Введение. Триглицериды природных жиров

Природные жиры и масла как смеси триглицеридов жирных кислот

Жирные масла растений и жиры запасающих тканей животных, представляющие собой наряду с углеводами концентрированный энергетический и строительный резерв жизнедеятельности организма, можно определить как водонерастворимые вещества биологического происхождения, состоящие почти исключительно из триглицеридов жирных кислот (ниже приводится схема строения природных нейтральных глицеролипидов):

CH₂—O—CO—R₁ | R₂—CO—O—CH | CH₂—O—CO—R₃ Триглицериды

CH₂—O—CH₂—CH₂—R₁ | R₂—CO—O—CH | CH₂—O—CO—R₃ Алкоксидиглицериды

CH₂—O—CH=CH—R₁ | R₂—CO—O—CH | CH₂—O—CO—R₃ Алкеноксидиглицериды (нейтральные плазмалогены)

Несмотря на различие физических свойств (при комнатной температуре масла обычно имеют жидкую, а жиры — полутвердую консистенцию), между ними нельзя провести резкой границы, поскольку масло легко переходит в жир при снижении окружающей температуры, гидрировании или изомеризации двойных связей.

Если в состав нуклеиновых кислот входят лишь пять главных нуклеотидов, а в состав белков только около 20 аминокислот, то в природных липидах обнаружено более 200 различных жирных кислот. Правда, преобладающих в количественном отношении кислот значительно меньше: это обычно н-С₄ — С₂₆-кислоты с четным числом атомов углерода (преимущественно С₁₆- и С₁₈-кислоты). Ненасыщенные кислоты содержат большей частью цис-двойные связи, которые в полиненасыщенных жирных кислотах, как правило, разделены одной СН₂-группой. Значительно реже встречаются такие особенности строения, как нечетное число атомов углерода, разветвленные или циклические молекулы, двойные связи транс-конфигурации или сопряженные, тройные связи, ОН-группы и т. д. Большинство жиров содержит 4—7 главных и несколько минорных (составляющих < 5% от суммы) жирных кислот, а 75—80% мирового производства жиров приходится на долю всего трех кислот — пальмитиновой, олеиновой и линолевой, присутствующих в том или ином количестве в любой живой клетке. Тенденция к уменьшению разнообразия жирнокислотного состава обнаруживается в ходе эволюции как растений, так и животных. Таксономически близкие виды, как правило, сходны по составу и строению запасных липидов; таким образом, основная причина несходства жиров разного происхождения кроется в различии состава их жирных кислот, вызванном гено- и фенотипическими факторами (стр. 11). Сведения по физике, химии и биохимии жирных кислот, которые входят в состав триглицеридов, подробно не излагаются (см. [315]).

Однако мало знать только жирнокислотный состав липидов. Для полного описания их свойств, составления схемы биосинтеза и оценки возможностей практического использования необходимо определить состав самих липидов. Известно, что в природных жирах преобладают нейтральные липиды, которые содержат спиртовой радикал и алифатические цепи, представляющие собой главным образом ацильные остатки жирных кислот, а также алкилы с длинной цепью и остатки высших альдегидов. Спиртовым радикалом чаще всего служит остаток глицерина. Лишь в последнее время в ряде растений и животных найдены нейтральные липиды, образующие при омылении этиленгликоль, бутандиол и другие двухатомные спирты [8]. К нейтральным глицеролипидам кроме триглицеридов относятся алкоксидиглицериды — диэфиры жирных кислот и спиртов типа батилового или химилового, содержащиеся в рыбьих жирах, а также алкеноксидиглицериды, или нейтральные плазмалогены, которые в небольших количествах обнаружены в липидах рыб, молока, сердца быка и говяжьего жира и которые, возможно, связаны в обмене веществ с алкоксидиглицеридами [261]. В этой книге алкокси- и алкеноксидиглицериды подробно не рассматриваются.

Наибольшее значение среди нейтральных липидов имеют триглицериды. Эти соединения играют важную биологическую роль в жизнедеятельности растений, животных и микроорганизмов. Триглицериды — главный запасный продукт высших и низших растений: 90% видов растений содержат запасные жиры в семенах. Кроме семян, запасные триглицериды часто обнаруживаются в других покоящихся органах и тканях растений — клубнях, древесине, коре, зимующих древесных почках и т. д. Биологически триглицериды весьма выгодны организму как запасные вещества, поскольку на единицу объема они содержат вдвое большее количество энергии, чем углеводы. Как правило, переход сахара и крахмала в глицериды начинается после прекращения активного роста ткани или органа. Это прекращение может вызываться как внутренними факторами развития растений, так и условиями питания (например, отсутствием доступного азота). В обоих случаях накопление триглицеридов в тканях может быть весьма значительным: так, в отечественных сортах подсолнечника содержание жира достигает 60% от веса ядра, а в лишенных усвояемого азота клетках водоросли хлореллы — 80% сухого веса. При возобновлении роста богатых запасным жиром растительных клеток и тканей эти запасы под действием трансацилаз, липаз и других ферментов быстро мобилизуются и превращаются в подвижные сахара, которые используются как для биосинтеза белка при построении биологических мембран в интенсивно растущих тканях, так и для создания энергетического фонда аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) в процессе окислительного фосфорилирования.

У животных триглицериды являются конечными или временными запасными продуктами. Конечные запасы, например глицериды молочного жира, не подлежат использованию самим организмом. К временным запасным продуктам относятся триглицериды жировых тканей и печени, которые при необходимости легко мобилизуются, превращаются в другие соединения или служат источником энергии. В регуляции отложения и мобилизации триглицеридов у животных решающее значение имеют гормональные факторы, а сами эти процессы осуществляются при участии транспортной формы глицеридов в животном организме — хиломикронов кровеносной и лимфатической систем. Весьма велика роль триглицеридов в ряде патологических состояний организма животных и человека — атеросклерозе, ожирении, жировом перерождении печени и др.

Отметим, наконец, важную роль триглицеридов как защитных веществ, помогающих растениям и животным переносить неблагоприятные условия внешней среды, в частности низкие температуры. Об этой их роли свидетельствует в первую очередь накопление большого количества триглицеридов в подкожной жировой ткани млекопитающих полярных морей и впадающих в зимнюю спячку наземных млекопитающих (сурки, медведи). В растительном мире это явление выражается в запасании масла в семядолях зимующих семян, позволяющем сохранить зародыш в условиях зимы. Если в тропиках 5% растений запасают в семенах триглицериды, то в умеренном поясе такие семейства составляют уже 80% от общего количества. У деревьев умеренного пояса при переходе в состояние покоя запасный крахмал древесины превращается в глицериды, повышающие морозостойкость ствола. Число подобных примеров можно было бы умножить.

Все изложенное показывает, что исследование состава, строения и биосинтеза триглицеридов весьма актуально. В настоящее время оно представляет одну из главных задач химии и биохимии липидов.

История исследования номенклатура и изомерия триглицеридов

Проблема строения триглицеридов, несмотря на ее большое теоретическое и практическое значение, усиленно стала разрабатываться лишь в последние 10—15 лет. Еще в 1823 г. Шеврель раскрыл химическую природу триглицеридов как сложных эфиров жирных кислот и глицерина, а в 1860 г. Бертло показал, что в одном и том же глицериде могут содержаться ацилы разных кислот. Тем не менее до конца ХІХ в. существовала только однокислотная теория строения, согласно которой природные жиры — это смеси однокислотных (простых) триглицеридов; трипальмитина, триолеина и др. Смешанно-кислотные триглицериды впервые выделили кристаллизацией из ряда жиров в начале ХХ в., а в 1927 г. Хилдитч провел первые количественные исследования глицеридного состава и доказал, что глицериды такого типа преобладают в природных жирах. Изучение триглицеридов современными методами началось лишь в 50-х годах ХХ в. [368, 689].

