленные развитием науки перед исследователем. Этот метод, как было указано выше, имеет определенные ограничения. Однако при сочетании газо-жидкостной хроматографии с тонкослойной, распределительной и другими разновидностями хроматографии, а также с нехроматографическими методами анализа можно решить большинство проблем, возникающих при изучении химического строения и биохимических превращений липидов.

Глава 4. ДРОБНАЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

РАННИЕ РАБОТЫ ПО КРИСТАЛЛИЗАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Для исследования глицеридного состава твердых жиров дробная кристаллизация из растворителей (ацетона и др.) при низких положительных температурах использовалась еще в середине ХІХ в. Следовательно, она представляет собой самый ранний метод исследования триглицеридов, позволивший в тот период путем сотен повторных кристаллизаций выделить чистый трипальмитин и тристеарин [244, 646]. До середины 20-х годов ХХ в. многократная кристаллизация применялась почти исключительно для качественной идентификации отдельных видов триглицеридов без количественной оценки их содержания [208]. Эти работы позволили еще в 1897 г. выделить из природного источника первый смешанный триглицерид олеодистеарин и показать, что большинство глицеридов жиров и масел (всего охарактеризовали 25 триглицеридов) относится к смешанно-кислотным. Простые триглицериды, например трилаурин в масле лавра, встречались значительно реже. Сейчас кристаллизацию используют и как аналитический метод для определения типового состава природных жиров [315, 368].

При охлаждении растворов триглицеридов в безводном ацетоне и других растворителях растворимость триглицеридов снижается, и ниже температуры плавления может выпасть осадок наименее растворимых компонентов данной глицеридной смеси. При этом глицериды близкого состава легко образуют эвтектические смеси [473], поэтому эффективность разделения повышается при увеличении длительности массообмена между кристаллической и жидкой фазами вплоть до установления равновесия [208, 368, 689]. Существующие схемы разделения глицеридов методом кристаллизации основаны, с одной стороны, на данных растворимости триглицеридов, а с другой — на теории идеальных растворов, которая применима к расплавам и растворам природных жиров. Процесс кристаллизации включает два этапа: собственно кристаллизацию и отделение твердой фазы системы от жидкой. Сначала молекулы глицеридов образуют пространственную сеть в виде параллельных плоскостей, которая сохраняется в течение некоторого времени и после расплавления жира (стр. 141). В соответствии с фазовой диаграммой Гиббса, триглицериды в твердой и жидкой фазах системы различны по составу. Однако равновесия между фазами и их полного разделения достичь весьма трудно. Поэтому получаемые кристаллы обычно являются смешанными, т. е. содержат не индивидуальные триглицериды, а группы глицеридов [840]. Игольчатые кристаллы триглицеридов представляют собой <\br> моноклинные призмы. Фракционирование смеси СОО, ССЛ и ССО показало, что скорость образования кристаллического осадка зависит от содержания насыщенных ацилов в молекуле, а не от числа двойных связей. Этот вывод был подтвержден опытами с продуктами переэтерификации перечисленных глицеридов, а также с подсолнечным маслом и говяжьим жиром [819, 1009].

Вначале работы по качественной идентификации отдельных видов триглицеридов при помощи дробной кристаллизации проводились только с твердыми жирами. Жидкие ненасыщенные компоненты жира не образуют осадка при положительных температурах. Перевод жидких глицеридов в твердое состояние путем полного или частичного гидрирования или элаидирования их двойных связей позволил получить осадок этих триглицеридов [208]. При помощи гидрирования идентифицировали ряд ненасыщенных глицеридов в маслах рапса, какао и чаульмугры. По содержанию тристеарина в продуктах реакции можно было судить о концентрации три-C₁₈-триглицеридов в исходных растительных маслах; при низком уровне пальмитата в масле этот метод давал менее четкие результаты [646]. Кристаллизацией гидрированного молочного жира при 55° выделили глицеридную фракцию с m ≥ 26, обогащенную остатками масляной кислоты. Кристаллизация не сопровождается миграцией ацилов [248]. Осаждение бромированных триглицеридов высыхающих масел из ацетона или спирта позволило получить данные об их качественном составе [365, 366], а аналогичные опыты с маслом семян Sapium sebiferum дали и количественные результаты [747]. Наконец, элаидирование селеном при 220° в сочетании с кристаллизацией из ацетона использовали для изучения глицеридного состава миндального масла [368]. Сейчас все эти методы имеют только исторический интерес [368].

НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ПО ХИЛДИТЧУ

Результаты кристаллизации при положительных температурах были в основном качественными [606, 955]. Первым количественным методом кристаллизации триглицеридов, содержащих главным образом жирные кислоты с соотношением m : е, равным 18 : 1, 18 : 2, 18 : 0 и 16 : 0, стало систематическое количественное осаждение при низких температурах [332, 360], которое ранее [148] было разработано Брауном для определения жирнокислотного состава жиров. Этот метод, предложенный Хилдитчем, позволивший получить значительную часть современных данных о глицеридном составе, основан на выдерживании 5—10%-ного раствора жира в безводном ацетоне, эфире или петролейном эфире в течение 4—24 час. в твердой углекислоте при постоянном перемешивании, исключающем переохлаждение и обеспечивающем оптимальные условия теплопереноса. Возникший осадок многократно перекристаллизовывают, ступенчато повышая температуру осаждения [362, 826]. Ниже представлена схема низкотемпературной <\br> кристаллизации масла арахиса (цифры перед скобками — вес фракции в г; цифры в скобках — иодное число фракций; Е — эфир; А — ацетон; А — Е — конечные фракции).

Для фракционирования менее ненасыщенных триглицеридов предпочтительнее постепенно понижать температуру раствора, отбирая каждый раз выпавший осадок [473, 884]. Для успешного разделения глицеридов необходимо строго контролировать все условия процесса, поддерживать одинаковую концентрацию триглицеридов на всех стадиях кристаллизации и добавлять антиоксиданты в каждый раствор. Перекристаллизацию при одной и той же температуре продолжают до тех пор, пока не будет получен осадок с постоянным жирнокислотным составом. Этот состав определяют обычными методами (см. табл. 1, и, л, м) [478]. Был описан прибор для проведения систематической низкотемпературной кристаллизации; однако этот прибор не получил широкого распространения. Имеющиеся количественные данные проверяли независимым анализом исходного жира и отдельных кристаллических фракций (см. табл. 1) [67, 257, 819]. Типовой, а иногда и видовой состав триглицеридов каждого осадка вычисляли, допуская, что в данной фракции содержится только бинарная смесь двух соседних типов: S₃ + S₂U при [S] > 66%, S₂U + SU₂ при [S] = 33—66% или SU₂ + U₃ при [S] < 33% [249, 658]. <\br> Точность анализов типового состава методом кристаллизации зависит от сложности жирнокислотного состава пробы и соотношения растворимостей отдельных глицеридов в данном растворителе [819]. Независимая проверка показала, что для жиров с [S] > 30% точность может достигать ± 2%, а для жидких масел обычно получаются заниженные величины [Л₂], [Лез] и других U₃-глицеридов [658, 826, 923]. Как правило, систематическая низкотемпературная кристаллизация не приводит к получению отдельных видов триглицеридов, хотя крайние фракции могут различаться по величине иодного числа в 4—10 раз и более [258, 747, 862]; тем не менее кристаллизация как простой метод предварительного фракционирования природных жиров в мягких условиях была использована для разделения триглицеридов в нескольких десятках жиров и масел [45, 366, 562, 772]. Этот же метод был применен для промышленного фракционирования жидких растительных масел на высоконенасыщенное высыхающее техническое масло и на более насыщенное пищевое масло [257, 300, 367, 884]. Кристаллизацию использовали и для разделения гидрированных жиров [714].

Таким образом, кристаллизация по Хилдитчу представляет собой эмпирический метод полуколичественного определения типового состава триглицеридов, в котором для каждого нового жира требуется построение собственной схемы процесса, а количественный выход той или иной фракции нельзя предсказать заранее [368]. Недостаточная эффективность кристаллизации вызвана сильным растворяющим действием SU₂ и U₃ по отношению к более насыщенным типам и друг к другу [361]. Так, нерастворимые в ацетоне при 0° S₂U-глицериды выделили кристаллизацией масла какао и свиного жира, которые богаты триглицеридами этого типа. Были получены концентраты S₂O с иодным числом 31—35, которые сравнением с синтетическими образцами идентифицировали с 2-ОПС и 2-ПОС соответственно [181]. В то же время из ацетонового раствора жира с [U₃]/[SU₂] > 5, например масла арахиса ([S₂U] = 10%), осадок S₂U получить вообще не удается [317]. Именно взаиморастворяющим действием триглицеридов объясняется то, что в кристаллическом осадке обычно содержатся глицериды не двух соседних типов, как принималось первоначально, а трех или даже четырех [951]. Ошибки при количественном определении приводят к получению значений [S₃], не подтверждаемых независимыми методами, к заниженным величинам [U₃] и [S₂U] и к завышенным величинам [SU₂] [458, 474, 824]. Кроме использования не всегда убедительных предположений к недостаткам низкотемпературной кристаллизации относятся большая трудоемкость и длительность анализа, который занимает иногда несколько месяцев и требует большого количества жира и растворителей, а также низкая эффективность разделения (много ниже предсказанной из соотношения растворимостей) по сравнению с современными методами [476, 608].

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Недостатков метода Хилдитча в значительной степени лишен метод кристаллизации по Картха. Этот метод, правда, не ставит целью полный анализ типового состава, а ограничивается выделением S₃ с m кислот ≥ 16 путем их осаждения из 13—25%-ного раствора жира в ацетоне при 25°. Параллельно определяют содержание S₃ окислительным методом (стр. 157) и средний молекулярный вес составляющих S₃ жирных кислот [470, 478, 487]. Хотя полученная величина [S₃] совпадала со значением [S₃]к, вычисленным по теории Картха (К) из [S] и температуры плавления жира (см. ниже) [488, 748], позднее было показано, что этот метод нельзя считать вполне надежным, поскольку в осадке S₃ содержалась примесь S₂U-глицеридов [606, 950].

В дальнейшем Картха установил, что для определения величины [S₃] в жирах, богатых насыщенными кислотами с m = 16—18, выделение S₃ кристаллизацией не обязательно [478]. На основе теории идеальных растворов эту величину можно вычислить из температуры плавления триглицеридов (Т_тг) жира, температуры плавления полученных его омылением жирных кислот Т_жк и статистической (RD) концентрации [S₃]RD, рассчитанной из найденного значения [S] жира [758, 759]. Зависимость Т_тг от [S₃] была впервые открыта при исследовании масла какао и бараньего жира; при одинаковом уровне [S] ≈ 60% эти жиры резко различаются по величине Т_тг (30 и 50° соответственно) вследствие разного содержания S₃ (2 и 26%) [860]. Имеется корреляция между [S₃] данного жира и значением разности точек плавления ΔТ = Т_тг — Т_жк: при [S₃] ≈ [S₃]RD величина ΔТ ≈ 2°, а при [S₃] < [S₃]RD эта величина становится отрицательной [689]. Для оценки степени отклонения глицеридного состава от статистического уровня служит число Бёмера, равное сумме Т_тг + 2ΔТ. При переэтерификации жидких масел, где [S₃] < [S₃]RD, число Бёмера и Т_тг значительно повышаются: Т_тг соевого масла на 12°, хлопкового на 24°, оливкового на 10°, ненасыщенной фракции говяжьего жира — на 18° [691, 928]. Наоборот, если уровень S₃ превышает статистический, то переэтерификация приводит к снижению Т_тг (смесь О₃ и П₃, натуральный и гидрированный свиной жир, говяжий жир, гидрированное растительное масло) [147]. Было показано, что при повышении вдвое уровня S₃ кислот с m = 16—18 в ненасыщенных глицеридах величина Т_тг возрастает на 5,8°. Установление этой закономерности позволило вывести формулу [S₃]к = = (0,5 [S₃]RD) ΔT/5,8 [475, 478]. Вычисленные по этой формуле величины [S₃]к для большинства изученных жиров, кроме молочного жира, богатого кислотами с m = 4—14, совпадали со значениями [S₃], найденными по весу кристаллического осадка, состоящего из S₃ [110, 493]. Температуру плавления T_s этого осадка можно также использовать для установления величины [S₃] в триглицеридах жирных кислот с m = 16—18: если разность T_s — Т_тг пре- <\br> вышает 23,6; 26,8 и 30,0°, то уровень [S₃] в жире соответственно ниже 0,4; 0,2 и 0,1 вес% [478].

Кристаллизация смесей ненасыщенных триглицеридов в виде их координационных комплексов с ионами Ag⁺ в большей степени снимает действие взаиморастворения и повышает эффективность разделения. Осаждением 15—20%-ного раствора триглицеридов масла Jatropha multifida в смеси ацетона и 2,5%-ного раствора AgNO₃ в метаноле (3 : 7) при —10° получали фракцию S₂U, а осаждением при —70° фракцию SU₂ с примесью U₃; фракцию U₃ извлекали из надосадочной жидкости. Степень чистоты полученных фракций (рис. 7) достаточно высока [317, 321].

Значительно превосходит по эффективности обычную кристаллизацию и кристаллизация в термоградиенте, принцип которой состоит в пропускании смеси триглицеридов через наполненную сорбентом вертикальную колонку с понижающимся линейным градиентом температуры при помощи растворителей с возрастающей элюирующей способностью; в результате глицериды по мере движения непрерывно осаждаются и сразу же повторно растворяются в элюенте [672]. Для разработки теории термоградиентной кристаллизации постулировали, что для группы близких по составу триглицеридов отклонения их растворимости от идеальной приблизительно одинаковы и что, следовательно, их разделение в колонке можно предсказать на основе теории идеальных растворов. Согласно этой теории, ln (1/S) = ΔH (1/Т — 1/Т_тг)/R, где S — молярная доля глицерида; ΔН — его теплота плавления; Т — абсолютная температура; R — газовая постоянная. Если для простых триглицеридов ΔH = 3 [(m—2) a + b] и ΔH/Т_тг = 3 [(m—2) c + d], где m — число атомов углерода в одной ацильной группе, а, b, c и d — константы, то для смешанно-кислотных глицеридов с длиной одного ацила m₁ и m₂ справедливо уравнение ln (S₂/S₁) = 3 (m₁ — m₂) [(a/T) — c]/R, где S₂/S₁ — соотношение растворимостей, возрастающее прямо пропорционально m₁ — m₂ и обратно пропорциональное T. Если принять а = 1,06 ккал/моль

Рис. 7. Тонкослойная хроматограмма триглицеридов масла семян Jatropha multifida и отдельных фракций триглицеридов в виде их комплексов с ионами серебра а — маточная жидкость, содержащая U₃; б — кристаллическая фракция SU₂ (—70°); в — кристаллическая фракция S₂U (—20°) <\br> и с = 0,00269 ккал/моль, то легко показать, что при 0—10° разделяются простые глицериды с m₁ — m₂ ≥ 2 и смешанно-кислотные глицериды с m₁ — m₂ ≥ 4. Можно считать, что при S₂/S₁ ≥ 19 разделение обеспечено, если оно не ограничивается образованием эвтектических смесей, которое нельзя предсказать заранее; при m₁ — m₂ ≥ 4 и е₁ — е₂ ≥ 1 эвтектики почти не мешают. Если же эвтектическая смесь уже образовалась, то ее состав можно рассчитать по теории идеальных растворов. Так, для тройной смеси (температура плавления — Т₄) из СОС, ПОС и ПОП масла какао с температурой плавления Т₁, Т₂ и Т₃ и теплотой плавления ΔH₁, ΔH₂ и ΔH₃ соответственно [COC] + [ПОС] + [ПОП] = 1 и ln [COC] = (ΔH₁/R) (1/T₁ — 1/T₄). Аналогичные уравнения можно составить для [ПОС] и [ПОП]. Решение этих уравнений позволяет установить, что концентрации соответствующих глицеридов в эвтектической смеси с температурой плавления 33,7° составляют 11,6; 44,7 и 43,7%. В наполненной ацетоном колонке с градиентом 35—10° путем элюирования петролейным эфиром частично разделили бинарную смесь трипальмитина и трилаурина, причем последний был загрязнен 5—8% П₃, растворимость которого в ацетоне оказалась в 20—25 раз выше теоретической. При разделении ППП и ОПП или П₃ и М₃ загрязнение более растворимого компонента было еще выше. Степень разделения глицеридов какао методом термоградиента была той же, что и при повторной низкотемпературной кристаллизации [714]; отдельные фракции были обогащены S₂U и SU₂, но фракции, содержащие отдельные типы триглицеридов, выделить не удалось. Полное разделение U₃ и S₂U не происходило. Таким образом, термоградиентную кристаллизацию нельзя считать стандартным методом [458, 672].