Тривиальное обозначение полного сложного эфира глицерина и жирных кислот названием «триглицерид» прочно вошло в научный и практический обиход. Кауфман [501] разработал систему тривиальной номенклатуры для обозначения двух- и трехкислотных триглицеридов. По этой номенклатуре в названии триглицерида короткие ацилы указываются раньше, чем ацилы с более длинной цепью, насыщенные (S-) ацилы — раньше ненасыщенных (U-) ацилов; мононенасыщенные ацилы — раньше диненасыщенных; ацилы с первой двойной связью, расположенной ближе к карбоксилу, — раньше, чем соответствующие ацилы с большим расстоянием между первой двойной связью и карбоксилом; цис-ненасыщенные — раньше, чем транс-ненасыщенные; незамещенные в цепи — раньше, чем замещенные, и нециклические ацилы — раньше, чем циклические. Если данный U-ацил отличается от других U-ацилов глицерида меньшей ненасыщенностью, но большей длиной цепи, то в названии его ставят на последнее место (например, линолеолиноленоэруцин). Сокращенное обозначение триглицерида, строение которого неизвестно, ставится в круглые скобки [501]. По женевской номенклатуре правильно наименование «три-О-алканоилглицерин» или «триалканоат глицерина».

В работах, цитируемых в этой книге, применяли различные системы обозначения абсолютной конфигурации липидов (эти системы описаны ниже, стр. 122). При рассмотрении отдельных работ номенклатура, использованная их авторами, сохраняется. В тех случаях, когда система номенклатуры авторами не указана, для обозначения липидов применяются их традиционные названия. Ниже приведены также названия согласно принятой сейчас официально sn-номенклатуре [52]: триглицерид — триацилглицерин, диглицерид — диацилглицерин, моноглицерид — моноацилглицерин, 1(3)-моноглицериды — rac-1-моноацилглицерины, 1,2(2,3)-диглицериды — rac-1,2-диацилглицерины, тристеарин — тристеарат глицерина, олеопальмитостеарин (строение и абсолютная конфигурация неизвестны) — Х-олеат-пальмитат-стеарат глицерина, 2-пальмитостеаропальмитин — Х-1,2-дипальмитат 3-стеарат глицерина и т. д. Ацильные остатки жирных кислот в составе глицеридов обозначаются: стеарат, пальмитат, олеат и т. д., как это принято и в sn-системе [52].

Проблема изомерии, т. е. наличия в жирах триглицеридов с одинаковой эмпирической формулой, но имеющих разное строение, играет важную роль, поскольку содержащиеся в жирах десятки и сотни различных жирных кислот могут образовывать сотни тысяч и миллионы триглицеридов. Изомерия триглицеридов вызывается изомерией жирных кислот (см. выше), а также положением остатков последних в глицеридной молекуле (например, СОО и ОСО; С и О — остатки стеариновой и олеиновой кислот). Частным случаем изомерии является метамерия, например, СЛС и СОО (Л — остаток линолевой кислоты). Несимметричным триглицеридам (содержащим разные ацилы в 1- и 3-положениях) свойственна, кроме того, оптическая изомерия (стр. 122).

Категории состава жирных кислот и триглицеридов

Изучению триглицеридов посвящены сотни работ, однако до сих пор ни для одного природного жира еще нельзя привести полного глицеридного состава, который включал бы все минорные компоненты, стереоизомеры и возможные полиморфные формы триглицеридов. Применение современных методов во много раз снизило величину необходимой для анализа пробы и длительность определения; тем не менее из-за многочисленности триглицеридов и близости их между собой по физическим и химическим свойствам глицериды природных жиров исследованы гораздо меньше, чем жирные кислоты. Трудность глицеридного анализа усугубляется тем, что биологический материал обычно различен по генотипу; кроме того, свойства жира сильно подвержены фенотипическим изменениям, которые могут вызываться, например, климатическими факторами и разной зрелостью семян в образце (у растений) или получением жировых тканей от разных особей животных, содержавшихся на неодинаковом рационе. Методы анализа триглицеридов в запасающих тканях, отдельные участки которых различаются по жирнокислотному составу, появились лишь в последнее время [643]. Из-за упомянутых осложняющих факторов найденные в жире данного биологического вида концентрации отдельных триглицеридов обычно не воспроизводятся точно, а более или менее широко колеблются около определенного среднего значения.

Сложность триглицеридного состава приводит также к тому, что его расшифровка невозможна при помощи только одного из современных аналитических методов, а требует сочетания нескольких методов исследования, основанных на различных физических и химических принципах. При использовании каждого такого сочетания нельзя получить аналитически полных результатов. То или иное сочетание методов позволяет проанализировать природные жиры с различной глубиной, дает результаты разной полноты, т. е. приводит к определению той или иной категории триглицеридного состава. Аналогичные категории можно обнаружить и для жирнокислотного состава липидов при его изучении различными методами. Если данное сочетание методов позволяет определить концентрацию в природной смеси не для индивидуальных веществ, а только для целых групп липидов, объединяемых каким-либо общим количественным признаком состава или строения (числом атомов углерода, числом двойных связей и др.), то этому сочетанию соответствует категория, относящаяся к групповым. Если же в результате анализа можно обнаружить содержание индивидуальных жирных кислот или триглицеридов, то следует говорить об индивидуальных категориях состава. Состав липидной смеси обычно выражают в молярных или весовых процентах отдельных компонентов.

В настоящее время можно выделить 23 групповые и индивидуальные категории состава жирных кислот и триглицеридов. Ниже приводятся характеристики этих категорий.

Жирнокислотный состав

Групповые категории состава

1. Углеродный состав — величины содержания групп жирных кислот, характеризуемых тем или иным числом атомов углерода (m), в % от суммы кислот.
2. Олефиновый состав — величины содержания групп жирных кислот, характеризуемых тем или иным числом двойных связей (e), в % от суммы кислот.
3. Фракционный состав — величины содержания фракций жирных кислот, характеризуемых тем или иным значением полярности молекулы (PN), в % от суммы кислот.

Индивидуальные категории состава

4. Типовой состав — величины содержания суммы насыщенных кислот ([S] = [¹S] + [²S] + ... + [ⁿS]) и суммы ненасыщенных кислот ([U] = [¹U] + [²U] + ... + [ⁿU]), в % от суммы кислот (n — число жирных кислот в жире).
5. Видовой состав — величины содержания индивидуальных видов жирных кислот ([¹S], [²S], ..., [ⁿS]; [¹U], [²U], ..., [ⁿU]), характеризуемых тем или иным числом атомов углерода и двойных связей, в % от суммы кислот.
6. S-видовой состав — величины содержания суммы насыщенных кислот ([S]), а также индивидуальных ненасыщенных кислот ([¹U], [²U], ..., [ⁿU]), характеризуемых тем или иным числом атомов углерода и двойных связей, в % от суммы кислот.
7. Изомерно-видовой состав — величины содержания изомерных видов жирных кислот, характеризуемых тем или иным числом атомов углерода и двойных связей, а также тем или иным положением двойных связей в цепи, в % от суммы кислот.
8. Оксикислотный состав — величины содержания индивидуальных жирных кислот, характеризуемых — тем или иным числом атомов углерода и двойных связей, а также числом гидроксильных групп, в % от суммы кислот.
9. Возможные полиморфные формы видов жирных кислот данного жира.

Триглицеридный состав

Групповые категории состава

10. Углеродный состав — величины содержания групп триглицеридов, характеризуемых тем или иным числом атомов углерода суммы ацилов (m), в % от суммы триглицеридов.
11. Олефиновый состав — величины содержания групп триглицеридов, определяемых тем или иным числом двойных связей (e), в % от суммы триглицеридов.
12. Фракционный состав — величины содержания фракций триглицеридов, характеризуемых тем или иным значением полярности молекулы (PN), в % от суммы триглицеридов.
13. Углеродно-фракционный состав — величины содержания групп триглицеридов, определяемых тем или иным числом атомов углерода, в каждой из фракций триглицеридов, характеризуемых тем или иным значением полярности молекулы, в % от суммы триглицеридов.

Индивидуальные категории состава

14. Типовой состав — величины содержания типов триглицеридов, характеризуемых тем или иным типовым составом жирных кислот ([S₃], [S₂U], [SU₂], [U₃]), в % от суммы триглицеридов.
15. Позиционно-типовой состав — величины содержания позиционных типов триглицеридов, характеризуемых тем или иным типовым составом жирных кислот, а также центральным или краевым положением ацилов отдельных типов в глицеридной молекуле ([SSS], [SSU], [SUS], [SUU], [USU], [UUU]), в % от суммы триглицеридов.
16. Видовой состав — величины содержания индивидуальных видов триглицеридов, характеризуемых тем или иным видовым составом жирных кислот (например, [О₂Л], [ПО₂] и др.; П — остаток пальмитиновой кислоты), в % от суммы триглицеридов.
17. Позиционно-видовой состав — величины содержания позиционных видов триглицеридов, характеризуемых тем или иным видовым составом жирных кислот, а также центральным или краевым положением ацилов отдельных видов в молекуле глицерида (например, [ОЛО], [ООЛ] и др.), в % от суммы триглицеридов.
18. S-Видовой состав — величины содержания индивидуальных триглицеридов, характеризуемых тем или иным S-видовым составом жирных кислот (например, [SO₂], [S₂Л] и др.), в % от суммы триглицеридов.
19. Позиционно-S-видовой состав — величины содержания индивидуальных триглицеридов, характеризуемых тем или иным S-видовым составом жирных кислот, а также центральным или краевым положением насыщенных ацилов и отдельных видов ненасыщенных ацилов в молекуле глицерида (например, [SOO], [SЛS] и др.), в % от суммы триглицеридов.
20. U-Видовой состав — величины содержания индивидуальных триглицеридов, характеризуемых тем или иным видовым составом насыщенных кислот, а также типовым составом ненасыщенных кислот (например, [ПU₂], [С₂U] и др.), в % от суммы триглицеридов.
21. Позиционно-U-видовой состав — величины содержания индивидуальных триглицеридов, характеризуемых тем или иным видовым составом насыщенных кислот, а также типовым составом ненасыщенных кислот и центральным или краевым положением отдельных видов или типов ацилов в молекуле глицерида (например, [ПUU], [CUC] и др.), в % от суммы триглицеридов.
22. Стереовидовой состав — величины содержания индивидуальных триглицеридов, характеризуемых тем или иным видовым составом жирных кислот, а также 1-, 2- или 3-положением отдельных видов ацилов (например, sn-1-пальмито-2,3-диолеин и др.), в % от суммы триглицеридов.
23. Возможные полиморфные формы триглицеридов стереовидового состава данного жира.

Как видно, из индивидуальных категорий триглицеридного состава пять категорий (15, 17, 19, 21 и 22) включают определение позиционного состава индивидуальных триглицеридов. Эти категории можно назвать позиционными; тогда все остальные групповые и индивидуальные категории триглицеридного состава будут относиться к непозиционным.

Прежде чем рассматривать сочетания основных физических и химических методов, используемых для установления отдельных категорий триглицеридного состава, необходимо коротко охарактеризовать важнейшие из этих методов. Различные современные хроматографические методы по разделяющей способности взаимно дополняют друг друга. Так, при помощи распределительной хроматографии и противоточного распределения триглицериды фракционируют по величине полярности, при помощи тонкослойной хроматографии на адсорбенте, содержащем ионы серебра, — согласно числу двойных связей, а путем газо-жидкостной хроматографии — по молекулярному весу.

С помощью последовательного применения к исследуемой природной смеси тех или иных видов разделения можно получить глицеридные фракции, которые по набору компонентов достаточно просты для того, чтобы их позиционно-видовой состав (ПВС) мог быть исследован методом липазного гидролиза. После теоретического расчета возможных групп полярности триглицеридов на основе жирнокислотного состава масла эти группы выделяют в виде отдельных фракций обращенно-фазовой хроматографией. Триглицериды каждой фракции анализируют, с одной стороны, методом газо-жидкостной хроматографии, а с другой — методом тонкослойной хроматографии на силикагеле, пропитанном ионами Ag⁺, в сочетании с газо-жидкостной хроматографией метиловых эфиров и с микрометодом липазного гидролиза. Одновременно проводят газохроматографический анализ триглицеридов и метиловых эфиров жирных кислот исходного масла.

Все эти исследования позволяют полностью определить ПВС масла с n = 4 (ΔmRD = 40; стр. 152); без применения обращенно-фазовой хроматографии такая расшифровка была бы невозможной [212]. Если изучаются триглицериды, составленные из пяти кислот, то приведенная схема позволит определить лишь видовой состав из 35 глицеридов; из 75 глицеридов ПВС можно будет количественно оценить только 69 благодаря присутствию в смеси неразделяемых дублетов с одинаковыми m и e. С дальнейшим ростом n задача все более усложняется; так, полное определение видового состава природных смесей, содержащих, подобно кокосовому, молочному или рыбьему жиру, десятки видов кислот, невозможно даже при сочетании всех современных методов [667]. В табл. 1 указаны главные сочетания методов анализа, обеспечивающие определение тех или иных категорий жирнокислотного и триглицеридного состава жиров.

Для вычисления различных категорий состава имеются два главных метода: 1) добавление точных количеств так называемых «внутренних стандартов» — метиловых эфиров пента- или гептадекановой кислот — к отдельным фракциям, выделенным распределительной или тонкослойной хроматографией, с последующим газохроматографическим определением веса этих фракций и 2) решение алгебраических уравнений, составленных по данным перечисленных выше методов анализа; минорные компоненты, а также «нечетные» и разветвленные жирные кислоты из такого вычисления обычно исключаются. Погрешность газохроматографического определения метиловых эфиров приводит подчас к получению несколько отличающихся значений концентрации одних и тех же триглицеридов в различных уравнениях. Если число разных методов в их сочетании недостаточно для определения данной категории состава, то число неизвестных превышает число независимых уравнений. В таких случаях в расчет приходится вводить произвольные допущения и, вместо точных количеств тех или иных триглицеридов, указывать лишь диапазоны возможных концентраций. Для расчета позиционно-типового состава (ПТС) природных жиров можно использовать электронные вычислительные машины (ЭВМ) [233, 350, 667, 782].

Таблица 1

Комбинированные методы определения отдельных категорий жирнокислотного и триглицеридного состава природных жиров

Примечание. Арабские цифры — номера категорий жирнокислотного и триглицеридного состава (стр. 12), определяемые данным сочетанием аналитических методов.

Количественные физические методы разделения и анализа: I — перегонка; II — кристаллизация; III — определение температуры плавления; IV — жидкостно-жидкостная экстракция или противоточное распределение; V — обращенно-фазовая распределительная хроматография: VI — тонкослойная или адсорбционная хроматография; VII — газо-жидкостная хроматография на неполярной фазе; VIII — газо-жидкостная хроматография на полярной фазе; ІХ — УФ-спектроскопия; Х — ИК- и ЯМР-спектроскопия; ХІ — определение оптического вращения; ХІІ — рентгеноструктурный анализ.

Количественные химические методы анализа: ХІІІ — щелочной гидролиз; XIV — то же, что и ХІІІ, и метилирование возникших при гидролизе жирных кислот; ХV — то же, что и XIV, и образование комплексов эфиров с ионами Ag⁺; XVI — липазный гидролиз; XVII — переэтерификация; XVIII — окислительное расщепление по двойным связям; ХІХ — присоединение к двойным связям водорода, галоидов или озона; XX — образование комплексов с ионами Ag⁺.

Продукты химических превращений исходных триглицеридов (А): Б — жирные кислоты; В — метиловые эфиры жирных кислот; Г — метиловые эфиры насыщенных кислот и комплексы метиловых эфиров ненасыщенных кислот с ионами Ag⁺; Д — смесь исходных триглицеридов, жирных кислот, 1,2 (2,3)-диглицеридов и 2-моноглицеридов; Е — статистическая смесь триглицеридов; Ж — смесь S₃, S₂Az, SAz₂ и A₃ (Az — остаток азелаиновой кислоты); И — тринасыщенные триглицериды, галоидопроизводные триглицеридов или озониды триглицеридов соответственно; К — тринасыщенные триглицериды и комплексы ненасыщенных триглицеридов с ионами Ag⁺.