В отдельных работах кристаллизацию применяли для определения [S₃] в жировой ткани крыс и цыплят методом изотопного разведения по уравнению [S₃] = {Wₕ [(Aₖ — Aᵤₖ) — 1] — w₀}/(W × 100), где Aₖ и Aᵤₖ — радиоактивность стандарта и осадка, Wₕ, W и w₀ — вес стандарта, пробы и глицеридов типа S₂U в осадке соответственно. Стандартом служил трипальмитин-C¹⁴ (П₃) [817]. Достоверность полученных данных была поставлена под сомнение на том основании, что П₃ мог при кристаллизации переходить в другие фракции, поскольку S₃ изученных жиров не являются чистым трипальмитином [497]. Однако обычно различия между эндо- и экзогенными S₃ по жирнокислотному составу не столь велики, чтобы существенно повлиять на точность результатов [818].

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЗИЦИОННЫХ КАТЕГОРИЙ СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ. ПОЛИМОРФИЗМ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

В этом разделе рассматриваются результаты исследований в области позиционного распределения ацилов в триглицеридах. Работы по переэтерификации впервые обнаружили нестатистический характер строения природных жиров. Затем методами полиморфизма и липазного гидролиза была установлена неэквивалентность 1,3- и 2-положений глицеридов. Наконец, в последнее время было открыто асимметрическое распределение жирных кислот в крайних положениях триглицеридов животных и растений.

Глава 5. УСТАНОВЛЕНИЕ НЕСТАТИСТИЧЕСКОГО ХАРАКТЕРА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АЦИЛОВ В ПРИРОДНЫХ ТРИГЛИЦЕРИДАХ МЕТОДОМ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ

ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Остатки жирных кислот, находящиеся в молекулах сложных эфиров, при определенных физических и химических воздействиях могут вступать в реакции ацильной миграции: отрываться от исходных молекул, перемещаться и образовывать новые сложные эфиры. Реакция сложного эфира со свободным спиртом называется алкоголизом. Один из видов алкоголиза (метанолиз) был описан ранее (стр. 68). Ниже в этой главе рассматривается другая разновидность алкоголиза — глицеролиз, состоящий в образовании больших количеств моно- и диглицеридов при взаимодействии триглицеридов с избытком глицерина. Если же происходит обмен ацилами между разными сложными эфирами, то протекающая при этом реакция называется реакцией переэтерификации. Переэтерификация может быть между двумя молекулами сложных эфиров одноатомных спиртов, между эфирами одно- и многоатомных спиртов и, наконец, между двумя сложными эфирами многоатомных спиртов, в частности между триглицеридами. В данной главе описывается в основном эта последняя разновидность переэтерификации. Как исходными, так и конечными продуктами этой реакции являются триглицериды; в зависимости от того, мигрируют ли ацилы внутри одной глицеридной молекулы или же между разными молекулами глицеридов, различают соответственно интра- и интермолекулярную переэтерификацию триглицеридов. В результате переэтерификации природных или синтетических триглицеридов между собой распределение ацилов в триглицеридах становится статистическим («random distribution», RD). Поэтому такая переэтерификация триглицеридов называется еще рандомизацией [208, 689]. <\br> Работы по рандомизации, начавшиеся в 1925 г., показали, что переэтерификация сильно изменяет точку плавления и иные свойства природных жиров и масел. Чтобы понять непосредственные причины наблюдающихся изменений, потребовалось изучение строения триглицеридов исходных жиров природного происхождения.

Поэтому реакция рандомизации является первым по времени методом исследования структурной химии природных триглицеридов. Наряду с теоретическим проблема переэтерификации имеет и крупное практическое значение. Как уже отмечалось выше, полиморфизм, температура плавления, текстура, диапазон пластичности и другие свойства жира при его рандомизации сильно изменяются. Это оказывает значительное влияние на перевариваемость жира и его пригодность для производства маргаринов, моноглицеридных эмульгаторов и различных технических продуктов с заданными свойствами [298, 517, 729, 758].

Для переэтерификации используют жир, не содержащий влаги, жирных кислот и перекисей [298]. Проведение рандомизации без катализатора требует высокой температуры (300°) [517]. Применяют щелочные катализаторы (метилат натрия, бутилат натрия), кислые (например, β-нафтилсульфокислота), а также олово и его соединения (Sn, SnCl₂ или Sn (ОН)₂). Наибольшую скорость реакции обеспечивает метилат натрия. Содержание катализатора в смеси составляет 0,005—1%, а температура процесса 100—200° (в отсутствие растворителя) или 30—60° (при рандомизации в гексане или диметилформамиде) [130, 146, 758]. Статистическую смесь триглицеридов, содержащих остатки высших жирных кислот и уксусной кислоты, можно получить переэтерификацией метиловых эфиров жирных кислот в присутствии триацетина [107]. Переэтерификация смеси масла какао с тристеарином-C¹⁴ и Н³-пальмитиновой кислотой дает смесь равномерно меченых C¹⁴- и Н³-триглицеридов [259]. При высокой температуре полной рандомизации триглицеридов получить не удается; проведение реакции в более мягких условиях приводит к получению чисто статистической глицеридной смеси [598] (число и концентрацию возможных триглицеридов этой смеси см. на стр. 152). По окончании реакции катализатор нейтрализуют, а триглицериды подвергают очистке [174]. На основе правила мультипликаторов Лагранжа можно показать, что для системы из двух жирных кислот А и В максимальная величина [A₂B]RD достигается при [А] = 2 [B]: тогда [А₂В] = 44,4%, [A₃] = 29,7%, [AB₂] = 22,2% и [В₃] = 3,7%. Эти закономерности используются в подборе концентраций жирных кислот для синтеза смеси глицеридов нужного состава [82, 689].

Как уже упоминалось, переэтерификация природных жиров приводит к значительным изменениям в свойствах, составе и строении их триглицеридов. Число Бёмера и температура плавления изменяются в зависимости от отклонения [S₃] данного жира от статистического уровня (стр. 102) [298]. Заметные изменения <\br> Рис. 8. Углеродный состав триглицеридов нативного молочного жира 1 — статистический; 2 — найденный; 12—56 — число атомов углерода в отдельных фракциях

происходят и в фазовой структуре триглицеридов. Так, в быстро застывшем расплаве натурального свиного жира, содержащего 25% 2-ПОС, образуются крупные грубые кристаллы β'-3-полиморфной формы этого глицерида (стр. 148), что препятствует использованию этого жира в кондитерском производстве. После переэтерификации благодаря снижению [2-ПОС] до статистического уровня (3,4%) и возникновению легкоплавких S₂U-глицеридов «растительного» типа, кристаллизующихся в β'-2-форме, зернистость продукта исчезает и эмульгирующая способность жира улучшается (стр. 149) [663, 689]. Изменения свойств жира

Рис. 9. Углеродный состав триглицеридов переэтерифицированного молочного жира Обозначения те же, что на рис. 8 <\br> Рис. 10. Жирнокислотный состав фракций, полученных противоточным распределением природного масла какао М — вес суммы метиловых эфиров

Рис. 11. Жирнокислотный состав фракций, полученных противоточным распределением переэтерифицированного масла какао М — то же, что на рис. 10

в нужную сторону можно также достичь путем направленной переэтерификации, при которой рандомизация жидких растительных масел типа хлопкового сочетается с низкотемпературной кристаллизацией, непрерывно удаляющей из смеси насыщенные кислоты в виде твердого осадка S₃ [82, 517].

Как правило, переэтерификация природных масел и искусственных глицеридных смесей приводит к увеличению общего числа различных триглицеридов фракционного состава. Например, в оливковом масле появляются новые глицериды ОПЛ и ОСЛ, а из бинарной смеси С₃ + О₃ возникает более сложная статистическая смесь ССС, ОСC, COC, COO, ОСО и ООО [174, 691]. Отдельные категории состава в переэтерифицированных жирах обычно близки к статистическому распределению независимо от наличия растворителя в реакционной смеси. В то же время селективно действующие физико-химические параметры реакции, например преимущественная реэтерификация жирных кислот с более длинной цепью или различия в реакционной способности 1 (3)- и 2-оксигрупп глицерина (стр. 109), могут вызывать более или менее значительные отклонения в распределении ацилов рандомизированного масла от вычисленного теоретически [298].

Такие отклонения наблюдаются, в частности, в углеродном составе триглицеридов переэтерифицированных жиров, богатых летучими кислотами, — кокосового масла и рандомизированного молочного жира, который заметно отличается от исходного жира по содержанию триглицеридов с m = 50—54 (рис. 8, 9) [119, 598]. <\br> Олефиновый состав равновесных смесей, полученных переэтерификацией C₃ + О₃ + Э₃ или смеси метиловых эфиров высших жирных кислот с триацетином, соответствует статистическому распределению [107, 200, 972, 973]. Определение фракционного состава показало, что при переэтерификации жидких масел (сафлорового и оливкового) он изменяется не столь значительно, как при рандомизации твердого масла какао (рис. 10 и 11) [259, 560, 859].

Из индивидуальных категорий глицеридного состава переэтерифицированных жиров подробно изучен типовой состав. Переэтерификация подсолнечного и хлопкового масел не изменяла соотношения ненасыщенных кислот в отдельных типах триглицеридов [1009]. Видовой состав оливкового масла, позиционно-видовой состав молочного жира, свиного жира, соевого и оливкового масла, а также стереовидовой состав соевого масла после переэтерификации соответствовали статистическому распределению [67, 146]. Уменьшение величины [S]₂ после рандомизации растительных масел можно использовать для обнаружения примеси масел, полученных переэтерификацией, в натуральном масле [707].

ГЛИЦЕРОЛИЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Для проведения глицеролиза жир выдерживают при высокой температуре в присутствии избытка глицерина и 0,1% NaOH в токе инертного газа. Окончание реакции и установление динамического равновесия миграции ацилов наступает в тот момент, когда реакционная смесь становится растворимой в двух — пяти частях метанола. Константу равновесия реакции глицеролиза Кₑ рассчитывают по содержанию глицерина, 1(3)- и 2-моноглицеридов (МГ), 1,3- и 1,2 (2,3)-диглицеридов (ДГ) и триглицеридов (ТГ) в продуктах этой реакции. Для анализа применяют адсорбционную хроматографию, периодатное окисление, а также определяют гидроксильное число, кислотное число и число омыления [119, 128, 701]. Полученные данные позволили установить один из кардинальных фактов химии триглицеридов — неравноценность их 1(3)- и 2-оксигрупп в реакциях ацилирования [230, 517, 729]. Действительно, если бы глицеролиз протекал строго статистически и вероятность этерификации первичных и вторичных гидроксилов была одинаковой, то по молярному содержанию этерифицированных (а) и неэтерифицированных (б) ОН-групп в смеси можно было бы легко вычислить статистические концентрации (RD) три-, ди- и моноглицеридов, а также свободного глицерина, равные а³ × 10⁻⁴, 3a²b × 10⁻⁴, 3ab² × 10⁻⁴ и b⁴ × 10⁻³ соответственно [124, 689]. В случае чисто статистического механизма в положении равновесия RₐOH + R₁OOCR ⇌ RₐOOCR + R₁OH, где RₐОН и R₁ОН — производные глицерина, содержащие свободную первичную и вторичную гидроксильную группу соответственно, соотношения молярных концентраций позиционных изомеров в моно- и диглицеридах составляли бы <\br> [1(3)-МГ]RD = 2 [2-МГ]RD; [1,2 (2,3)-ДГ]RD = 2 [1,3-ДГ]RD, а величина Кₑ, вычисленная по уравнениям Кₑ = [1(3)-МГ]RD/2 [2-МГ]RD = [1,2 (2,3)-ДГ]RD/2 [1,3-ДГ]RD, была бы равна единице. Однако найденные при обычных условиях глицеролиза (175—180°) равновесные концентрации составили [1 (3)-МГ] / [2-МГ] = 88 : 12 и [1,2 (2,3)-ДГ]/[1,3-ДГ] = 40 : 60, а найденная величина Kₑ = 3,0 ± 0,6. Следовательно, величина свободной энергии первичной ОН-группы глицерина в реакции этерификации ΔF = — RT ln Kₑ выше, чем у вторичной группы приблизительно на 1,2 ккал/моль [124, 125]. Данные о составе равновесной смеси глицеролиза, вычисленные при Кₑ = 3,4, удовлетворительно совпадают с найденными, а вычисленные при Кₑ = 1 — значительно от них отклоняются (табл. 8) [128]. Увеличение значения m и снижение величины е в ацильном остатке уменьшают скорость ацильной миграции, но не влияют на значение Кₑ и на соотношение компонентов в равновесной смеси [102]. Замещение одной из первичных ОН-групп не изменяет скорости этерификации другой первичной группы. При снижении температуры реакции величина Кₑ возрастает [230].

Таблица 8 Найденный и вычисленный состав равновесной смеси продуктов глицеролиза (в вес. %) [128]

Механизм переэтерификации и глицеролиза триглицеридов изучен еще мало. Возможно, что собственно переэтерификацию следует рассматривать как частный случай глицеролиза, когда под влиянием катализатора и следов свободных ОН-групп воды, служащих инициаторами реакции, в смеси непрерывно образуются и исчезают небольшие количества глицерина, моно- и диглицеридов и в конечном итоге возникает динамическое равновесие (рандомизация) жирнокислотных остатков [689]. Предполагают, что ацильная миграция осуществляется путем промежуточного образования циклического ортоэфира (I) [342]. <\br>

  CH₂-O-CO-R₁
  |
R₂-O-CO-CH
  |
  CH₂OH

⇌

  CH₂-O-CO-R₁
  |
  CH-O
  |    \
  CH₂-O

⇌

  CH₂-O-CO-R₁
  |
  CH-OH
  |
  HO-CH

⇌

  CH₂OH
  |
R₂-CO-O-CH
  |
  CH₂OH

⇌

  CH₂OH
  |
R₂-CO-O-CH
  |
  CH₂-O-CO-R₃

I

При изучении миграции ацилов моно- и диглицеридов в эфирном растворе НСІ обнаружилось, что для осуществления этой реакции требуется присутствие следов воды. При переэтерификации 2-моноглицеридов в реакционной смеси содержится эфир (II), а при переэтерификации 1(3)-моно- и 1,3-диглицеридов образуются соответствующие производные последних. Согласно одной точке зрения, в безводном растворе возникают равновесная смесь 2-моноглицеридов и эфира (II), а в присутствии воды простая эфирная связь гидролизуется с одновременной интрамолекулярной миграцией ацила и образованием 1 (3)-моноглицерида [157]. По мнению другого автора, эфир (II) представляет собой не промежуточный, а конечный продукт реакции, который синтезируется при взаимодействии моно- и диглицеридов с соответствующими хлоргидринами этих глицеридов, образующимися из них под действием НСІ [962].

ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ОПРЕДЕЛЕННОГО ПОЗИЦИОННО-ВИДОВОГО СОСТАВА

Наряду с переэтерификацией к числу ранних методов исследования жиров принадлежит идентификация отдельных видов природных триглицеридов путем их сравнения по точке плавления, полиморфизму и другим физическим свойствам с синтетическими триглицеридами известного состава и строения [181, 646]. Краткое описание химического синтеза одно-, двух- и трехкислотных триглицеридов приведено ниже. Однокислотные глицериды (ААА) можно получить прямой этерификацией избытка жирной кислоты глицерином в присутствии катализатора (n-толуолсульфокислоты). Синтез двух- и трехкислотных триглицеридов состоит из нескольких стадий с защитой тех или иных оксигрупп на отдельных его этапах [352, 729].

Для получения симметричных двухкислотных триглицеридов (АВА) 1,3-диглицериды кислоты А, выделенные кристаллизацией из раствора равновесной смеси диглицеридов (стр. 110), ацилируют хлорангидридом кислоты В в растворе CHCl₃ — C₅H₅N; миграция ацилов при синтезе не происходит [624]. Таким путем из <\br> олеоилхлорида и «статистической» смеси 1,3-диглицеридов пальмитиновой и стеариновой кислот синтезировали триглицериды, близкие по свойствам к маслу бобов какао [259].

  CH₂OC(C₆H₅)₂
  |
  HO-CH
  |
  CH₂OX

2RCOCl / пиридин →

  CH₂OC(C₆H₅)₂
  |
  ROCO-CH
  |
  CH₂OCOR

HCI / эфир →

  CH₂OCOR
  |
  HO-CH
  |
  CH₂OCOR

I II III

  CH₂OH
  |
  HO-CH
  |
  CH₂OH

ацетон / 1% HCI →

  CH₂O
  |    \
  CH-O
  |    /
  CH₂

C(CH₃)₂ →

  CH₂O
  |    \
  CH-O
  |    /
  CH₂OH

C(CH₃)₂ RCOCl / хинолин →

  CH₂O
  |    \
  CH-O
  |    /
  CH₂OCOR

C(CH₃)₂ IV V VI

  CH₂OH
  |
  HO-CH
  |
  CH₂OCOR

кислотный гидролиз / на холоду → VII

Для получения трудно кристаллизующихся ненасыщенных 1,3-диглицеридов (III, RCO — остаток полиненасыщенной кислоты А) 1 (3)-монотритиловый эфир глицерина (I, X = Н) ацилируют хлорангидридом этой кислоты. Последующее детритилирование продукта ацилирования II, которое сопровождается количественной миграцией среднего ацила в крайнее положение, приводит к образованию эфира III. При синтезе рацемических несимметричных глицеридов (ААВ) исходят из 1 (3)-моноглицеридов (VII, RCO — остаток кислоты В), полученных с применением 2,3 (1,2)-изопропилиденовой защиты (IV—VII). Моноглицериды VII ацилируют хлорангидридом кислоты А [680, 701].

Для синтеза рацемического трехкислотного триглицерида (АВС) сначала по механизму IV — VII получают 1 (3)-моноглицерид VII (RCO — остаток кислоты А). Последний тритилируют с образованием эфира (І, Х — остаток кислоты А), эфир І ацилируют хлорангидридом кислоты С в положение 2, и соединение ІІ при помощи ацильной миграции (см. выше) превращают в 1,3-диглицерид кислот А и С (III). На последней стадии синтеза вещество III ацилируют в положение 2 хлорангидридом кислоты В с образованием глицерида АВС. Если кислота С — ненасыщенная, то тритильную защиту в ІІ снимают гидрогенолизом без миграции ацила С. Возникший 1,2 (2,3)-диглицерид кислот А и С ацилируют хлорангидридом ненасыщенной кислоты В. Таким путем можно получить трехкислотный триглицерид АСВ, принадлежащий к типу SUU [368, 689]. Стереоспецифический синтез триглицеридов описан на стр. 126.

Глава 6. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА

РЕАКЦИЯ ЛИПАЗНОГО ГИДРОЛИЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Еще в 1945 г. было обнаружено, что липазный гидролиз жиров в кишечнике останавливается задолго до расщепления всех сложноэфирных связей [208, 212, 240, 258, 368]. Последующие опыты с синтетическими триглицеридами известного ПВС показали, что в диглицеридах, содержащихся в продуктах неполного гидролиза, преобладают 1,2 (2,3)-изомеры [201, 243]. О преимущественном отщеплении липазой поджелудочной железы именно крайних ацилов в триглицеридах насыщенных и ненасыщенных кислот с m = 12—18 in vivo и in vitro свидетельствует также включение C¹⁴-свободных жирных кислот (СЖК) в присутствии липазы и жира только в 1,3-положения триглицеридов, а также образование при липазном гидролизе 2-изомеров моноглицеридов, доказанное путем их изомеризации в присутствии хлорной кислоты и периодатным окислением [207, 265, 848—850]. На основе этих открытий в 1956 г. был предложен метод определения состава ацилов в 1,3- и 2-положениях триглицеридов природного жира по составу СЖК и 2-моноглицеридов, возникших при его ферментативном расщеплении [694]. Липазный гидролиз является сейчас главным методом структурного анализа триглицеридов [213, 656].

В отличие от различных эстераз, гидролизующих водорастворимые субстраты, липаза (гидролаза эфиров глицерина, КФ 3.1.1.3) обнаруживает почти абсолютную специфичность к ограниченно растворимым в воде сложным эфирам 1,3-ОН-групп глицерина [733], не расщепляя, например, в масле спорыньи (стр. 194) эстолидные связи, содержащиеся в цепи рицинолеата [740]. Липаза не обладает стереоспецифичностью гидролиза (стр. 122) [201]. В упрощенной форме липазную реакцию можно представить в виде двух этапов: триглицериды (ТГ) → 1,2 (2,3)-диглицериды (ДГ) → 2-моноглицериды (МГ). Каждый из этих этапов характеризуется собственной константой скорости k₁ и k₂; для масла Madhuca longifolia k₁ = 0,35, k₂ = 0,36, а для свиного жира k₁ = 0,31, k₂ = 0,36. Из уравнения реакции (е — основание натуральных логарифмов): [ТГ] = [ТГ]₀ × e⁻ᵏ¹ᵗ; [ДГ] = [ДГ]₀ + [ТГ]₀ × [k₁/(k₂—k₁)] × (e⁻ᵏ²ᵗ — e⁻ᵏ¹ᵗ); [МГ] = [МГ]₀ + [ТГ]₀ {1 — [1/(k₂—k₁)]} (k₂e⁻ᵏ¹ᵗ — k₁e⁻ᵏ²ᵗ), где t — продолжительность реакции, о — обозначение начальной концентрации ТГ, ДГ и МГ [209]. Перед гидролизом ферментный белок адсорбируется на поверхности триглицеридных мицелл, и потому скорость реакции зависит от степени эмульгирования субстрата в водном растворе, определяющей площадь этой поверхности, а также от соотношения между количествами фер- <\br> Рис. 12. Зависимость липазного гидролиза жира растения Madhuca latifolia от времени реакции 1, 4, 5 — концентрации, вычисленные по уравнениям на стр. 113; 2, 3 — концентрации, найденные экспериментально; 1 — триглицериды; 2 — моноглицериды; 3 — глицерин; 4 — моноглицериды + глицерин; 5 — диглицериды

мента и жира [846]. Возникшие при гидролизе жирные кислоты и моноглицериды десорбируются в водную фазу [733]. Поскольку из-за позиционной специфичности триглицериды на 1 моль глицерина отщепляют 2 моля кислот, 1,2 (2,3)-диглицериды — 1 моль, а 2-моноглицериды — ни одного, скорость реакции постепенно снижается [425]. Максимумы концентраций ди- и моноглицеридов наблюдаются после 40 и 70%-ного гидролиза соответственно (рис. 12). После 25—40%-ного гидролиза, вследствие ацильной миграции, в среде может появляться свободный глицерин (стр. 118) [209, 656]. Более подробные данные о свойствах, кинетике и механизме реакции панкреатической липазы содержатся в ряде обзоров [208, 212, 240, 243, 606].

УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА

Источником фермента обычно служит поджелудочный сок или препараты поджелудочной железы свиньи — панкреатин, стеапсин и др. [67, 213, 251, 740]. Ниже показан состав реакционной смеси (в расчете на 1 г жира) и обобщенные условия проведения липазного гидролиза, используемые различными исследователями при изучении строения триглицеридов [73, 146, 208, 251, 317, 368, 464, 656, 704, 733, 740, 907, 1007].

Разные препараты могут значительно различаться по активности гидролиза и позиционной специфичности, поэтому количество фермента подбирают так, чтобы достичь 65—70%-ного расщепления жира за минимальное время; специфичность препарата проверяют с синтетическими триглицеридами известного ПВС [73, 243, 656, 848, 1007]. Очистка фермента может повысить его активность в 135 раз и обычно включает обезжиривание препарата, экстракцию водой, адсорбцию на геле гидроокиси алюминия, осаждение сульфатом аммония, диализ и хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Однако концентрирование не увеличивает позиционной специфичности, поэтому для изучения глицеридов можно в большинстве случаев ограничиться второй стадией очистки по Денюэллю [203, 207, 240, 264]. Более важно удалить из препарата эндогенные липиды, а также устранить возможную актив- <\br> Параметр реакционной смеси и единицы измерения Численное значение

• Данные в скобках относятся к микромодификации метода липазного гидролиза.

ность неспецифических эстераз (если исследуются глицериды кислот с m > 12) и лишенной позиционной специфичности «липазы», которая составляет подчас 2—10% общей липазной активности, стимулируется таурохолеатом и тормозится двухчасовым выдерживанием при рН 9 и 40° [686, 691, 704, 907].

Очистке от возможной примеси моно- и диглицеридов подвергают также субстрат гидролиза — природные и синтетические триглицериды, а также другие компоненты смеси [85, 243]. Расщепляться липазой может только жидкий и хорошо эмульгированный субстрат [67, 201]. Гидролиз ненасыщенных глицеридов проводят в атмосфере N₂ (см. выше) [73]. До прибавления липазы смесь субстрата и эмульгатора гомогенизируют при нагревании. Выше 40° усиливаются ацильная миграция и инактивация фермента, поэтому для обеспечения гомогенности среды лучше применять быстрое механическое перемешивание [207, 240, 656]. Обычным эмульгатором служит таурохолеат Na, который, однако, активирует постороннюю липолитическую активность (см. выше) и оказывает еще не совсем понятное стимулирующее действие на саму панкреатическую липазу [212, 251]. Для эмульгирования применяют также полимеры — поливиниловый спирт, гуммиарабик и др. [213, 464]. Тем не менее все эти средства могут оказаться недостаточными для перевода твердых S₃-глицеридов, содержащих более 12 атомов углерода в каждой ацильной группе, в состояние эмульсии. В таких случаях глицериды приходится до эмульгирования смешивать с жидкими носителями липидной природы, которые не влияют на позиционную специфичность фермента к насыщенным субстратам [350, 369]. Использование смесей S₃ с триолеином (1 : 1 или 4 : 1) приводило к загрязнению реакционной смеси продуктами его гидролиза, поэтому сейчас носителями чаще служат метиловые эфиры — метилолеат, метилпентадеканоат и др. [85, 733, 907]. <\br> При гидролизе в макромасштабе, когда молярное соотношение жира (0,2—2 г) и буфера составляет около 1,5, рН среды по мере гидролиза быстро падает ниже оптимума (см. выше) [146, 251, 464, 656, 907]. Во избежание инактивации липазы необходимо поддерживать оптимум рН среды, добавляя концентрированный аммиак или 0,5—1 н. раствор NaOН по индикатору, либо с помощью самопишущего рН-стата. Последний позволяет непрерывно следить за ходом гидролиза и улавливать точку максимального содержания моноглицеридов в среде (рис. 12) [213, 251, 667, 740, 907]. При гидролизе в микромасштабе (1—50 мг жира) оптимум рН, как правило, обеспечивается имеющимся количеством буферного раствора, и добавление щелочи извне оказывается излишним [264, 656]. Ионы Са²⁺ (см. выше) не влияют на сам механизм реакции, но, связывая свободные жирные кислоты, значительно ускоряют ее и доводят гидролиз до получения моноглицеридов; в отсутствие Са²⁺ или в присутствии связывающего Са²⁺ фосфатного буфера образуются лишь диглицериды и в среде накапливаются свободные кислоты, что ведет к инактивации фермента [240, 243, 733]. Если от прибавления липазы до первого помутнения смеси, вызываемого выпадением нерастворимых солей кальция, прошло время t, то момент 2t соответствует максимуму концентрации моноглицеридов [212, 606]. Реакцию останавливают избытком НСІ (см. выше) и сумму липидов экстрагируют соответствующими растворителями [207, 464, 846, 964].