*Строчные буквы — в сочетании с: а — гравиметрией, денситометрией, методом внутреннего стандарта, количественным определением глицерина или определением жирных кислот в виде их гидроксамовых производных; б — газо-жидкостной хроматографией метиловых эфиров жирных кислот; в — тонкослойной хроматографией Ag⁺-комплексов; г — липазным гидролизом триглицеридов или с их деацилированием реактивом Гриньяра; д — газо-жидкостной хроматографией триглицеридов; е — тонкослойной хроматографией липидов; ж — полным гидрированием двойных связей липидов; и — определением состава жирных кислот методом ультрафиолетовой спектрофотометрии после изомеризации двойных связей и определением иодного числа; к — синтезом метиловых эфиров азелаоглицеридов; л — исчерпывающим галоидированием двойных связей триглицеридов и титрованием избытка галоида; м — фракционной перегонкой метиловых эфиров жирных кислот; н — образованием Ag⁺-комплексов аллиловых эфиров азелаоглицеридов; п — кристаллизацией; р — образованием комплексов жирных кислот с мочевиной; с — окислительным расщеплением двойных связей ненасыщенных кислот; т — фосфорилированием 1,2(2,3)-диглицеридов или 1,3-диглицеридов и стереоспецифическим гидролизом образовавшихся фосфатидных кислот фосфолипазой А или в сочетании со стереоспецифическим фосфорилированием L-1,2-диглицеридов аденозинтрифосфатом в присутствии диглицеридкиназы; у — образованием Mg-солей азелаоглицеридов; ф — исчерпывающим присоединением озона к двойным связям триглицеридов, х — исчерпывающим присоединением меркаптоуксусной кислоты к двойным связям триглицеридов. / *

Теории строения триглицеридов

Все изложенное показывает, что экспериментальное определение даже простых категорий состава триглицеридов сопряжено со значительными трудностями. Поэтому уже давно пытаются найти правило или закономерность качественного и количественного глицеридного состава, которые можно было бы использовать для вычисления состава и строения триглицеридов по данным их жирнокислотного состава. Создание теорий, более или менее достоверно предсказывающих глицеридный состав природных жиров, преследует как практическую, так и теоретическую цель. Важно знать, как влияет строение глицеридов на использование данного жира в качестве пищевого или технического продукта. Так, масло какао и бараний жир имеют почти одинаковый жирнокислотный состав, однако масло какао, благодаря узкой области перехода из твердого состояния в жидкое, лежащей вблизи температуры тела человека, широко используется в пищевой промышленности, а твердый бараний жир с широким диапазоном плавления совершенно непригоден в этом отношении (стр. 182). Поэтому теория распределения ацилов в триглицеридах масла какао, если она будет известна, может послужить основой для получения дешевых заменителей этого масла из малоценного жирового сырья. Для решения имеющей большое экономическое значение проблемы фракционирования соевого масла на высоконенасыщенное техническое и содержащее меньше линоленовой кислоты пищевое масло необходимо знать закономерности распределения полиненасыщенных кислот в триглицеридах масла. Правильное использование переэтерификации природных жиров с целью создания новых пищевых и технических продуктов требует ясного представления о тех изменениях, которые этот процесс вызывает в строении и составе триглицеридов. Можно сказать, что знание теории распределения ацилов в триглицеридах так же важно для технолога, как для путешественника дорожная карта.

Состав природных триглицеридов исследован значительно подробнее, чем их биосинтез, и существующий разрыв необходимо заполнить. Теория строения триглицеридов призвана сыграть важную роль в уяснении механизма сборки отдельных ацильных остатков и образования упорядоченной структуры триглицеридных молекул. Если такая теория будет создана, то ее можно использовать как критерий достоверности каждой из вновь предлагаемых схем биосинтеза триглицеридов. В настоящее время имеются несколько эмпирических теорий строения, основанных чаще всего на умозрительных биосинтетических схемах, но тем не менее позволяющих вычислять типовой, видовой и другие категории глицеридного состава. Данные такого вычисления далеко не всегда соответствуют найденным экспериментально. В то же время расчет состава определенного жира, согласно различным теориям, приводит иногда к очень близким или даже идентичным результатам, что не дает возможности сделать выбор в пользу какой-либо одной из них. Поэтому в оценке существующих теорий сложились крайние, исключающие друг друга точки зрения.

Одни авторы утверждают, что та или иная теория универсальна, а наблюдаемые отклонения вызваны только методическими ошибками анализа. Согласно другому мнению, биосинтез триглицеридов настолько сложен, что состав возникающего природного жира можно определить лишь экспериментально, а достоверно описать системой математических уравнений нельзя; совпадение вычисленных и найденных данных возникает чисто случайно и по мере совершенствования методов исследования будет наблюдаться все реже [105, 107]. Возможно, наиболее правильной следует пока признать компромиссную точку зрения: ни одна из имеющихся сейчас теорий не универсальна, но отдельные теории пригодны для описания состава определенных групп природных жиров; для разных теорий такое описание различно по глубине, но ни одна из них не дает еще полной картины триглицеридного состава какого-либо жира. Подробное описание существующих теорий строения триглицеридов дано в главах 9—11.

Настоящая монография посвящена изложению современных достижений в области физических и химических методов анализа триглицеридов и составляющих их жирных кислот, данных по составу и строению природных триглицеридов, а также их биосинтезу. Монография не ставит целью быть справочным пособием по триглицеридному составу животных и растительных жиров; соответствующие данные приведены в известной книге Хилдитча [368].

I. Методы анализа триглицеридов и составляющих их жирных кислот

В методической части монографии не излагаются все методы исследования триглицеридов, перечисленные в табл. 1. Из физических методов анализа подробно описаны отдельные разновидности хроматографии и метод кристаллизации, из химических — переэтерификация, а из биохимических — установление позиционных категорий глицеридного состава путем липазного гидролиза и определение абсолютной конфигурации триглицеридов при помощи стереоспецифических ферментов липидного обмена. В заключительном разделе этой части рассматриваются современные методы исследования и свойства полиморфных модификаций кристаллических триглицеридов в зависимости от их строения и ненасыщенности. Большинство других методов исследования, в частности окислительных, описывается лишь попутно, с большей или меньшей обстоятельностью, в этой и последующих частях монографии. Остальные методы приведены в руководствах по химии жиров (см., например, [689]).

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ И НЕПОЗИЦИОННЫХ КАТЕГОРИЙ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Природные липиды обычно представляют собой смеси алифатических соединений различных классов, характеризуемых определенным числом тех или иных функциональных групп (стр. 24). Для предварительного фракционирования этих смесей на отдельные классы и выделения триглицеридов, ди- и моноглицеридов, жирных кислот, метиловых эфиров и т. д. служит метод адсорбционной хроматографии. Не случайно принцип хроматографии был открыт и применен М. С. Цветом в 1903 г. [37] как средство адсорбционного разделения именно липидных растительных пигментов. Открытая повторно в 1931 г. Куном и Ледерером [589], адсорбционная хроматография была впервые использована в анализе алифатических липидов Кауфманом в 1936 г. [501] и <\br> Траппе в 1940 г. [941]; до появления распределительной и газо-жидкостной хроматографии она в течение 10—15 лет служила основным методом разделения этих соединений. За последние годы данный вид хроматографии пережил «второе рождение» благодаря развитию методов адсорбционного разделения на бумаге и, особенно, тонкослойной хроматографии. В настоящее время исследователи в области биохимии липидов повседневно используют адсорбционную хроматографию в препаративном и аналитическом масштабе; она является единственным хроматографическим методом фракционирования сложных смесей липидов природного происхождения на отдельные классы и широко применяется для исследования олефинового состава липидов в пределах одного класса. Адсорбционной хроматографии липидов посвящено несколько сот экспериментальных исследований и ряд обзоров [71, 225, 226, 278, 389, 391, 682, 687, 722, 831, 832, 999].

Структурные различия липидов внутри отдельного класса, выделенного адсорбционной хроматографией, определяются в основном двумя параметрами — числом метиленовых групп, а также числом и положением двойных связей. Совокупность липидов, у которых один из этих параметров постоянен, а другой монотонно изменяется, образует гомологический ряд, причем каждый класс может содержать один или несколько таких рядов. При хроматографии на необработанном адсорбенте разделение классов на гомологические ряды и разделения внутри рядов, как правило, не происходит, поскольку различия между липидами по величине полярности, имеющиеся внутри класса, незначительны по сравнению с теми сдвигами полярности, которые вызываются функциональными группами. Однако столь слабые различия оказываются вполне достаточными для разделения липидов внутри классов и гомологических рядов методом распределительной хроматографии. Следует отметить, что этот укоренившийся сейчас термин нельзя признать удачным, так как масса распределяется между твердой, жидкой или газовой фазами при любом хроматографическом разделении; здесь и ниже имеется в виду система двух жидких фаз — подвижной и неподвижной, которые не смешиваются между собой. Распределительная хроматография, разработанная в 1941 г. Мартином и Синджем [690], нашла применение в области липидов только в 1948 г. в работах Рамсая и Паттерсона [809] и исследованиях Дж. Болдинга [111].

После появления методов адсорбционной и распределительной хроматографии удалось значительно расширить наши представления о строении и обмене липидов в живых организмах. Однако использованию этих видов анализа в химии липидов мешали многие недостатки: большая затрата времени для достижения удовлетворительного разделения, недостаточная воспроизводимость анализа и большая его трудоемкость, совпадение величин распределения насыщенных и ненасыщенных липидов и т. д. В поисках метода эффективного разделения сложных смесей липидов жи- <\br> вотного организма, которые могут насчитывать 60 и более различных компонентов, английские биохимики Джеймс и Мартин открыли в 1952 г. совершенно новый вид хроматографии — газо-жидкостную хроматографию [436]. В данном случае разделение смеси основано на различном распределении компонентов между двумя фазами — неподвижной жидкой фазой, нанесенной на твердый носитель хроматографической колонки, и проходящим через колонку газом. При давлениях, близких к атмосферному, газы по сравнению с жидкостями имеют значительно меньшую плотность и вязкость, поэтому сопротивление колонки газовому потоку сравнительно невелико. Это обстоятельство позволяет достичь большой скорости анализа при весьма высокой эффективности разделения, которая обеспечивается интенсивным массообменом на поверхности неподвижной фазы. Концентрацию выходящих из колонки органических паров можно непрерывно автоматически регистрировать, определяя те или иные их физические свойства. Преимущества газо-жидкостной хроматографии выдвигают ее сейчас среди других разновидностей хроматографии. Этим методом разделяют метиловые эфиры жирных кислот, свободные жирные кислоты, триглицериды, производные моно- и диглицеридов и т. д. Для некоторых из перечисленных соединений газо-жидкостная хроматография является наилучшим способом разделения и количественного определения.

В методической части монографии не приведены многочисленные работы, в которых отдельные разновидности хроматографии липидов использовались лишь в чисто аналитических целях и которые не содержат оригинального материала по теории и технике самого метода. Почти не затронуты исследования по хроматографии алифатических соединений с короткой цепью (m ≤ 8), а также стероидов, эфирных масел и других производных изопрена. Подробные сведения по теоретическим основам того или иного хроматографического метода не приводятся и не дается описание особенностей применяемой аппаратуры; соответствующие данные содержатся в руководствах и обзорах по адсорбционной [41, 356, 622, 891], распределительной [24, 33, 39, 72, 168, 278, 390, 501, 582, 709, 724, 832, 852, 875, 966, 993] и газо-жидкостной хроматографии [7, 10, 17—19, 22, 34, 38, 160, 272, 435, 540, 630, 632, 793, 794].

Из других методов анализа триглицеридного состава жиров в этом разделе рассматривается кристаллизация из растворителей при низких температурах — метод, широко применявшийся в прошлом, но подчас используемый и в настоящее время.

Глава 1. АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ОСОБЕННОСТИ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ЛИПИДОВ

В адсорбционной хроматографии поток жидкости вызывает селективную миграцию компонентов смеси в пористой среде с высокой адсорбирующей способностью из узкой стартовой зоны. В большинстве случаев адсорбентом для разделения липидов служит силикагель или кремнекислота. Эти термины обозначают соединения, близкие по составу. Они представляют собой сыпучие тела с микропористой структурой, соответствующие формуле SiO₂ · Н₂О и образующиеся из щелочного силиката в процессе дегидратации и полимеризации ортокремневой кислоты H₄SiO₄ в сильнокислой среде. Силикагель можно получить из H₄SiO₄ и в солевом растворе, например в растворе NН₄СІ. Такой силикагель не содержит на поверхности участков с кислыми свойствами и как адсорбент существенно отличается от силикагеля, полученного в кислой среде [339]. Из отечественных сортов силикагеля для адсорбционной хроматографии чаще всего применяется силикагель КСК [1а, 6].

Внутренняя часть зерен кремнекислоты и силикагеля представляет собой силоксан тетраэдрического строения (—Si—O—Si—), лишенный адсорбционных свойств. Адсорбирующая способность материала связана исключительно с поверхностными группами силанола (— Si — ОН), которые обычно удерживают при помощи водородных связей мономолекулярный слой «свободной» воды [785]:

  -Si-O-Si-
   |     |
   O     O
   |     |
   H     H
   |     |
  HOH   HOH

При нагревании до 110—120° монослой удаляется, но может быть восстановлен прибавлением к адсорбенту определенного количества воды. Наиболее эффективное разделение при адсорбционной хроматографии липидов обеспечивает силикагель, который удерживает в мономолекулярном слое 8—15% «свободной» воды [225, 806]. Если силикагель содержит более 25% «свободной» воды, то сродство липидов к адсорбенту резко падает.

Липиды из живых тканей обычно характеризуют по их полярности, определяющей величину адсорбционного сродства. Различают нейтральные липиды, включающие углеводороды, стерины и их эфиры, глицериды, свободные и этерифицированные жирные кислоты и др.; другую группу составляют полярные липиды — <\br> фосфо-, глико- и сульфолипиды. Сведения о химической природе липидов содержатся в монографии [342].

Адсорбция нейтральных липидов на поверхности силикагеля обусловлена образованием водородных связей между полярными силанольными группами адсорбента и функциональными группами липидных молекул. По степени полярности функциональные группы располагаются в следующий ряд [736]:

—OCH₃<—HC—CH—<—COOCH₃<C=O<CHO<—NH₂<OH<—COOH.

Совокупность липидов, близких по составу и свойствам и характеризуемых присутствием тех или иных функциональных групп, обычно называют классом липидов. Природа и количество функциональных групп в липидной молекуле и, следовательно, общая способность молекул к образованию водородных связей определяют величину сродства данного класса липидов к адсорбенту. Поскольку содержание неполярных метиловых и метиленовых групп, а также ненасыщенных связей обычно мало влияет на адсорбцию, отдельные классы дают на хроматограмме однородные по составу зоны [831, 833]. В пределах одного и того же класса вещества с большим числом атомов углерода и меньшим числом е преимущественно накапливаются во фронтальной части хроматографической зоны [682].

На силикагеле, пропитанном раствором AgNO₃, между ненасыщенными липидами и ионами Ag⁺ возникают лабильные координационные комплексы, полярность которых значительно меняется в зависимости от числа двойных связей, их положения в молекуле и стереоизомерии. В такой хроматографической системе хорошо разделяются липиды, отличающиеся друг от друга по количеству двойных связей только на Δе = 1 [969].

При адсорбционной хроматографии на обычном силикагеле в системе гексан : эфир : уксусная кислота наблюдается следующий порядок роста полярности нейтральных липидов и соответственно убывания их относительной хроматографической подвижности: н-углеводороды, воска, эфиры стеринов, метиловые эфиры жирных кислот, жирные альдегиды, триглицериды, жирные кислоты, жирные спирты, 1,3-диглицериды, 1,2(2,3)-диглицериды, стерины, жирные оксикислоты, 1(3)-моноглицериды, 2-моноглицериды [218, 220, 225, 245, 330, 533, 555, 679, 684, 836, 967]. В зависимости от эффективности данного адсорбционно-хроматографического метода стоящие в ряду по соседству нейтральные липиды могут отделяться друг от друга или же мигрировать совместно в одной зоне хроматограммы. На некоторых сортах силикагеля при отсутствии уксусной кислоты в растворителе свободные жирные кислоты остаются на старте.

Подвижность липидов при разделении зависит не только от силы адсорбента и содержания функциональных групп в липидной молекуле, но и от полярности применяемой системы раство- <\br> рителей. Ряд растворителей, расположенных в порядке возрастания их диэлектрической постоянной и элюирующей способности по отношению к адсорбированным липидам, Траппе назвал элюотропным рядом: петролейный эфир < циклогексан < CCl₄ < < бензол < CHCl₃ < CH₂Cl₂ < эфир < этилацетат < ацетон < < этанол < метанол < уксусная кислота [941].

Ниже рассматриваются отдельные виды адсорбционной хроматографии липидов в порядке их возникновения, начиная с методов, давно вошедших в лабораторную практику, и кончая самой новой разновидностью — хроматографией в тонком слое.

ВЫТЕСНИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ И НЕКОТОРЫЕ ДРУГИЕ РАЗНОВИДНОСТИ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

При адсорбционной хроматографии подвижность компонентов определяется не только их сродством к адсорбенту, но и взаимодействием компонентов друг с другом. Вещества, адсорбируемые сильнее, вытесняют с поверхности адсорбента менее прочно связанные вещества. На принципе вытеснения одних компонентов другими основана одна из разновидностей адсорбционной хроматографии, называемая вытеснительной хроматографией.