В табл. 1 (стр. 16) были приведены комбинированные методы анализа продуктов липазного гидролиза, применяемые для определения позиционных индивидуальных категорий триглицеридного состава (стр. 14, № 15, 17, 19 и 21). Эти продукты — нерасщепленные триглицериды, диглицериды, моноглицериды, свободные жирные кислоты и глицерин — обычно выделяют препаративной адсорбционной хроматографией [172, 207, 559, 781, 819]. Если используется адсорбент, пропитанный борной кислотой, то ди- и моноглицериды разделяются, кроме того, на симметричные (1,3- и 2-) и несимметричные (1,2 (2,3)- и 1 (3)-позиционные изомеры соответственно [132, 264]. Каждый класс липидов учитывают количественно (см. табл. 1, сноска а) и его жирнокислотный состав определяют газо-жидкостной хроматографией [46, 317, 319, 323]. Зная этот состав для исходного жира [А] и для одного из положений триглицеридов, можно вычислить состав другого положения по уравнению 3 [А] = 2[A]₁,₃ + [А]₂, а также вычислить величину Н — процентное содержание кислоты А в 2-положении: H = 100 [A]₂/3[A] [137, 200, 202, 243, 957, 995]. Сами продукты липазного гидролиза можно разделить газовой хроматографией в виде ТМС-производных (стр. 96) [924]. Иногда для оценки влияния ацильной миграции (стр. 117) моноглицеридную фракцию окисляют периодатом для разрушения 1-изомеров, а 2-моноглицериды выделяют повторной хроматографией [242, 638, 955, 1007]. Для точного определения строения выделенных ди- и моноглицеридов их мож- <\br> но этерифицировать ацилхлоридами жирных кислот, не свойственных данному жиру, снова обработать липазой полученные искусственные триглицериды, а затем идентифицировать продукты этого вторичного гидролиза [265, 698].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОСТОВЕРНОСТИ ДАННЫХ ФЕРМЕНТАТИВНОГО АНАЛИЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Для оценки достоверности сведений о строении природного жира, полученных по данным жирнокислотного состава продуктов его липазного гидролиза, необходимо, во-первых, выяснить, одинакова ли скорость отщепления разных видов кислот, проходит ли оно по статистическому механизму, и, во-вторых, знать, в какой степени соблюдается позиционная специфичность гидролиза и как на нее влияет возможная ацильная миграция [240, 317, 447, 698, 964]. При различной длительности гидролиза значительные изменения в жирнокислотном составе каждого из классов липидов (см. стр. 116), возникающих при липазном расщеплении триглицеридов обычных жиров и масел с [S]₂ < 10% и m насыщенных и ненасыщенных кислот = 12—18, отсутствуют. В то же время оставшиеся нерасщепленными триглицериды и объединенная фракция СЖК и 2-моноглицеридов, с одной стороны, и исходный жир — с другой (при условии низкого содержания диглицеридов в реакционной смеси) близки между собой по жирнокислотному составу. Таким образом, жирнокислотная специфичность реакции в общем выражена слабо, а сам липазный гидролиз крайних ацилов носит статистический характер [207—209, 243, 316, 369, 846].

Кислоты с длинной цепью 20 : 5 и 22 : 6 из жиров морских животных (см. стр. 200), вследствие пространственной близости их карбоксила к первой двойной связи и концевой СН₃-группе (из-за изгиба цепи), по скорости отщепления уступают обычным кислотам в 5—10 раз и потому накапливаются в ди- и триглицеридах реакционной смеси; ацилы кислоты 22 : 5, не обладающие этими особенностями пространственной структуры, гидролизуются нормально. Сейчас для частичного расщепления «морских» жиров с целью определения их строения вместо липазы используют реактив Гриньяра — метилмагнийбромид [117, 137, 1011].

Наоборот, ацилы коротких жирных кислот (m < 12), благодаря чрезвычайной легкости их миграции из среднего в крайнее положение 2-моно- и 1,2 (2,3)-диглицеридов, гидролизуются в три раза быстрее обычных кислот, что приводит к накоплению последних в моноглицеридах [592, 597, 599, 884]. Поэтому данные о составе богатых короткими ацилами жиров, например молочного жира (стр. 215), жира Cuphea llavia, масла Irvingia gabonensis (стр. 181) и других, полученные методом липазного гидролиза, нельзя считать надежными [104, 119, 120, 201, 288, 425, 445, 638]. Интенсивность миграции лауриновой кислоты, занимающей про- <\br> межуточное положение между летучими и нелетучими кислотами, еще окончательно не определена [99, 202].

Появление разветвления в цепи насыщенных ацилов тормозит их отщепление, а введение гидроксила не сказывается на скорости реакции [212]. Остатки азелаиновой кислоты в триглицеридах (стр. 45) гидролизуются, как и обычные ацилы. При гидролизе свиного жира ([S]₂ ≈ 75%, стр. 208) преимущественно отщеплялись ненасыщенные ацилы, что вызывало рост насыщенности в остаточных ди- и триглицеридах. Жирнокислотный состав 2-моноглицеридов ([S]₂) все время оставался постоянным, поэтому использование хорошо воспроизводимых величин [А]₂ и [А] для вычисления [А]₁,₃ (стр. 116), ПТС и ПВС триглицеридов более правильно,

Рис. 13. Газо-жидкостные хроматограммы жирных кислот 1,3-дистеаро-2-олеина (СОС) (а) и кислот 2-моноглицеридов, полученных липазным гидролизом СОС (б)

чем применявшийся ранее расчет значений [А]₁ из менее достоверных данных состава СЖК [212, 251, 265, 289, 656]. О влиянии цис, транс-изомерии ненасыщенных ацилов на скорость гидролиза мнения разных авторов расходятся [606, 655].

Гидролиз синтетических и природных триглицеридов в микромасштабе in vitro в течение 1—2 мин. (см. выше), а также в кишечнике полностью соответствует уравнению реакции [209, 213, 242, 846]. Однако при более длительном ферментативном омылении даже тщательно очищенных триглицеридов симметричная структура моноглицеридов редко сохраняется полностью (рис. 13). Во фракции последних обычно содержится 10—30% и более 1 (3)-изомеров, возникающих путем ацильной миграции в водной среде при рН 8 и легко образующих свободный глицерин (до 30—40% в конце гидролиза) [201, 203, 369]. Изомеризацию можно частично устранить добавлением свободных жирных кислот или применением микробных липаз с кислым оптимумом рН (см. стр. 120) [212, 241, 848]. Поскольку миграция ацилов термодинамически направлена в сторону 1,3-положения и по скорости уступает их отщеплению, можно считать, что 2-моноглицериды свободны от ацилов, исходно содержащихся в крайних положениях триглицеридов, и по жирнокислотному составу достоверно отвечают 2-положению последних.

Позиционная специфичность липазы сама по себе практически абсолютна [243, 655, 733]. Так, при гидролизе продуктов ацилирования 1 (3)- и 2-моноглицеридов (стр. 117) исходная кислота отщеплялась на 98% и 2—10% соответственно, а жирнокислотный <\br> Таблица 9 Гидролиз 1,3-дипальмитата 2-(9,10-Н³)-олеата sn-глицерина панкреатической липазой (в мол. %) [264]

| Время гидролиза, мин. | СЖК в продуктах гидролиза | Распределение Н³ (%), в | 1,3-ПО, моли на 100 молей 1,2-ПО | Все 1-МГ | 1-МО | 1-МП | | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | | | | ТГ | ДГ | МГ | СЖК | | моли на 100 молей 2-МГ | | 19 | 31 | 26 | 34 | 37 | 3 | 2 | 23 | 20 | 3 | | 22 | 50 | 17 | 27 | 52 | 4 | 3 | 23 | 20 | 3 | | 30 | 60 | 6 | 15 | 74 | 5 | 4 | 38 | 35 | 3 | | 45 | 60 | 11 | 15 | 66 | 8 | 6 | 43 | 38 | 5 |

состав продуктов ферментативного омыления соответствующих производных 1,2 (2,3) и 1,3-диглицеридов отличался от теоретического не более чем на 5%. Аналогичные результаты дали опыты гидролиза 2-олео-1,3-бензилиденглицерина и 2-олео-1,3-гексадецилового эфира глицерина, в которых была исключена миграция остатка олеиновой кислоты из 2-положения, а неспецифическая липаза тормозилась (стр. 115) [698, 704]. Для количественной оценки ацильной миграции 1,3-дипальмитат 2-(9,10-Н³)-олеат sn-глицерина (ПОТП) расщепляли при постоянном рН8 (табл. 9). Возможные превращения ПОТП при изомеризации и неспецифическом гидролизе показаны на рис. 14. Единственной причиной нарушений жирнокислотного состава продуктов реакции по сравнению с теоретическим является изомеризация 1,2 (2,3)-диглицеридов и особенно 2-моноглицеридов, которая усиливается по мере инкубации. Уровень 1-монопальмитина и свободной олеиновой кислоты не превышает 3—5%. Радиоактивность три-, ди- и моноглицеридов (в имп/мин/мкмоль), полученных из ПОТП с липазой плесени Rhizopus arrhizus, составляет 60, 59,9 и 55,5 соответственно, что указывает на слабую миграцию О* из 2-положения [264].

Рис. 14. Возможные превращения ПОП при липазном гидролизе I — нормальный гидролиз 1,3-ацилов; II — ненормальный гидролиз 2-ацилов; III — спонтанная ацильная миграция <\br> Вначале панкреатическую липазу применяли для гидролиза или синтетических триглицеридов или нефракционированных природных жиров со сложным многокомпонентным составом триглицеридов [207, 213, 243, 849]. Результаты таких анализов выражали в виде процентного состава жирных кислот в среднем и крайних положениях, а также использовали для расчета величины Н (стр. 116), фактора обогащения и фактора селективности (стр. 176) отдельных видов кислот и для вычисления ПТС, ПВС и других категорий триглицеридного состава по уравнениям позиционно-статистического распределения (стр. 168) [99, 655, 698, 1007]. Если для данной кислоты Н ≈ 33%, то налицо чисто статистическое распределение ее ацилов (стр. 150) [202, 369, 884]. Однако такое распределение встречается редко [907]. Строение большинства животных (стр. 198) и растительных триглицеридов (стр. 179) значительно отклоняется от статистического [240, 242, 258]. Различия в составе между 1,3- и 2-положениями глицеридов послужили основой гипотезы о двух ферментах их биосинтеза, имеющих разную жирнокислотную и разную позиционную специфичность [368, 848, 964]. Сейчас показано, что значительно более точных результатов можно достичь сочетанием липазного гидролиза в микромасштабе с предварительным фракционированием природных жиров современными комбинированными методами (см. табл. 1) [208, 212, 606, 638, 656, 667].

Как уже отмечалось, гидролиз панкреатической липазой представляет собой наиболее удобный и разработанный метод определения позиционных категорий состава триглицеридов [201, 208, 213, 656, 686]. К недостаткам этого метода следует отнести не всегда удовлетворительную воспроизводимость действия разных препаратов фермента, содержащих те или иные примеси, возможность миграции ацилов и реэтерификации свободных жирных кислот под влиянием ацилтрансферазной активности липазы при длительной инкубации без Са²⁺ и, наконец, отсутствие стереоспецифичности гидролиза [212, 477, 478, 482, 606].

ПРИМЕНЕНИЕ ДРУГИХ ЛИПАЗ ДЛЯ АНАЛИЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Кроме панкреатической липазы свиньи в позиционном анализе триглицеридов иногда применяются соответствующие ферменты других млекопитающих, а также трески, ската и омара, имеющие ту же позиционную специфичность [132, 138, 145, 201, 240]. Липазы молока и культуральной жидкости гриба Pseudomonas fragi также специфичны к 1,3-положениям; благодаря их «кислому» оптимуму рН 5—6 миграция ацилов при гидролизе выражена слабее, чем у панкреатических липаз [208, 243, 287, 445]. Липаза семян Vernonia anthelmintica атакует 2-положение, давая 1,3-диглицериды, а фермент гриба Geotrichum candidum специфичен (правда, не абсолютно) к цис-9-ненасыщенным ацилам, особенно <\br> к остатку олеиновой кислоты, независимо от их положения (стр. 135); элаидиновая кислота почти не отщепляется этой липазой, что указывает на высокую стереоизбирательность образования фермент-субстратного комплекса [58, 314, 447]. Липазы клещевины и Streptococcus aureus не обладают ни позиционной, ни жирнокислотной специфичностью и потому не используются в глицеридном анализе [606, 655]. Прежние гипотезы о «синтетической» роли растительных липаз в образовании триглицеридов (стр. 226) теперь не имеют значения [212].

ПОЗИЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

К неферментативным методам качественного позиционного анализа глицеридов, пригодным пока лишь для отдельных видов триглицеридов, а не сложных природных смесей, относятся ранний метод определения полиморфных форм (стр. 136) — длительный и требующий много материала, и примененный недавно масс-спектрометрический метод (рис. 15). При введении синтетического 1-миристата 2-стеарата 3-пальмитата sn-глицерина (I) в ионизационную камеру масс-спектрометра MS-9 путем прямого испарения при 170—200° наиболее характерными были следующие пики: 1) молекулярный пик І (Р); а) пики 523, 551 и 579 за счет отрыва от (I) ацилокси-(RCOO-) групп стеарата, пальмитата и миристата соответственно; 3) пики ионов этих ацилов (RCO) 267, 239 и 211; 4) пики 509, 537 и 565 (на 14 единиц меньше, чем пики 523, 551 и 579) за счет отрыва СН₂-групп остатка глицерина вместе с RCOO-группой соответствующих ацилов. Для стеарата, расположенного в 2-положении (I), интенсивность пика 509 втрое ниже, чем для пальмитата и миристата. Синтетические 2-ОСС и 1-ОСС дали разные масс-спектры. При помощи этого метода определили строение оптически активного триглицерида из масла S. sebiferum

Рис. 15. Массовый спектр 1-миристо-2-стеаро-3-пальмитина <\br> (стр. 192). Масс-спектрометрия применима для анализа ПВС видов триглицеридов нормального строения вплоть до молекулярного веса 1058, причем скорость и чувствительность определения здесь выше, чем при гидролизе липазой [83, 212].

Глава 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ КОНФИГУРАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ СТЕРЕОИЗОМЕРИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Абсолютная конфигурация большинства асимметрических природных соединений давно установлена. Показано, что аминокислоты, углеводы, терпены, алкалоиды и т. д., как правило, представляют собой энантиомеры, а рацемические смеси встречаются крайне редко [368, 856]. Изучение строения триглицеридов до последнего времени ограничивалось суммарным определением жирнокислотного состава в крайних положениях, поскольку панкреатическая липаза не различает эти ацилы при гидролизе [144]. Стереоспецифичность триглицеридов, в отличие от их ПВС, исследована еще мало из-за трудности препаративного выделения их отдельных видов, из-за того, что методы синтеза стереоизомерных триглицеридов, необходимых для изучения этой проблемы, разработаны сравнительно недавно, а также потому, что в стереоизомерах триглицеридов современными методами обычно не удается обнаружить оптическую активность [856].

Оптическую активность можно ожидать у асимметрических триглицеридов позиционного вида АВС при А ≠ В и А = В [212]. Исследованиями последних лет в природных жирах открыто много глицеридов асимметрического строения [368, 738]. Если такие глицериды являются рацемической смесью равных концентраций энантиоморфов, то они не будут обладать оптической активностью. Если же один из антиподов этой смеси полностью или частично отсутствует, то обнаружение асимметрического атома углерода в 2-положении тем или иным химическим или физическим методом в принципе возможно [642]. Решение проблемы эквивалентности или неэквивалентности ацильного состава в положениях 1 и 3 асимметрических триглицеридов имеет важное значение для полной характеристики состава, строения и абсолютной конфигурации природного жира. В частности, оно важно для оценки современных теорий распределения ацилов в триглицеридах, поскольку большинство этих теорий, основанных на данных липазного гидролиза, исходит из предположения о статистическом распределении ацилов в крайних положениях (стр. 167). В то же время эта проблема представляет большой интерес и сама по себе [131, 642, 739, 856].

ОБОЗНАЧЕНИЕ СТЕРЕОИЗОМЕРОВ ПРОИЗВОДНЫХ ГЛИЦЕРИНА В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ НОМЕНКЛАТУРЫ АБСОЛЮТНОЙ КОНФИГУРАЦИИ

Поскольку молекула глицерина, не обладающая оптической активностью, обычно рассматривается как симметричная, возникает вопрос о том, как различить между собой первый и третий атомы углерода этого соединения, которые могут дифференцироваться в ходе реакций липидного обмена. При рассмотрении Фишеровской проекционной формулы глицерина (Iа) можно заметить, что эта молекула имеет плоскость симметрии, рассекающую центральный атом С по линии ОН — Н, причем образующиеся половины не идентичны друг другу, так как они не могут быть наложены друг на друга. Следовательно, глицерин имеет мезостроение, а его центральный атом С можно обозначить как мезоатом. Обладая мезостроением, глицерин должен быть лишен вращательной симметрии: действительно, вращая молекулу (Iа) на 180° вокруг оси, перпендикулярной к плоскости листа, мы получаем формулу (Iб), которую нельзя совместить с (Iа). Вращательная асимметрия глицерина показана ниже: Iа — L-глицерин, Iб — D-глицерин. Темными треугольниками обозначены связи, направленные к читателю, пунктиром — связи, направленные от читателя).

  CH₂OH
  |
HO-C-H
  |
  CH₂OH

Iа

  CH₂OH
  |
H-C-OH
  |
  CH₂OH

Iб

Наличие мезостроения и отсутствие вращательной симметрии позволяют предположить, что в ходе обменных реакций с асимметрическими реагентами (все биологические реакции относятся именно к таким реакциям) судьба каждой карбинольной группы СН₂ОН будет разной и что эти группы можно будет различить между собой. Действительно, биосинтетическое замещение той или иной первичной ОН-группы фосфатом, спиртовым радикалом, ацильной группой и другими дает глицерофосфат, батиловый спирт, 1-моноглицерид и т. д., обладающие оптической активностью. Поэтому точная номенклатура атомов С глицерина имеет важное значение для исследования строения и биосинтеза жиров. Сейчас существуют четыре главные системы такой номенклатуры [52].

До последнего времени для обозначения абсолютной конфигурации оптически активных производных глицерина пользовались системой Бера и Фишера [768]. В этой системе принадлежность данного производного к D- или L-ряду определяется тем, в какой из двух стереоизомеров глицеринового альдегида (D- или L-) его <\br> можно превратить при помощи наименьшего числа реакций. В частности, для несимметричных моно- и диглицеридов одной из стадий такого превращения служит окисление свободной первичной карбинольной группы до альдегидной группы без изменения положения заместителей. Неацилированная, замещенная фосфатом, содержащая радиоактивную метку и т. д. карбинольная группа всегда обозначается греческой буквой α, а вторичная HCOR₂-группа — буквой β. Для структурных и биохимических целей эта система неудобна, поскольку остается неясным, обозначает ли α 1- или 3-положение. Номенклатура Бера и Фишера была видоизменена в так называемой «общепринятой D/L системе» («conventional D/L system» [52]). В этой системе также используются приставки D и L; однако, в отличие от предыдущей, положение заместителей обозначается цифрами 1, 2 и 3, причем номером 1 обозначают ацилированную карбинольную группу. Данная система также не лишена недостатков. Например, продукт фосфорилирования L-1,2-диацилглицерина (фосфатидную кислоту) по этой номенклатуре можно назвать или L-1,2-диацилглицеро-3-фосфатом, или D-2,3-диацилглицеро-1-фосфатом. Поэтому сейчас эта система заменяется другими [52, 129, 377].

Более совершенная (R)/(S) система номенклатуры абсолютной конфигурации, основанная на последовательности расположения функциональных групп определенного ранга вокруг центра асимметрии, была предложена Каном, Ингольдом и Прелогом [464а]. Ранг данной группы по отношению к другим определяется ее положением в условной иерархии, например, ОН > СООН > кетон > альдегид > карбинол > CH₃ > Н [377, 464а]. Согласно (R)/(S) номенклатуре, в триглицеридах ацилы с более длинной цепью выше по рангу, чем ацилы с короткой цепью, ненасыщенные имеют приоритет перед насыщенными, разветвленные — перед нормальными, цис- — перед транс- и т. д. В молекуле триглицерида последовательность всегда начинается с группы OR₁, при мезоатоме С, которая содержит кислород и имеет наивысший ранг, и заканчивается атомом водорода при том же атоме С как заместителем наименьшего ранга. Если заместители в порядке убывания их ранга расположены в плоскости над асимметрическим атомом С, который рассматривается со стороны, противоположной заместителю наименьшего ранга (в случае триглицеридов — среднему атому Н) по часовой стрелке, то данный триглицерид принадлежит к правой или (R) конфигурации, а если против часовой стрелки — то к левой или (S) конфигурации.

Наглядной моделью мезоатома углерода с четырьмя разными заместителями, помогающей установить стереоконфигурацию данного асимметрического триглицерида согласно (R)/(S) номенклатуре, может служить схематическое изображение рулевого управления автомобиля (рис. 16). В нижней части рис. 16 помещены Фишеровские проекционные формулы двух взятых для примера асимметрических триглицеридов — оптических антиподов α-лау- <\br> родипальмитина (І и ІІ); направление связей между мезоатомом С и заместителями изображено так же, как указано выше. Рассматривая последовательность расположения содержащих ацильные группы заместителей вокруг центра асимметрии (см. верхнюю часть рис. 16), можно заметить, что для (I) заместители в порядке убывания их ранга размещаются против, а для (ІІ) — по часовой стрелке. Следовательно, (I) имеет (S), а (II) — (R) конфигурацию. Согласно (R)/(S) системе,

Рис. 16. Абсолютная конфигурация стереоизомерных α-лауродипальмитинов по (R)/(S)-номенклатуре I — (S)-1-лауродипальмитин; II — (R)-1-лауродипальмитин

та из карбинольных групп триглицерида, атом водорода которой замещен ацилом более низкого ранга (в данном случае — остатком лауриновой кислоты), обозначается номером 1. Поэтому (I) в (R)/(S) системе следует обозначить как (S)-1-лауродипальмитин, а (ІІ) — как (R)-1-лауродипальмитин [464а, 856].

Преимуществами (R)/(S) системы являются ее универсальность и отсутствие какой-либо двусмысленности при обозначении. Однако в применении к производным глицерина она имеет то неудобство, что большинство их реакций, состоящих в образовании или расщеплении сложноэфирных связей и не затрагивающих ни одной из четырех связей С-2 атома глицерина, приводят в (R)/(S) системе к частым переменам обозначающих конфигурацию префиксов (R) и (S). Например, продукт фосфорилирования (S)-1,2-диацилглицерина обозначается в (R)/(S) системе как (R) фосфатидная кислота [52].

Дальнейшим развитием (R)/(S) системы в применении к пространственной конфигурации глицерина и его производных явилась предложенная Хиршманом система стереоспецифической нумерации с фиксированным положением заместителей (sn-система), которая пользуется сейчас наибольшим распространением для обозначения стереоспецифичности триглицеридов и других глицеролипидов [377]. Было условлено, что атомы углерода в проекционной формуле глицерина (Iа), в которой заместитель высшего ранга (гидроксил мезоатома углерода) всегда обращен влево, а атом водорода — вправо, нумеруются так же, как атомы углерода в L-глицериновом альдегиде, т. е. сверху вниз: 2 — 1 — 3. Таким образом, каждая первичная карбинольная группа глицерина получает в sn-системе определенный номер, и ей не может присваиваться то <\br> номер 1, то 3. Триглицерид обозначается здесь как 1,2,3-триацил-sn-глицерин, а D- и L-α,β-диглицериды по Беру и Фишеру — как 1,2-диацил- и 2,3-диацил-sn-глицерины соответственно [52, 377]. Если имеется равновесная смесь обоих антиподов, то в sn-системе она обозначается приставкой rac-, например, rac-1-олеодипальмитоглицерин, а если конфигурация неизвестна — то приставкой Х, например, Х-1-пальмитодиолеоглицерин. В настоящее время sn-система рекомендована ко всеобщему применению Комиссией по биохимической номенклатуре Международного союза по теоретической и прикладной химии для обозначения абсолютной конфигурации липидов [52].

СТЕРЕОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Вследствие трудности выделения энантиоморфных триглицеридов из природных жиров были разработаны методы стереоспецифического синтеза триглицеридов, с тем чтобы синтетические антиподы можно было сравнивать с природными [689, 738]. Ранние методы синтеза были основаны на разделении рацемических промежуточных продуктов на оптические антиподы, которые затем превращали в триглицериды без рацемизации. В современных исследованиях синтез начинают с оптически активного природного соединения. В работах по первому принципу стереоспецифическими разделяющими агентами служили D-винная кислота, сахарная кислота или стрихнин [689]. Сейчас для получения антиподов исходят из D- или L-маннита.

  CH₂OH
  |
  HO-C-H
  |
  HO-C-H
  |
  H-C-OH
  |
  H-C-OH
  |
  CH₂OH

ацетон / ZnCl₂ →

  CH₂
  |   \
  O-CH
  |   /
  O-C-H
  |
  H-C-OH
  |
  H-C-O
  |     \
  H-C-O
  |     /
  CH₂

C(CH₃)₂ C(CH₃)₂ Pb(OAC)₄ → I II

  HC=O
  |
  HC-O
  |    \
  HC-O
  |    /
  CH₂

C(CH₃)₂ Ni / H₂ →

  H₂C-OH
  |
  HC-O
  |    \
  HC-O
  |    /
  CH₂

C(CH₃)₂ RCOCl / пиридин → III IV

  H₂C-OOCR
  |
  HC-O
  |    \
  HC-O
  |    /
  CH₂

C(CH₃)₂ кислый гидролиз →

  CH₂OH
  |
  HO-CH
  |
  H₂C-OOCR

V VI

По методу Фишера и Бера 1,2,5,6-диизопропилиден-D-маннит (II), полученный из D-маннита (I) обработкой ацетоном в присутствии хлористого цинка, окислительным расщеплением тетраацетатом свинца по 3,4-гидроксильным группам превращают в две молекулы изопропилиден-D-глицеринового альдегида (ІІІ), восстанавливают (III) до D-(+)-изопропилиденглицерина (IV), этерифицируют (IV) в 1-положение хлористым ацилом и, удалив остаток ацетона в (V) кислотным гидролизом, получают 3-ацил-sn-глицерин (VI). Аналогично из L-маннита синтезируют 1-ацил-sn-глицерин [689]. Стереоизомерные моноглицериды превращают в триглицериды (стр. 112).

Для примера показан ход синтеза 1-лауро-2,3-дипальмито-sn-глицерина (или (—)-(S)-1-лауродипальмитина, I) и 1,2-дипальмито-3-лауро-sn-глицерина (или (+)-(R)-1-лауродипальмитина, II).

  H₂C-OH
  |
  HC-O
  |    \
  H₂C-O
  |    /

C(CH₃)₂ (+)-Изопропилиденглицерин

  H₂C-O-Ла
  |
  HC-O
  |    \
  H₂C-O
  |    /

C(CH₃)₂ →

  H₂C-O-Ла
  |
  HC-OH
  |
  H₂C-OH

→

  H₂C-O-Ла
  |
  HC-O-П
  |
  H₂C-O-П

I

  H₂C-O-П
  |
  HC-O
  |    \
  H₂C-O
  |    /

C(CH₃)₂ →

  H₂C-O-П
  |
  HC-OH
  |
  H₂C-OH

→

  H₂C-O-П
  |
  HC-O-П
  |
  H₂C-O-Ла

II <\br> В дальнейшем физическими методами было доказано, что полученные триглицериды действительно являются оптическими антиподами [856]. При стереоспецифическом синтезе sn-1,2-дипальмито-3-сорбина свободную ОН-группу в (IV) защищали бензильным радикалом, снимали изопропилиденовую защиту, ацилировали свободные ОН-группы пальмитилхлоридом, удаляли бензильную группу и вводили остаток сорбиновой кислоты в положение 3. Полученный триглицерид сравнивали с природными глицеридами из масла Sapium sebiferum [738]. Для хроматографического разделения и измерения оптического вращения в условиях, исключающих ацильную миграцию, sn-1,2- и -2,3-диглицериды, выделенные липазным гидролизом асимметрических триглицеридов, ацилировали сорбилхлоридом или превращали в ТМС-производные; параллельно получали соответствующие синтетические аналоги [738, 739]. Вместо синтетических энантиоморфных моноглицеридов для синтеза триглицеридов можно использовать 1,2-диацил-sn-глицерины, полученные из природного лецитина действием фосфолипазы С [129, 926].

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АБСОЛЮТНОЙ КОНФИГУРАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Первым физическим методом, использованным для анализа абсолютной конфигурации триглицеридов, была поляриметрия, поскольку многие природные и синтетические производные глицерина — глицерофосфат, батиловый спирт, тритилдиглицериды, моно- и диглицериды — обладают заметным оптическим вращением [368, 689, 739, 856]. Однако у природных и синтетических энантиоморфных триглицеридов алифатических кислот в подавляющем большинстве случаев пока не удалось обнаружить оптическую активность [738, 739, 856]. Исключение составляют те асимметрические глицериды, у которых один или два гидроксила замещены остатками ароматической кислоты или жирной кислоты с короткой цепью, причем (S)-формы этих триглицеридов являются лево-, а (R)-формы — правовращающими [856]. Оптическая активность, вызванная асимметрией в остатке глицерина, обнаружена в sn-1,2-диацил-3-ацетинах — главных компонентах масел семян Euonymus verrucosus, Impatiens edgeworthii и других растений из сем. Celastraceae, Rosaceae, Balsaminaceae, Lardizabalaceae и Ranunculaceae. В продуктах гидрирования глицеридов идентифицировали sn-1,2-пальмитостеаро-3-ацетин и sn-1,2-дистеаро-3-ацетин; [α]²⁵₃₅₀ их смеси равен —1,9°, а в ИК-спектре имеется интенсивная полоса поглощения при 8,1 мк, характерная для ацетоксигруппы. Кроме ацетата триглицериды содержат обычные кислоты, причем в 2-положениях, как всегда, преобладают U-ацилы [77, 579, 580]. Оптическая активность стереоизомерных глицеридов не исчезает при гидрировании, хранении в течение шести-семи лет в нормальных условиях и нагревании до 170° при исключении ацильной мигра- <\br> Рис. 17. Рентгенограммы 2-олеопальмитостеарина I—IV — см. стр. 130

ции и окисления. Однако оптическая активность теряется после рандомизации, что доказывает расположение центра асимметрии в остатке глицерина этих триглицеридов [352, 368, 689, 856].