В форме вытеснительной хроматографии адсорбционная хроматография липидов была впервые применена Хольманом [389]. На колонке, наполненной активированным углем Darco G-60, при элюировании петролейным эфиром разделили лауриновую и стеариновую кислоты; пальмитиновая кислота от стеариновой не была отделена [167]. Применяя в колонках водный этанол, выделили фракции, обогащенные пальмитиновой и стеариновой кислотами [165, 297].

В отличие от адсорбции на минеральных адсорбентах, адсорбция липидов на угле возрастает с увеличением m и снижением е; липиды обнаруживают здесь криволинейную изотерму адсорбции, т. е. их коэффициент распределения снижается при уменьшении концентрации разделяемого вещества в хроматографическом растворителе. Поэтому для фракционирования можно применить вытеснительную хроматографию. В колонку с углем вносили смесь жирных кислот с m = 16—20, а затем промывали колонку спиртовым раствором бегеновой кислоты (m = 22), которая служила вытеснителем. Бегеновая кислота, обладающая более высоким сродством к адсорбенту, чем все компоненты разделяемой смеси, вытесняла арахиновую кислоту; последняя, смещаясь по колонке, вытесняла стеариновую кислоту, а та в свою очередь — пальмитиновую кислоту, которая и выходила первой из колонки в виде отдельной фракции. Затем собирали фракции следующих кислот в порядке возрастания m [389]. Этот метод применили для разделения полиненасыщенных кислот рыбьего жира, а также простых эфиров глицерина и жирных спиртов [391]. <\br> Основной недостаток описанной методики заключается в том, что при переходе от одной фракции к другой элюат содержит обе соседние кислоты. Для количественного разделения компонентов применяли вытеснительную хроматографию с носителем. В колонку вносили смесь изомеров с m = 18: 2-амил-3-метил-додекановой, 2-гептилундекановой и 2-метилгептадекановой кислот; носителями для этих кислот служили соответственно метиловые эфиры лауриновой, миристиновой и пальмитиновой кислот, которые вводили одновременно с разделяемой смесью, причем количество носителя в 10 раз превышало количество пробы. Колонку промывали раствором вытеснителя — 1%-ного метилстеарата в 95%-ном этаноле. Выход эфиров из колонки регистрировали рефрактометром. Чистые фракции изомеров, которые элюировались в виде узкой зоны непосредственно перед фронтом соответствующего носителя, определяли титрованием [391].

В настоящее время почти не применяются такие разновидности адсорбционной хроматографии, как фронтальный анализ, который ранее использовали для предварительной оценки состава смеси перед разделением [389]. Для выделения свободных жирных кислот (СЖК) из смеси с моно-, ди- и триглицеридами ранее применяли ионообменную хроматографию на Амберлите IR-A 400 [114, 607]; сейчас показано, что поглощенные колонкой кислоты нельзя элюировать количественно [666]. На колонке с мочевиной достигли некоторого разделения нормальных и разветвленных жирных кислот; 1%-ный раствор метанола в изооктане извлекал из колонки преимущественно разветвленные кислоты [71].

ХРОМАТОГРАФИЯ НА КОЛОНКАХ С МИНЕРАЛЬНЫМИ АДСОРБЕНТАМИ

Хроматография на колонках была разработана раньше других адсорбционно-хроматографических методов. Этот метод часто используется и в настоящее время.

Хроматографические колонки могут иметь разное отношение диаметра к длине. Уменьшение диаметра увеличивает эффективность разделения, но в очень узкой колонке скорость тока растворителя сильно снижается [206, 225, 376, 645, 674, 831]. При адсорбционно-хроматографическом разделении часто наблюдаются искривление фронта зоны и ее расширение из-за диффузии вещества в колонке; этих нежелательных явлений можно в значительной степени избегнуть, используя составные колонки, у которых каждое последующее звено уже и длиннее предыдущего. Термостатирование водяной рубашкой улучшает воспроизводимость разделения [90, 389, 852, 970]. В элюате из колонки обычно содержится некоторое количество мелких частиц адсорбента, что может мешать химическому и биологическому изучению полученных липидов [999]. <\br> Используемый размер зерна адсорбента для колонок — от 100 до 325 меш; лучше применять узкий диапазон размеров частиц. При крупных зернах эффективность разделения больших количеств липидов снижается из-за быстрого протекания растворителя через колонку, тогда как при размере частиц менее 325 меш скорость потока резко падает [164, 330, 622, 666]. Раньше для ускорения протекания адсорбент смешивали с крупнозернистым кизельгуром или Целитом; сейчас этот способ применяют редко, поскольку включение в адсорбент еще одного переменного фактора нежелательно [98, 282, 327, 343, 345]. Поток можно усилить, применяя давление очищенного азота от 1 атм и выше; при этом надо иметь в виду, что продолжительное пребывание колонки под давлением приводит к уплотнению адсорбента и снижению скорости протекания [607, 823].

Колонку заполняют суспензией адсорбента в наименее полярном из применяемых в данном опыте растворителей — гексане, хлороформе и т. д. [395, 970]. Для удаления излишней воды и стабилизации влажности адсорбента колонку кондиционируют, пропуская через нее в изотермических условиях ацетон, смесь ацетона с эфиром (1 : 1), эфир и, наконец, петролейный эфир до полного удаления всех предыдущих растворителей, не адсорбированных на поверхности частиц; для стабилизации пользуются также бензолом и гексаном [581]. Часто рекомендуют вымывать метанолом избыток влаги в адсорбенте еще до использования других растворителей; при этом не учитывают, что спирты, подобно воде, образуют на поверхности кремнекислоты мономолекулярный слой, который не смещается другими растворителями и снижает адсорбирующую способность [276, 335, 634, 999].

При разделении нейтральных липидов скорость тока (0,1—2,5 мл/мин) зависит от условий опыта; при анализе продуктов присоединения по двойным связям липидов эта скорость выше обычной [806, 969, 985]. Перед анализом ненасыщенных липидов рекомендуется обрабатывать адсорбенты и растворители очищенным азотом, а все операции проводить без доступа воздуха [831].

Из адсорбентов в колоночной хроматографии чаще всего используется силикагель. Адсорбент предварительно активируют при 110—120° в течение 12—24 час., а колонку наполняют в вакууме при помощи вибратора [114, 226, 398]. На нейтральном силикагеле липиды делятся на классы разной полярности. Для количественного отделения СЖК от других липидов адсорбент обрабатывают 5%-ным раствором КОН в изопропиловом спирте в течение 5 мин. [666]. Для разделения метиловых эфиров жирных кислот и триглицеридов по величине е [330] используют силикагель, пропитанный AgNO₃ (стр. 24). При хроматографии на силикагеле гидролиза, разрушения или необратимого связывания нейтральных липидов не наблюдается. Отмечалась лишь изомеризация 2-моноглицеридов в 1(3)-изомеры, катализируемая спиртами [711, 791]. <\br> Во флоризиле содержится 15% химически связанной окиси магния (—Si—O—Mg—ОН или — Si—O—Mg—O—Si—); он может быть получен прибавлением MgSO₄ к раствору Na₂SiO₃, отмыванием сульфата натрия и нагреванием адсорбента до 1200°. Несмотря на большой размер зерна и, следовательно, более высокую скорость потока жидкости, флоризил по площади адсорбирующей поверхности на единицу объема не уступает лучшим сортам силикагеля [164]. Флоризил, содержащий 7% воды, пригоден для разделения смесей нейтральных липидов на отдельные классы и для отделения метиловых эфиров жирных 2-оксикислот от других липидов [108, 162, 577]. Трехкратным нагреванием адсорбента с концентрированной НСІ можно получить адсорбент, не содержащий MgO, свободного силиката и сопутствующих солей. Такой адсорбент по свойствам не отличается от силикагеля; благодаря крупнозернистости материала приготовление колонок и разделение липидов занимают не более 4—5 час. [163].

В работах раннего периода для разделения отдельных классов липидов (неомыляемых, метиловых эфиров жирных кислот, глицеридов и СЖК) использовали колонки, наполненные окисью алюминия [71, 285, 701, 941, 942, 983, 986, 992]. Этот адсорбент может вызывать гидролиз сложных эфиров и изомеризацию двойных связей и потому сейчас применяется для хроматографии липидов сравнительно редко — например, для разделения эфиров кислот, у которых к двойным связям присоединены перекисные группы, бром или ацетат ртути [97, 403, 588]. Для фракционирования метилолеата, -линолеата и -линолената, а также их ацетоксимеркуриметокси-(АОММО-) производных использовали колонки с кизельгуром [440].

Окись магния применяли для анализа липидов лишь в начальный период развития адсорбционной хроматографии, в связи с тем что этот адсорбент малоэффективен. Так, для отделения олеиновой кислоты от стеариновой на колонке MgO требуется более 17 суток. Аддукты жирных кислот и 2,4-динитробензосульфохлорида разделяли на MgSO₄ [114, 305, 877]. В настоящее время MgO и MgSO₄ в хроматографии липидов не используются.

Метилолеат, -линолеат и -линоленат, и также их цис-, транс-изомеры разделяли на катионообменных смолах, пропитанных AgNO₃ [263, 1002].

Для получения хроматограммы и анализа отдельных фракций пробу липидов вносят в верхнюю часть колонки в смеси с адсорбентом или чаще в минимальном объеме петролейного эфира, бензола или хлороформа [838]. Размер пробы зависит от природы адсорбента и разделяемых липидов; при перегрузке колонки ее эффективность резко снижается [755]. Длительность разделения на колонке обычно 8—24 час. (иногда до 200 час.) [327].

Выход нейтральных липидов и АОММО-производных метилолеата и метиллинолеата из колонки обычно составляет 95—100%; для АОММО-производного метиллинолената выход не превышает <\br> 56% из-за сильной адсорбции [985]. В ранних работах из колонки после разделения вырезали окрашенные участки, содержащие производные жирных кислот, окрашенные вещества элюировали и колориметрировали [305, 877]. Сейчас идентификацию и количественное определение липидов проводят после сбора отдельных фракций элюата. Для количественного анализа фракции взвешивают или же определяют в них органическое вещество путем его окисления 0,1 н. раствором Na₂Cr₂O₇ и последующей колориметрии [839а]. Иногда проводят элементарный анализ полученных фракций или определяют в них функциональные группы. По полученным данным строят кривые элюирования, где площадь каждого пика отражает содержание соответствующего компонента в смеси [76, 330]. Эти кривые можно также получить при помощи самопишущего рефрактометра, установленного на выходе колонки, и по поглощению инфракрасного (ИК) света С=О-группами липидов при 1745 см⁻¹. Оптические кривые элюирования обычно совпадают с гравиметрическими [161, 814, 1001].

Для идентификации липидов в элюате определяют кислотное и иодное числа [756, 816], содержание сложноэфирных связей [376], ИК-спектр [588] или радиоактивность [607]. Кривые элюирования для моно-, ди- и триглицеридов строили по содержанию во фракциях глицерина [108], а для АОММО-производных метиловых эфиров — по реакции на ртуть с S-дифенилкарбазоном [440]. Выделенные классы липидов идентифицировали хроматографией на бумаге, пропитанной кремнекислотой [164, 237, 1014], или при помощи тонкослойной хроматографии [831], а жирнокислотный состав классов устанавливали газо-жидкостной хроматографией [160a, 277, 441, 984].

Сложную смесь липидов, сильно различных по полярности, обычно нельзя разделить на колонке одним растворителем. Работы школы Т. Рейхштейна показали, что в таких случаях в хроматографическую систему надо последовательно вводить растворители возрастающей полярности. Эта полярность может изменяться ступенчато, если данный растворитель после выхода из колонки определенного класса липидов сразу заменяется следующим, более полярным. Если же два растворителя разной полярности непрерывно смешиваются, то создается плавный возрастающий градиент концентрации более полярного компонента в смеси, т. е. градиент элюирующей способности растворителя [622, 815].

Обычно рекомендуется использовать ступенчатое элюирование, как более быстрое и простое по выполнению [225]. Предварительно полярность отдельных систем растворителей в применении к данной смеси липидов можно определить при помощи хроматографии на бумаге из стеклянных волокон. Порядок выхода липидов из колонок был указан выше (стр. 24) [501, 999].

Для разделения нейтральных липидов на отдельные группы классов, близких по полярности, применяли простые по составу смеси растворителей. Так, сумму нейтральных липидов можно <\br> элюировать хлороформом или эфиром. После удаления последних, СЖК, адсорбированные на силикагеле с высоким содержанием силиката К, элюировали 2%-ным раствором НСООН в эфире [666]. При фракционировании смеси липидов на классы разной полярности обычно применяют раствор эфира в петролейном эфире: 1%-ный для выделения восков и метиловых эфиров кислот, 4%-ный — для триглицеридов, 50%-ный — для жирных кислот, 60%-ный — для диглицеридов и чистый эфир — для моноглицеридов [711]. При работе на сильно адсорбирующих колонках флоризила полярность смесей этих растворителей возрастала более резко, чем в предыдущем случае, а СЖК элюировались лишь раствором СН₃СООН в эфире. Для разделения восков смесь эфира с петролейным эфиром можно заменить бензолом, хлороформом, пропанолом или уксусной кислотой [591].

Адсорбционная хроматография была использована для частичного разделения бинарных смесей метиловых эфиров жирных кислот, причем с увеличением е эффективность разделения сильно снижалась. В качестве растворителей были использованы смеси петролейного эфира с эфиром и бензолом. При хроматографии на силикагеле или окиси алюминия в анаэробных условиях с применением растворов эфира в гексане получили препараты метиловых эфиров линолевой, линоленовой, арахидоновой, эйкозапентаеновой и докозапентаеновой кислот с чистотой 92—99%. Метиловые эфиры жирных кислот, содержащих разное число ОН-групп и тройных связей, разделялись полностью [358, 600, 825]. Хроматография триглицеридов растительных масел на колонках с минеральными адсорбентами не привела к выделению отдельных видов глицеридов, однако крайние фракции элюата могли различаться по иодному числу на 65—70 ед. Для разделения моно-, ди- и триглицеридов на силикагеле и флоризиле применяли смеси этилового эфира с бензолом, изопропилового эфира с изооктаном и этанолом и петролейного эфира с хлороформом и ацетоном; в результате эти глицериды полностью отделялись друг от друга и от примеси минерального масла [992].

Для фракционирования липидов по е применяли хроматографию продуктов присоединения по двойным связям. Метиловые эфиры жирных кислот, содержащие перекисные или диоксигруппы, разделяли смесью метанола с СН₂Сl₂. Реакция ненасыщенных кислот с 2,4-динитробензосульфохлоридом с образованием окрашенных продуктов присоединения служила для хроматографического выделения производных линоленовой, линолевой, олеиновой и насыщенных кислот на MgSO₄ при использовании смеси бензола с эфиром 19 : 1 в качестве растворителя [97, 877]. Бромирование усиливает адсорбцию липидов и обеспечивает полное разделение эфиров кислот с разным е; диастереоизомеры с одинаковым содержанием брома почти не отделялись друг от друга. Метилолеат-J¹³¹ адсорбировался на кремнекислоте сильнее, чем метилолеат [403]. <\br> Насыщение цис-двойных связей липидов ацетатом двухвалентной ртути с образованием АОММО-производных позволяет отделить насыщенные компоненты при помощи петролейного эфира, бензола или эфира [371, 888]. Триглицериды и другие липиды разделяли по е смесями бензола, эфира, метанола и уксусной кислоты. Производные липидов с е > 3—4 полностью из колонки не элюируются. Исходные липиды регенерируют из АОММО-производных соляной кислотой, причем, как было показано, транс-изомеры при разделении и регенерации не образуются [588].

В настоящее время для разделения по е применяют колонки

Рис. 1. Изменение концентрации более полярного растворителя в бинарной смеси в зависимости от ее объема 1—3 — выпуклый, линейный и вогнутый непрерывные градиенты; 4, 5 — ступенчатое элюирование

с адсорбентами — силикагелем или катионообменными смолами, пропитанными AgNO₃ (стр. 24); растворителями обычно служат смеси петролейного эфира с бензолом, толуолом и хлороформом, а в случае ионообменных смол — смеси метанола с этанолом. Метиловые эфиры и триглицериды с Δе = 1, цис- и транс-изомеры этих липидов разделялись полностью, а чистота препаратов обычно превышала 95% [263, 820, 969, 970, 1002].