Обычно же оптическая активность, вызванная асимметрическим положением алифатических ацилов с длинной цепью, которые мало отличаются друг от друга по величине и строению молекулы, недостаточно велика, чтобы ее можно было обнаружить поляриметрией в видимом или УФ-свете [642, 689, 856]. Так, ацилирование остатком высшей жирной кислоты в 3-положение энантиоморфного, обнаруживающего оптическую активность 1,2-диглицерида, например D-(+)-1,2-диолеина с [α]²⁵_D = 1,73°, сразу же снимает эту активность [352, 368, 689]. Величина дисперсии оптического вращения в диапазоне 300—600 нм у синтетического sn-1,2-дипальмито-3-лаурина была в 25 раз ниже, чем у sn-1-монопальмитина, и имела обратный знак вращения [856]. Высокие величины оптического вращения, обнаруженные в дельфиньем жире (стр. 204) и в маслах двух растений из сем. Euphorbiaceae — S. sebiferum и Sebastiana lingustrina (стр. 192), оказались связанными с асимметрией ацилов жирных кислот, а не остатка глицерина [676, 738, 856, 890]. Энантиомерные триглицериды, непосредственно не обнаруживающие оптической активности даже в УФ-свете, получили название «криптоактивных» [856].

Использование физических методов для различения антиподов и рацематов и для определения абсолютной конфигурации криптоактивных триглицеридов требует предварительного препаративного выделения и тщательной очистки отдельных видов глицеридов; кроме того, последние в момент испытания должны быть в кристаллическом состоянии. Исследование пьезоэлектрической возбудимости кристаллов трех синтетических триглицеридов между электродами, вибрирующими с частотой переменного тока, показало, что пьезоэффект наблюдается только для антиподов, а в случае рацемата отсутствует. Различия между точками плавления рацемата и стереоизомеров слишком малы для надежной идентификации последних, поэтому необходимо определять фазовые диа- <\br> граммы смесей природного триглицерида неизвестной стереоконфигурации с каждым из двух соответствующих синтетических антиподов: если стандарт является энантиомером по отношению к природному глицериду, то могут возникнуть эвтектики [352, 856].

Сравнительно более удобным физическим методом определения стереоконфигурации триглицеридов оказался рентгеноструктурный анализ. Поскольку противоположные стереоизомеры (рис. 17, І и ІІ) дают одну и ту же картину дифракции, отличающуюся от картины, даваемой их смесью или синтетическим рацематом (ІІІ), для определения конфигурации 2-ОПС из масла какао (рис. 17, IV) сравнивали рентгенограммы III и IV; совпадение этих картин (рис. 17) доказывает, что природный 2-ОПС является рацематом. Если бы это совпадение не обнаружилось, то необходимо было бы получить дифракционную картину смеси природного глицерида с одним из синтетических стереоизомеров, например II; если картина меняется, то стереоизомер IV идентичен II, в противном случае стереоизомер IV идентичен І [856].

КАЧЕСТВЕННОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ ОПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

Химические методы анализа стереовидового состава триглицеридов делятся на качественные и количественные. Например, для качественного обнаружения оптической активности в растительных SUU-триглицеридах их можно путем липазного гидролиза превратить в смесь 1,2- и 2,3-диглицеридов; полученные ацетилированием последних ацетотриглицериды можно окислением по двойным связям раствором КМnО₄-КЈО₄ перевести в смесь VAzS и УAz₂-триглицеридов (У — ацетат). Наличие оптического вращения в этой смеси должно свидетельствовать о неэквивалентности жирнокислотного состава в положениях 1 и 3 исходных SUU-глицеридов [212].

Сходный метод анализа предложил Моррис. Поскольку синтетический 1,2-дипальмито-3-сорбо-sn-глицерин дал заметную оптическую активность ([α]²⁵_D = +3,7°), предположили, что, получив соответствующее активное производное sn-1,2- и 2,3-диглицеридов — продуктов липазного гидролиза жира, можно поляриметрией этих производных установить присутствие в жире стереоизомеров [212, 738]. ТМС-производные синтетических диглицеридов по величине [α] превосходили как эфиры сорбиновой кислоты, так и сами диглицериды, кроме того, они исключали миграцию ацилов; поэтому такие производные использовали для поляриметрического анализа. Стандартом был синтетический 1,2-дипальмито-3-ТМС-sn-глицерин, [α]²⁵_D = +4,7°. Асимметрические SSO- и SOO-триглицериды расщепляли панкреатической липазой и возникшие sn-1,2- и sn-2,3-диглицериды превращали в соответствующие ТМС-производные. <\br>

  CH₂OCOR₁
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OCOR₃

Липазный гидролиз →

  CH₂OH
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OCOR₃

  CH₂OCOR₁
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OH

Триметилсилилирование / Разделение →

  CH₂OTMC
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OCOR₃

(+)

  CH₂OCOR₁
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OTMC

(—)

Поскольку образовавшиеся в каждом случае диглицериды (SS и SO, SO и ОО соответственно) отличались друг от друга числом двойных связей, их можно было разделить хроматографией на силикагеле, пропитанном AgNO₃.

Таблица 10 Абсолютная конфигурация SSO- и OOS-триглицеридов некоторых природных жиров

Как видно из табл. 10, фракции (+)-sn-1,2- и (—)-sn-2,3-диглицеридов оптически активны. По абсолютной величине [α] ни одна из фракций не достигала синтетического стандарта. Эти данные позволили предварительно установить абсолютную конфигурацию триглицерида или состав преобладающих стереоизомеров [739].

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРЕОВИДОВОГО СОСТАВА ПРИРОДНОЙ СМЕСИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФОСФОЛИПАЗЫ А

Количественный метод Брокерхофа [129] основан на позиционной специфичности и стереоспецифичности липолитических ферментов: свободные ОН-группы рацемической смеси 1,2(2,3)-диглицеридов, полученной липазным гидролизом, фосфорилируют фенилдихлорфосфатом с образованием смеси стереоизомерных фенилфосфатидных кислот; 1,2-диацил-3-фенилфосфат-L-глицерины гидролизуют затем в 2-положении стереоспецифической фосфолипазой А змеиного яда (КФ.3.1.1.4), получая смесь 1-ацил-3-фенилфосфат-L-глицерина, свободных жирных кислот и не затронутого гидролизом 1-фенилфосфат-2,3-диацил-L-глицерина (D-антипода по Беру и Фишеру). По жирнокислотному составу исходных, промежуточных и конечных продуктов реакции можно независимо вычислить состав ацилов в 1-, 2- и 3-положениях триглицеридов.

Стереоспецифический анализ триглицеридов по Брокерхофу

  1
  |
  2-
  |
  3

a → I

  1
  |
1+3+2-
  |
  3

б → II

  1
  |
+2-
  |
  3

III

  1
  |
+2-
  |
  3

IV

  1
  |
+2-
  |
  3

V

  1
  |
  2
  |
  P-Ph

в → VI

  1
  |
  2
  |
  P-Ph

  1
  |
  2
  |
  P-Ph

  1
  |
  2
  |
  P-Ph

VII VIII IX

где: 1—3 — ацилы жирных кислот; P — Ph— остаток фосфорилфенола; I, V — триглицерид; II, VIII — жирные кислоты; III — sn-1,2- и sn-2,3-диглицериды; IV — 2-моноглицерид; VI — L- и D-фосфатидилфенолы; VII — L-лизофосфатидилфенол; IX — D-фосфатидилфенол. Реакции: а — липазный гидролиз; б — реакция диглицеридов с фенилдихлорфосфатом; в — гидролиз фосфолипазой А.

Успешный анализ возможен лишь при отсутствии ацильной миграции и жирнокислотной специфичности гидролиза; в против- <\br> ном случае кислотный состав в крайних положениях диглицеридов не будет идентичен таковому исходных триглицеридов [212]. Расщепление D-, L- и DL-дипальмитоолеина липазой показало, что гидролиз обоих крайних ацилов происходит одновременно и с равной скоростью, а полученные диглицериды оптически не активны. Величина [П]/[О] в СЖК и диглицеридах реакционной смеси отвечает теоретическому — 1 : 1 и 3 : 1 соответственно [927]. При гидролизе по Маттсону остаток стеариновой кислоты отщеплялся медленнее, чем другие ацилы [698], поэтому для обеспечения строго статистического гидролиза в обычную среду (стр. 115) добавляли гексан, который ослабляет силы Ван-дер-Ваальса, селективно удерживающие ацилы над поверхностью жировой мицеллы [129, 130].

Отщепление полиненасыщенных кислот с m = 20—22 отставало даже в присутствии гексана, что приводило к накоплению этих кислот в диглицеридах. Поэтому для «морских» жиров (стр. 200), а также для свиного жира и кукурузного масла применяли гидролиз реактивом Гриньяра (0,06—0,12 М метилмагнийбромида в эфире). При деацилировании симметричные моно- и диглицериды значительно изменялись по жирнокислотному составу из-за ацильной миграции, однако 1,2(2,3)-диглицериды отвечали по составу исходным триглицеридам и могли использоваться для стереоспецифического анализа [59, 130, 134, 140, 212, 1011].

Для оценки соответствия хода гидролиза статистическому правилу найденный жирнокислотный состав 1,2(2,3)-диглицеридов сравнивали с составом, вычисленным по уравнению [A]₁,₂(₂,₃) = 0,25 (3[A] + [А]₂). Оказалось, что состав диглицеридов, полученных гидролизом по Брокерхофу или по Лэндсу [129, 617], значительно отличался от теоретического из-за повышенного содержания насыщенных ацилов. Наилучшие результаты в этом отношении дал микрометод гидролиза [59, 656]. Возможно, что статистический гидролиз можно обеспечить снижением уровня Са²⁺ и увеличением содержания фермента в реакционной смеси [212].

По Брокерхофу, продукты липазного гидролиза разделяли на колонке с силикагелем; диглицериды (выход 20—30%) разделяли на 1,2(2,3)- и 1,3-изомеры на кремнекислоте, пропитанной Н₃ВО₃. Несимметричные диглицериды превращали в фосфатидные кислоты в присутствии фенилдихлорфосфата, эфира и пиридина при 0°. Триэтиламмониевые соли этих кислот гидролизовали фосфолипазой А в эфире, рН 7,5, в присутствии СаСl₂ и продукты реакции разделяли хроматографией с Н₃ВО₃ [129, 130, 134, 140]. Жирнокислотный состав каждой фракции определяли газохроматографически. Достоверные результаты состава 1-, 2- и 3-положения можно получить лишь при совпадении данных следующих анализов: I = V, III = VI и IV = VIII (см. выше). Совпадение этих величин показывает, что липазный и фосфолипазный гидролиз прошел статистически и не сопровождался изомеризацией. Непосредственно определялся состав 1- (VII) и 2-положений (IV и VIII); <\br> состав 3-положений вычисляли двумя методами: с одной стороны, содержание кислоты в 3-положениях равно 3 × I — IV — VII, а с другой, 2 × IX — IV. В этих расчетах допустимо абсолютное расхождение в 4% при содержании данной кислоты в жире [А] ≥ 40% и выше, не более 3% при [А] = 10—35% и не более 2% для минорных компонентов; обычно при анализе состава 3-положений ошибка не превышает ±2% и лишь для трудногидролизуемых насыщенных жиров возрастает до 8% [129, 130, 140, 144, 146]. Если результаты хорошо воспроизводятся, то можно ограничиться определением фракций I, IV, VII и IX [130]. Метод Брокерхофа проверен с синтетическими и полусинтетическими триглицеридами [129].

Для непосредственного определения состава 3-положений из продуктов деацилирования триглицеридов по Гриньяру (стр. 133) выделяли 1,3-диглицериды, превращали их в L-2-фосфатидилфенолы и гидролизовали последние фосфолипазой А в положении 1; возникающие лизофосфатидилфенолы по жирнокислотному составу соответствуют 3-положениям исходных триглицеридов [134].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ КОНФИГУРАЦИИ ОТДЕЛЬНЫХ ВИДОВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Все изученные жиры обнаружили различия в составе 1- и 3-положений. Это косвенно указывает на содержание оптически активных триглицеридов, но еще не говорит об их природе [739]. Однако даже одинаковый состав крайних положений не обязательно доказывает, что все глицериды данного жира являются рацематами. Так, для эквимолярной смеси (R) ПОС, (S) ППС, (R) ПОС, (S) ПОС, (R) ППС и (S) ППС соотношение [П] и [С] в положениях 1 и 3 равно единице, хотя эта смесь содержит 1/3 рацемата 2-ОПС, 1/3 рацемата 2-ППС, 1/6 антипода (R) ПОС и 1/6 антипода (S) ППС. Поэтому количественные выводы об абсолютной конфигурации можно делать только по данным анализа или отдельных видов глицеридов, или их простейших смесей, в которых, как, например, в (S) ПОС + СОС, определенная кислота, в данном случае пальмитиновая, имеется лишь в одном из крайних положений [856].

Высокая эффективность современных методов фракционирования делает проблему анализа конфигурации смесей и отдельных видов двукислотных триглицеридов, по крайней мере в принципе, разрешимой, поскольку эти методы обеспечивают разделение метамеров (стр. 11) с одинаковой величиной m и е, но с разным числом S-ацилов (например, ССЛ и СОО). Соотношение стереоизомеров двухкислотного триглицерида легко установить по содержанию кислоты В в положениях 1, 2 и 3 смеси ААВ + ABA + BAA. Более сложно определение конфигурации трехкислотных триглицеридов, которое сводится к определению соотношения концентраций шести возможных стереоизомеров: АBC, ACB, ВАС, ВСА, <\br> САВ и СВА. Знание жирнокислотного состава 1-, 2- и 3-положений позволяет определить соотношения произвольных пар изомеров, например пар по содержанию кислоты А [131]:

(I)

AA BC BC
BC AA CB
CB CB AA

(II)

AB AC BC
BA CA CB
PP PP PP

x y z

Для расчета содержания каждого стереоизомера смеси (I) необходим еще один независимый параметр, который можно получить хроматографическим разделением промежуточных продуктов анализа по жирнокислотному составу. Для определения состава смеси (I) глицерид (АВС) гидролизуют липазой, выделяют 1,2(2,3)-диглицериды, 1,2-изомеры селективно превращают в фосфатидные кислоты стереоспецифической диглицеридкиназой (стр. 257) и определяют жирнокислотный состав каждого из положений методом, аналогичным методу Брокерхофа, но с тем отличием, что фосфатидные кислоты предварительно разделяют на пары стереоизомеров согласно составу кислот (II). Соотношение пар х, у и z равно соотношению содержания кислот С, В и А соответственно в положениях 3. Соотношение изомеров внутри пары можно определить при помощи фосфолипазы А [618].

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДРУГИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА СТЕРЕОВИДОВОГО СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Если в (АВС)-глицериде содержится олеат, то дополнительный аналитический параметр для определения изомерного состава можно получить при помощи липазы микроорганизма Geotrichum candidum, селективно отщепляющей эту кислоту из любого положения глицерида (стр. 120). Гидролиз этой липазой можно провести одновременно с анализом по Брокерхофу, а затем выделить 1,2(2,3)-диглицериды, полученные отщеплением олеата в 1(3)-положениях, перевести их в фосфатидилфенолы, определить соотношение изомеров внутри выделенной стереоизомерной пары с фосфолипазой А и вычислить из полученного соотношения и данных анализа по Брокерхофу содержание в смеси остальных антиподов [446].

Помимо фосфолипазы А, для анализа стереовидового состава пригодны и другие стереоспецифические ферменты липидного обмена. Рацемическую смесь полученных по Брокерхофу фенилфосфатидных кислот можно, например, разделить гидролизом фосфолипазой С, специфичной лишь к L-изомеру [130]. Анализ триглицеридов печени крысы (стр. 214) провели при помощи диглицеридкиназы из Escherichia coli, которая превращает 1,2-изомер диглицеридов, полученных липазным гидролизом, в фосфатидные кислоты (ФК) в 25 раз быстрее, чем 2,3-изомер [617, 882, 883]. Распре- <\br> деление молярной концентрации каждой жирной кислоты суммы триглицеридов между положениями 1, 2 и 3 вычисляли после анализа продуктов ферментативных реакций по уравнениям: [A]₁ = = (2[А]ФК — [А]МГ) : 3; [A]₂ = ([А]МГ) : 3; [А]₃ = [А]ТГ — (2[А]ФК) : 3. Равенство правой и левой частей в этих уравнениях достигается лишь в том случае, если жирнокислотный состав полученных при липазном гидролизе 1,2(2,3)-диглицеридов отвечает рассчитанному (стр. 133). При этом условии подстановка величин [A]₁,₂(₂,₃) вместо величин [А]ФК в уравнения должна дать одинаковый жирнокислотный состав в 1- и 3-положениях; обнаруживаемые различия указывают на величину ошибки метода. Проведенные вычисления свидетельствуют о значительных различиях между положениями, указывающих на жирнокислотную селективность липазного гидролиза. Для достоверного анализа стереовидового состава необходимо в каждом опыте получить совпадение найденного жирнокислотного состава с теоретическим [59].

Глава 8. ПОЛИМОРФИЗМ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

СТРУКТУРА КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ РЕШЕТКИ И ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Явление полиморфизма, открытое Митчерлихом в 1821 г., заключается в существовании для данного химического соединения нескольких кристаллических модификаций, называемых полиморфными формами. Эти формы существенно различаются по структуре и параметрам кристаллической решетки, по температуре плавления, плотности и другим физическим свойствам, но, в отличие от позиционных изомеров, дают идентичную жидкую или газообразную фазу. Способность к полиморфным превращениям весьма свойственна соединениям жирного ряда с длинной цепью и в их числе триглицеридам природных жиров. До начала 30-х годов ХХ в. существование тройных точек плавления, обнаруженное для тристеарина еще в середине ХІХ в., объясняли наличием в глицеридах нескольких изомеров положения. Позднее в работах Т. Малкина было установлено, что эта аномалия связана с различиями в кристаллической решетке. Как показал рентгеноструктурный анализ, при медленном нагревании застывшего расплава (α-полиморфной формы) простого S₃-триглицерида он плавится, а затем снова затвердевает с выделением тепла, образуя более устойчивую β- или промежуточную β'-форму; к возникновению последней приводит выдерживание жидкого расплава при температуре на 1—2° выше точки плавления α-формы. Эти превращения, которые могут и не сопровождаться плавлением, идут в направлении от менее устойчивых форм, образование которых требует минимального изменения свободной энергии решетки, к термодинамически более <\br> устойчивым полиморфным модификациям. Триглицериды различного состава и строения образуют сходные по физическим свойствам главные α-, β- и β'-формы, поскольку решающую роль в полиморфных превращениях играют углеводородные цепи. Тем не менее при исследовании природных жиров постоянно обнаруживаются новые добавочные полиморфные формы, и потому классификация и номенклатура последних окончательно еще не установлены. Направление полиморфных превращений и образование тех или иных форм зависят от чистоты препарата, наличия и природы затравки для кристаллизации, растворителя, давления, температуры, скорости ее изменения и т. д. Следовательно, о кристаллических, термических и

Рис. 18. Элементарная ячейка кристалла β-полиморфной формы стеариновой кислоты а, b — короткие межплоскостные расстояния; с sinβₓ — длинное межплоскостное расстояние

других физических свойствах отдельного триглицерида в определенных условиях среды можно говорить только после определения полиморфной формы, в которой находится в данный момент это соединение. Полиморфизму триглицеридов посвящено несколько обзоров [178, 180, 244, 315, 423, 689, 729, 840].

По данным рентгеноструктурного анализа, алифатические цепи представляют собой зигзагообразные структуры с прямолинейными осями, где угол между С—С-связями равен 109°28′, а величина (а) приращения длины жирнокислотного остатка при увеличении последнего на одну СН₂-группу составляет ~1,28 Å [689]. При недостаточно низкой температуре подход цепей друг к другу на малое расстояние затруднен, и потому триглицериды остаются в жидком состоянии, где отсутствует упорядоченная структура. Возрастающее сближение ацилов при охлаждении приводит к возникновению притяжения между атомами углерода соседних цепей за счет сил Ван-дер-Ваальса и тем самым к кристаллизации триглицеридов [313, 315].

В кристаллах однородных алифатических молекул, концы которых различаются по полярности, цепи располагаются в основном параллельно, в виде своеобразного «частокола», и за счет водородных связей полярных групп обычно образуют двойной кристаллический слой. Наглядную модель этого слоя можно представить себе в виде двух связок очень большого числа спичек, где головка обозначает метильный радикал, а свободный конец — полярную <\br> Рис. 19. Элементарная кристаллическая ячейка триглицеридов а — поперечный разрез; б — поперечный разрез с двумя молекулами (или двойными молекулами), принадлежащими к ячейке; в — поперечный разрез через кристалл

Рис. 20. Возможные конфигурации молекул в кристаллах триглицеридов Конфигурации: 1 — вилки; 2 — кресла; 3 — стержня. Длинный интервал, кратный: а — 2m; б — 3m; в — 4m

группу; одна из связок поставлена головками на некоторую плоскость, а другая — свободными концами на первую связку. Таким образом, двойные молекулярные слои ограничены неполярными «метильными» плоскостями, расстояние между которыми (L) в Å называется длинным интервалом («long spacing»). Найденная по рентгеноструктурным данным величина L позволяет определить число цепей, составляющих один длинный интервал [689].

Если двойные цепи расположены под углом 90° к плоскостям СН₃-групп, то L = 2m (в этой формуле и формулах, приведенных ниже, величина m выражает не число атомов, как обычно, а длину алифатической цепи в Å); в кристаллах смешанных глицеридов встречаются слои с L, кратным трем или четырем длинам цепей. Однако чаще всего m < L < 2m, и направления алифатических цепей и плоскостей, расположены под углом βₓ < 90°. Величины βₓ являются характеристиками кристаллических модификаций, причем уменьшение угла βₓ приводит к усилению контакта между их более полярными сложноэфирными группами и, следовательно, к повышению устойчивости полиморфных форм [178, 313, 423].

Величина L данной формы для триглицеридов разного жирнокислотного состава различна. Недавнее предположение о том, что снижение L вызвано не наклоном цепей, а их вторичными изгибами меандровой формы, экспериментально еще не доказано [423].

Расположенные параллельно друг другу алифатические цепи триглицеридов образуют элементарную кристаллическую ячейку. Она представляет собой вертикальную или наклонную призму, ширина которой, называемая коротким интервалом S («short spacing»), определяется тем или иным способом упаковки полиметиленовых цепей в кристаллической решетке, который является другим главным источником разнообразия полиморфных форм природных глицеридов. В отличие от L, значение S для данной формы <\br> практически постоянно и не зависит от величины m [178, 315, 840]. На рис. 18 представлена модель состоящей из двух пар цепей ячейки стеариновой кислоты [689]. Несколько сложнее построена содержащая две молекулы ячейка триглицеридов: поскольку направление одного из ацилов молекулы составляет угол в 180° с направлением остальных двух ацилов (рис. 19), каждая цепь в решетке совпадает по положению с длинной осью четырехгранной призмы, образованной четырьмя другими цепями (рис. 19) [423]. На рис. 20 приведены возможные конфигурации молекул в кристаллах триглицеридов.

Сначала считали, что эти молекулы имеют конфигурацию вилки, а затем предположили, что более плотная упаковка соответствует конфигурации кресла. Проведенный недавно рентгеноструктурный анализ единичного кристалла β-полиморфной формы трилаурина (рис. 21) позволил установить, что наиболее экономичная упаковка молекул с наименьшей по-

Рис. 21. Рентгенограмма β₂-полиморфной формы трилаурина, показывающая размещение триглицерида в кристаллической решетке а, с — то же, что на рис. 18

тенциальной энергией, не противоречащая принципам симметрии, достигается в форме стержня [178, 180]. Можно видеть, что кристалл состоит из 2m-слоев стержнеобразных молекул в триклинной упаковке; два ацила находятся на одной прямой, а третий (еще не известно, какой именно, средний или один из крайних) <\br> Таблица 11 Физические свойства главных полиморфных форм простых насыщенных триглицеридов * [178, 313]

• В скобках приведены соответствующие данные для тристеарина. ** Чередование точек плавления «четных» и «нечетных» гомологов триглицеридов. *** S — короткое межплоскостное расстояние. **** с — константа для вычисления длинных межплоскостных расстояний L по уравнению Ганстоуна при четных значениях m; 1 — при L, кратном 2m (в уравнении

расположен рядом параллельно им. Значения угла βₓ, найденные из рентгенограммы (62°7′) и вычисленные по величине L (61°39′), хорошо совпадали между собой. Стержневидная форма обеспечивает также образование 3m- и 4m-слоев в кристалле (см. выше) [178, 423]. Форма молекул в других главных кристаллических модификациях α и β' остается еще не выясненной [619].

В гетерогенных системах фазовые переходы могут быть энантиотропными, т. е. осуществляться обратимо в обоих направлениях без расплавления при повышении или понижении температуры системы, или монотропными, которые необратимы, протекают с потерей свободной энергии в направлении более устойчивой формы и для обратного получения нестабильной полиморфной формы требуют промежуточного расплавления. Для триглицеридов характерны главным образом монотропные фазовые переходы [178]. Для получения четких полиморфных переходов и образования форм с определенными свойствами необходимо располагать чистыми препаратами триглицеридов, не содержащими глицеридных гомологов близкого состава или строения. Так, в однородных образцах Ла₃ и С₃, судя по спектрам ЯМР низкого разрешения, жидкая фаза ниже температуры плавления отсутствовала, а в за- <\br> | Упаковка цепей | Дилатометрические данные V_s (-38°), мл/г | Теплота плавления, кал/г | Главные полосы поглощения V С=О-группы,***** см⁻¹ | Главный способ получения | | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | | Гексагональная | (1,014) | 38,9 | 720 | Застывание расплава при 0° | | Орторомбическая | (1,017) | | 727 и 719, дублет | Застывание расплава при t° + 2° | | Триклинная | (1,043) | 54,5 | 717 | Кристаллизация из полярных растворителей; медленное нагревание кристаллов α-формы выше t° |

Ганстоуна m_A = 0; 2 — при L, кратном 3m; а — при m_A = m_B = m_C, m_A = m_C < m_B, m_A < m_B < m_C, m_A ≠ m_B ≠ m_C (m_A < m_C); б — m_A < m_B < m_C, m_A = m_C > m_B. ***** См. стр. 144. ****** t — точка плавления α_L-формы триглицерида.

грязненных кристаллах β-форм ОПП, ПОП, ПОО и СОС жидкая фаза появлялась задолго до плавления [205, 746]. Обычно в переохлажденных расплавах непосредственно ниже точки плавления β-формы наблюдается перелом кривых зависимости lg η (η — вязкость) от обратной температуры Т⁻¹, указывающий на усиление агрегации глицеридных молекул в параллельной упаковке. Сразу же после расплавления триглицерида его кристаллическая структура частично сохраняется, поскольку быстрое охлаждение такого расплава приводит к немедленной рекристаллизации. После разрушения частично упорядоченной структуры жидкой фазы путем получасового выдерживания при температуре, на 20° превышающей температуру плавления, кристаллы образуются медленно [182, 783, 929]. При кристаллизации трипальмитина свойства образующихся кристаллов β-формы определяются природой растворителя: кристаллы наибольшего размера получаются из ацетона, а кристаллы, осажденные из гексана, толуола, бензола и хлороформа, резко отличаются от них по форме и величине [57].

Условия получения главных полиморфных форм простых S₃ указаны в табл. 11 [178, 313]. В этой же таблице приведены неко- <\br> Рис. 22. Дилатометрические (1) и температурные (2) кривые метастабильной α- и стабильной β-полиморфной формы трилаурина (а, б), трипальмитина (в, г) и тристеарина (д, е) а, в, д — α-формы; б, г, е — β-формы

торые из методов исследования полиморфизма триглицеридов. К наиболее ранним методам относятся определение точек плавления в капилляре и дифференциальный термический анализ, который заключается в непрерывной регистрации выделения тепла при затвердевании или поглощения при плавлении по кривым разности температур между окружающей средой и пробой триглицерида при его охлаждении или нагревании соответственно [181, 689, 729, 805].

Рис. 23. Схема рентгенограмм трех полиморфных форм тристеарина а — α; б — β'; в — β

Дилатометрия регистрирует увеличение удельного объема (V_s в мл/г) триглицерида в одной из точек фазового перехода — точке плавления, а также равное по абсолютной величине сжатие в точке затвердевания; оба эти процесса регистрируются как функции температуры [27, 379]. Приведем величины «скачка» V_s в мл × 10⁻² г при плавлении некоторых глицеридов: ООО — 6,65, COO — 9,05, CCC — 9,25, ОПП — 9,65, ПСС — 14,06, СПП — 14,60, CCC — 15,16, ППП — 16,21 [126]. При нагревании α- и β'-форм Ла₃, П₃ и С₃ в микродилатометре со скоростью 6,4° в 1 мин. (рис. 22) было обнаружено, что различия между исходной и конечной величиной V_s при плавлении β-формы связаны с образованием при застывании расплава промежуточной β'-формы для П₃ и метастабильной α-формы для всех триглицеридов, устойчивость которой возрастает с увеличением m и нагревание которой приводит к образованию β-формы [27]. <\br> Рис. 24. Инфракрасные спектры полиморфных форм тристеарина

Периодическое определение числа и величины L и S, свойственных той или иной полиморфной форме данного глицерида, по картине дифракции рентгеновых лучей кристаллическим порошком (рис. 23) или крупным единичным кристаллом (см. рис. 21) также позволяет обнаружить полиморфные превращения, вызванные изменением температуры [176, 840, 990].

Изменения в упаковке цепей при переходе от неустойчивой к устойчивой полиморфной форме можно определить методом ИК спектроскопии (рис. 24) по характерным для данной формы скелетным колебаниям в диапазоне 2—15 мк (5000—600 см⁻¹) [5, 176, 315, 423, 610]. Наконец, спектроскопия ЯМР низкого разрешения позволяет оценить вращательную подвижность ацилов триглицеридов в кристаллической решетке, уловить термический переход тристеарина α → β и количественно определить малые концентрации жидкой фазы в кристаллах триглицеридов с точностью ±2%. Этот метод более эффективен, чем дилатометрия, которая дает лишь относительное содержание твердой фазы [205, 929].

ПОЛИМОРФНЫЕ ФОРМЫ ТРИНАСЫЩЕННЫХ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

В табл. 11 были приведены некоторые свойства главных полиморфных форм наиболее изученных простых S₃-триглицеридов [178, 313]; более полные данные на этот счет содержатся в монографии Маркли [689]. Единой номенклатуры форм еще не имеется (табл. 11). Более ранняя номенклатура Малкина (М), различающая для данного триглицерида четыре формы — стекловидную, α-, β'- и β- в порядке роста температуры плавления, имеет тот недостаток, что у разных форм со сходной структурой кристаллов эти температуры могут быть очень близки или даже совпадать [244, 423, 729]. Согласно Луттону (L), лишенная кристаллической структуры стекловидная форма в действительности не существует, <\br> а имеются только три главные полиморфные формы — α-, β'- и β-, характеризуемые величиной S (табл. 11) [315, 662, 840, 990]. Во избежание путаницы, принадлежность данной формы к той или иной номенклатуре обозначают индексом автора М или L (α_M, α_L, β'_M и т. д.), а число цепей в длинном интервале — цифрой после индекса (β'_L-2, β_L-3 и т. д.) [176, 180, 313, 619].

Установление числа и свойств отдельных полиморфных форм триглицеридов стало возможным благодаря использованию спектроскопических методов. Краткая характеристика ИК-спектров расплавов или растворов простых S₃-глицеридов приведена в табл. 12 [5, 176, 177, 181]. Для твердых триглицеридов характерны интенсивность и число полос колебаний V группы причем обнаружены три типа ИК-спектров по набору таких полос, соответствующих главным полиморфным формам в системе Луттона (табл. 11).

В образующейся из расплава α_L-форме, свойства которой были приведены в табл. 11, цепи отдалены друг от друга на расстояние около 5 Å и свободно вращаются вокруг своей вертикальной оси. Наличие в спектре многочисленных полос α_L-формы в области 1250 см⁻¹ доказывает, что эта форма является кристаллической, а не стекловидной, как считал Малкин. У глицеридов от Ла₃ и выше, обладающих сравнительно устойчивой α_L-формой, число этих полос равно m/2, что позволяет устанавливать длину ацилов в глицеридах по ИК-спектру [178].

Свойства β'_L-формы (табл. 11) указывают на обычную орторомбическую упаковку двух типов наклонных алифатических цепей, плоскости которых ориентированы под прямыми углами друг к другу. Наблюдалось образование β'_L-формы С₃ при кристаллизации из парафинового масла [178, 746].

Наконец, β_L-форма (табл. 11) соответствует триклинной системе, где все плоскости зигзагообразных жирных цепей параллельны друг другу, а сами цепи значительно более устойчивы и упако-

Таблица 12 Главные полосы поглощения простых тринасыщенных триглицеридов в инфракрасном спектре

Номенклатуры Малкина и Луттона не позволяют сравнивать триглицериды по свойствам их полиморфных форм с другими алифатическими соединениями. В номенклатуре Ганстоуна [313] полиморфные формы всех насыщенных соединений с длинной цепью подразделяются по величине угла βₓ на пять групп, причем триглицериды входят в три первых группы V, U и Т (табл. 11). Величину L в кристаллах одно-, двух- и трехкислотных S₃-триглицеридов вида АВС (ацил В всегда в 2-положении), являющуюся линейной функцией длины цепи m, можно вычислить по уравнению L = 1,28 × sin βₓ (m_A + m_B + m_C) + с, где m_A, m_B, m_C — число атомов углерода в ацилах А, В и С, а с — постоянное приращение L в Å, отражающее длину остатка глицерина и величину зоны контакта сложноэфирных групп; величины с для 2m- и 3m-слоев простых и смешанных триглицеридов с разной длиной ацилов А, В и С приведены в табл. 11. Для двойного (2m) слоя значение m_A в уравнении Ганстоуна считают равным нулю. Вычисленные и найденные рентгеноструктурным методом величины L хорошо совпадали между собой [313]. Номенклатура Ганстоуна впервые показала, что каждая полиморфная форма характеризуется определенной величиной угла наклона; однако эта номенклатура непригодна для вычисления L ненасыщенных глицеридов и не учитывает добавочные полиморфные формы простых S₃-глицеридов, совпадающие с основными по величине βₓ [619].

К таким добавочным формам относится, например, sub-α_L-форма, которая получается без плавления из α_L-формы С₃ при —50°, обратимо превращается в α_L-форму и по всем изученным показателям, кроме величины угла βₓ = 90°, совпадает с β'-формой. Иногда при кристаллизации из растворителя или при нагревании α-формы возникают несколько устойчивых β_L-форм, идентичных по картине дифракции, но различающихся по величине βₓ. В отличие от «четных» триглицеридов, триглицериды «нечетных» кислот наиболее устойчивы не в β_L, а в β'_L-форме [176, 178, 746].

Возникновение добавочных форм пытались учесть номенклатуры Хора и Ларсона. По Хору, имеются четыре полиморфных формы — α, β', промежуточная и β, в порядке повышения температуры плавления. Обозначенная «промежуточной» модификация, которая возникает при нагреве α-формы, как было показано позднее, оказалась смесью равных количеств орторомбической и триклинной форм [313, 379].

По Ларсону: 1) формы с одним S = 4,15 Å обозначаются α; 2) формы с двумя S = 4,2 и 3,8 Å и дублетом при 720 см⁻¹ обозначаются β', а все формы, не удовлетворяющие критериям 1 и 2, обозначаются β; если у данного глицерида есть несколько <\br> β-форм, то они обозначаются β₁, β₂ и т. д., в порядке снижения температуры плавления. У β-форм по Ларсону все плоскости зигзагообразных цепей параллельны, у β'-форм — перпендикулярны, а у α-форм в размещении плоскостей нет определенной закономерности [619].

Несмотря на свои недостатки, наиболее приемлемой в настоящее время является номенклатура Луттона, включающая три главные полиморфные формы простых S₃-триглицеридов — неустойчивую α, промежуточную β' и устойчивую β. Эти главные формы следует рассматривать как совокупности близких по свойствам, но не идентичных кристаллических модификаций. Для разработки более полной классификации необходимы дальнейшие исследования [178].

Как показывает табл. 13, полиморфизм двух- и трехкислотных S₃-триглицеридов обнаруживает значительную индивидуальность в зависимости от величины Δm в 2-положении, от симметрии строения и от наличия ацила летучей кислоты в 2-положении.

Таблица 13 Полиморфные формы некоторых насыщенных двух- и трехкислотных триглицеридов

• β'_L- и β_L-Формы одинаково устойчивы. ** β_L-Форма наиболее устойчива. *** β'_L-Форма наиболее устойчива; β_L-форма трудно уловима. **** β'_L- и β_L-Формы близки по величине L. ***** α_L-Форма наиболее устойчива. ****** Добавочные формы устойчивы. <\br> В гомологических рядах триглицеридов, характеризуемых определенным значением + Δm или — Δm, наблюдается аналогичный набор полиморфных форм, а симметричные и несимметричные триглицериды одного состава обнаруживают одинаковую величину L двойных и тройных слоев, которая хорошо совпадает с вычисленной по Ганстоуну (см. табл. 11). У разных триглицеридов наибольшей устойчивостью отличаются β_L, β'_L- или α_L-формы; например, у глицеридов бегеновой кислоты устойчивы не β_L- а β'_L-формы. Трудноуловимые формы можно получить только в присутствии кристаллов янтарной кислоты. Смешанные глицериды, содержащие два ацила какой-либо кислоты, почти идентичны простым глицеридам той же кислоты по числу полос ИК-спектра α_L-формы в области 1250 см⁻¹ [176—179, 662].

С увеличением абсолютной величины Δm сложность полиморфного состава возрастает (табл. 13). У смешанных глицеридов, включающих ацилы летучих кислот, большую роль в полиморфизме играет С=О-группа этих ацилов, вызывающая появление уникальных полиморфных форм; среди них super-α-форма превышает по температуре плавления α-форму на 10° и имеет единственный S = 4,2 Å. В ИК-спектре β'_L-формы 1-ПУУ наблюдались сильные полосы поглощения СН₃- и СН₂-групп ацетата при 1379 и 717 см⁻¹ соответственно, указывающие на триклинную упаковку. Для идентификации позиционных видов, содержащих летучие ацилы, например МаМаП и МаПМа, использовали спектры ЯМР высокого разрешения их полиморфных форм [179, 840]. У трехкислотных глицеридов α_L-формы отсутствуют (табл. 13); величину L для этих глицеридов можно рассчитать по Ганстоуну (см. табл. 11) [313, 689].

ПОЛИМОРФНЫЕ ФОРМЫ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ДРУГИХ ТИПОВ

Менее изученные простые U₃-триглицериды по набору и свойствам полиморфных форм в общем сходны друг с другом и с соответствующими S₃-глицеридами; иногда встречаются добавочные формы, например, β'_L-3 у цис-ненасыщенных триглицеридов. Для последних характерны полосы поглощения ножничных колебаний атомов Н в цис-связи при 690 и 1660 см⁻¹. Триолеин сходен с тристеарином по главным полосам поглощения полиморфных форм при 723 (α_L), 729 (β'_L) и 722 (β_L) см⁻¹. У соответствующих транс-изомеров ненасыщенных триглицеридов появляется характерная для всех форм полоса при 963 см⁻¹, а сходство с S₃-глицеридами той же длины по полиморфному составу еще более возрастает. Число полос U₃ при 1250 см⁻¹ равно m/2, как в случае S₃ (стр. 144) [177, 180]. Таким образом, в простых триглицеридах ненасыщенность мало влияет на полиморфизм [689].

Более широкий набор полиморфных форм имеют триглицериды типа SUS, составляющие около 80% важного в хозяйственном отношении масла бобов какао (стр. 181). Полиморфизм этого масла хорошо изучен, поскольку он служил главным методом опреде- <\br> ления ПВС глицеридов до появления липазного гидролиза [660, 714]. Кристаллические фракции природного масла совпадают со смесью синтетических ПОС, СОС, и ПОП, а выделенный из масла ПОС — с синтетическим ПОС по данным температуры плавления, кривых нагревания, дилатометрии, дифракционных картин и ИК-спектров их отдельных полиморфных форм до и после гидрирования [177, 181]. Ниже приведены свойства этих форм для масла какао, ПОС и СОС. Наблюдалось легкое превращение форм sub-α-3 → α_L-2 при 0° и V → VI при 35°, а также медленный переход α_L-2 → β_L-3 при нагревании [990]. Полиморфные формы отдельных стереоизомеров триглицеридов масла какао (стр. 131) еще не исследованы. Смесь СОС и ПОС дает три полиморфные формы и отличается от каждого из исходных глицеридов по скорости превращения неустойчивых форм, а смесь СОС и ССО (1 : 3) может образовывать новую кристаллическую модификацию, отсутствующую у каждого из компонентов [610, 611]. Сопоставление полиморфизма СОС и ССО показало, что параллелизм с соответствующими насыщенными изомерами (см. ниже) отсутствует: у обоих изомеров наиболее легкоплавкой была sub-α_L-3-форма,

переходящая в α_L-форму (стр. 145), а из расплава образовывалась α_L-3-форма; в то же время устойчивой формой у СОС служит β_L-3-, а у ССО β_L-3-форма с температурой плавления 43°, появляющаяся при нагревании α_L-3-формы [652]. В гомологических рядах ППО по характеру полиморфизма аналогичен ССО, а ПОП аналогичен СОС; у несимметричных SU₂-глицеридов СОО и ПОО, так же как у ССО и ППО, устойчивой была β_L-3-форма [661]. По данным ЯМР спектроскопии, цепи олеата в ССО упакованы менее плотно и вращаются вокруг длинной оси свободнее, чем насыщенные ацилы [178, 180, 689, 729].

Кроме ССО наиболее изучены по полиморфизму SSU-глицериды свиного жира (стр. 207) [819], главный триглицерид которого по всем свойствам полиморфных форм совпадает с ОПС [181]; его наиболее легкоплавкой формой является sub-α_L-2, а возникающей из расплава формой α_L-2(25°), которую можно перевести нагреванием в более устойчивую sub-β'_L-3-форму (37°) с L = 69 Å и S = 4,08 и 3,75 Å. Наиболее стойкую β_L-3-форму (40°) получают кристаллизацией из растворителя или нагреванием sub-β_L-3-формы [611], крупнозернистые кристаллы которой возникают при хранении свиного жира при 27°, что ухудшает внешний вид пищевых <\br> продуктов [930]; это явление устраняют переэтерификацией (стр. 107) [805]. В отличие от ОПС, ССО и ПОО, симметричные глицериды свиного жира ОСО и ОПО дают формы α_L, β'_L-2 и β_L-3, из которых последняя является устойчивой [661].

У нативного, гидрированного и переэтерифицированного говяжьего и бараньего жира и у S₃ этих жиров наиболее устойчива β_L-форма [729, 805], а у гидрированного хлопкового масла из-за преобладания в нем ПСП (см. выше) — β'_L-форма, которую можно получить кристаллизацией из гексана в присутствии янтарной кислоты [930]. Полному переходу к устойчивому полиморфному составу способствует смешивание жиров, богатых SSU, с жирами, содержащими много SUS [611, 652], а также длительное выдерживание при постоянной температуре — темперирование [840]. Так, у некоторых гидрированных растительных жиров при зимнем хранении появляется зернистая текстура, что связано с непосредственным переходом α_L-формы S₃-глицеридов в β_L-форму [661, 689].

Изучение полиморфизма природных жиров достигло больших успехов и, в частности, показало, что строение жиров не является статистическим. Дальнейшие исследования должны создать более полную картину полиморфных форм триглицеридов, особенно ненасыщенных, которые составляют большую часть мирового производства жиров, но изучены еще слабо [313]. Определение совокупности свойств всех кристаллических модификаций соответствующих синтетических и природных триглицеридов имеет большое теоретическое значение для идентификации последних по их составу и строению [729]. Не менее важно и практическое значение полиморфных форм жира для его технологической оценки [929] по консистенции, пластичности, зернистости и другим физическим свойствам [177, 178].