Кроме ступенчатого элюирования в колоночной хроматографии липидов широко применяют градиентное элюирование, особенно при разделении смеси из многих компонентов, не сильно различающихся по полярности [225]. Раствор полярного растворителя концентрации С в неполярном растворителе непрерывно поступает в течение времени t со скоростью R в неполярный растворитель, имеющий объем V. Смесь непрерывно перемешивается и с той же скоростью R подается в адсорбционную колонку. Концентрация Е полярного растворителя в растворе, поступающем в колонку, определяется уравнением Е = C — (C/e^(Rt/V)), где е — основание натуральных логарифмов. Изменяя величину V, можно выбрать требуемый для данного разделения градиент — выпуклый, линейный или вогнутый (рис. 1) [376, 1000].

Для разделения смесей липидов на классы применяли выпуклые («convex») градиенты: петролейный эфир → эфир → метанол, гексан → бензол и хлороформ → метанол; разделение было всегда эффективнее, чем при ступенчатом элюировании [998]. С помощью градиентного элюирования смесью гексан → эфир триглицериды высших жирных кислот частично отделили от глицеридов летучих кислот [838].

ΧΡΟΜΑΤΟΓРАФИЯ НА ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГЕ, ПРОПИТАННОЙ АДСОРБЕНТОМ

В 1950 г. был предложен новый способ адсорбционно-хроматографического разделения липидов — хроматография на фильтровальной бумаге, пропитанной кремнекислотой [576]. Для получения слоя адсорбента полосы толстой фильтровальной бумаги погружают в 30—40%-ный водный раствор силиката натрия или калия, удаляют избыток силиката с поверхности, а остальной силикат превращают в кремнекислоту или силикагель обработкой бумаги 4—6 н. НСІ или соответственно 5%-ным раствором NН₄CI [620, 687, 723]. Обычно при получении пропитанной бумаги стремятся достичь возможно большей концентрации кремнекислоты, поскольку снижение содержания адсорбента в бумаге вызывает удлинение пятен липидов на хроматограмме. Пропитанную бумагу промывают, высушивают, разглаживают под прессом и активируют при 110° в течение нескольких часов. При увеличении рН промывающего раствора получают кремнекислоту с возрастающим содержанием силиката — кислую, нейтральную или основную. Для равномерного нанесения смеси липидов на стартовый участок хроматограммы перед разделением используют растворители такой полярности, которые легко элюируют данную смесь с пропитанной бумаги [220, 833].

Оптимальную для данных условий концентрацию липидов (от нескольких микрограммов до миллиграмма) обычно определяют эмпирически. Хроматограмму с нанесенными липидами сразу же помещают в камеру с растворителем, иначе часть липидов может подвергнуться окислению. Для определения состава липидов сыворотку крови и другие жидкости биологического происхождения можно наносить непосредственно на хроматограмму без предварительной экстракции [688]. При разделении липидов применяют восходящую хроматографию в атмосфере инертного газа. Для хроматографии и насыщения камеры пользуются свежеприготовленными растворителями. Процесс разделения зависит от влажности окружающего воздуха и его температуры. Гидролиз липидов при разделении не наблюдается. Если эффективность разделения липидов в данном растворителе мала, то увеличение длительности разделения обычно не ведет к повышению эффективности; в таких случаях следует изменить состав хроматографического растворителя [932].

Условия проведения адсорбционной хроматографии на фильтровальной бумаге, пропитанной кремнекислотой, приведены в табл. 2. Природную смесь липидов разделяют на классы на кислой и нейтральной бумаге, используя смеси неполярных растворителей — петролейного эфира, бензола, эфира. Отдельные классы располагаются, начиная от старта, в обычной последовательности (стр. 24). Разделение липидов улучшается при отсутствии в бумаге ионов Na⁺ и СІ⁻. С увеличением полярности раствори- <\br> Таблица 2 Условия адсорбционной хроматографии липидов на фильтровальной бумаге Ватман № 1, пропитанной кремнекислотой

теля подвижность липидов на бумаге возрастает [219]. При помощи неполярных растворителей можно разделить по числу е эфиры холестерина и жирных кислот — насыщенных, олеиновой, линолевой и линоленовой + арахидоновой. Чистота полученных фракций была подтверждена газо-жидкостной хроматографией. Для разделения смеси эфиров холестерина в нижний левый угол квадрата бумаги, пропитанной кремнекислотой, помещали исследуемую пробу и разделяли смесь петролейным эфиром в одном направлении — по е. Затем среднюю и правую части квадрата пропитывали жидким парафином и проводили распределительную хроматографию по числу m в направлении, перпендикулярном первому, применяя смесь СН₃COOH, CHCl₃ и жидкого парафина (16 : 3 : 1) в качестве растворителя [286, 723]. Сочетание адсорбционного и распределительного метода в виде двумерной хроматографии использовали также для разделения липидов листьев, причем в одном направлении бумагу пропитывали ZnCO₃, а в другом направлении — жидким парафином. Нисходящую хроматографию на бумаге Ватман № 40, пропитанной кремнекислотой, применяли для эффективной очистки липидов от примесей нелипидной природы [100, 113].

Условия обнаружения насыщенных и ненасыщенных нейтральных липидов и жирных кислот приведены в табл. 2. Лучшим неспецифическим проявителем для всех липидов является Родамин 6 G в 2 н. растворе NaOН; после опрыскивания желтые пятна <\br> липидов на пурпурном фоне наблюдают и фотографируют в УФ-свете [427]. Абсолютная и относительная величины Rƒ при адсорбционной хроматографии сильно зависят от концентрации отдельных компонентов, свойств бумаги и других условий разделения. Индивидуальные классы или фракции липидов элюируют с бумаги метанольным раствором HCI или другими растворителями и подвергают гидролизу или метанолизу [583, 932].

ΧΡΟΜΑΤΟΓРАФИЯ НА БУМАГЕ ИЗ СТЕКЛЯННОГО ВОЛОКНА

В 1956 г. в лаборатории Дикерта было обнаружено, что фильтровальная бумага как носитель кремнекислоты может быть с успехом заменена бумагой из стеклянного волокна. С тех пор этот метод получил довольно широкое распространение в хроматографии липидов и других природных соединений [245, 722].

Марки наиболее часто используемых сортов стеклянной бумаги указаны в табл. 3. Перед пропиткой ее выдерживают при 600° в течение 30—60 мин. для очистки от органических веществ. Стеклянную бумагу пропитывают с обеих сторон кремнекислотой так же, как фильтровальную бумагу, а затем отмывают от органических примесей эфиром; содержание кремнекислоты в такой бумаге достигает 3,6 мг/см² [51, 221, 745]. При снижении концентрации кремнекислоты с 38 до 1—2% адсорбент равномернее распределяется среди волокон, а чувствительность проявления пятен возрастает; наблюдается также увеличение «фактора разделения» липидов — соотношения величин Rƒ двух соседних пятен. После пропитки разбавленным раствором силиката бумагу надо высушить при 100°, а затем обработать соляной кислотой; такая обработка способствует увеличению ее механической прочности [338].

Одно из преимуществ стеклянной бумаги состоит в возможности пропитки ее не только кремнекислотой, но также щелочным силикатом и силикагелем [338, 921]. Для получения пропитанной силикагелем бумаги, которая отличается высокой эффективностью разделения, полосы погружают в 20%-ный пересыщенный раствор ортокремневой кислоты, которая при высыхании бумаги в течение нескольких минут превращается в силикагель. Скорость образования геля пропорциональна содержанию NH₄CІ в растворе; соль удаляют с бумаги сублимацией или промыванием [339].

Высокая чувствительность хроматографии на бумаге из стеклянных волокон позволяет обнаруживать отдельные компоненты смеси в количестве 0,2 мкг; обычно вес пробы составляет 5—20 мкг, причем бумага, пропитанная силикагелем, обладает пониженной емкостью [338]. Для насыщения камеры парами растворителя ее внутренние стенки обкладывают фильтровальной бумагой и бумагу перед хроматографией выдерживают в такой камере в течение 10—60 мин. [246]. Для разделения применяют восходящую хроматографию; снижение скорости тока растворителя на бумаге увеличивает эффективность разделения. Окисления и гидролиза <\br> Таблица 3 Адсорбционная хроматография липидов на бумаге из стеклянного волокна, пропитанной кремнекислотой, силикатом или силикагелем

2*

липидов в процессе хроматографии не происходит. Стеклянную бумагу можно использовать и в качестве носителя для обращенно-фазовой хроматографии [745].

Условия адсорбционной хроматографии нейтральных липидов на бумаге из стеклянного волокна приведены в табл. 3. При разделении смеси липидов на классы стеклянная бумага применяется аналогично пропитанной фильтровальной (стр. 32), и последовательность классов остается прежней [170]. На бумаге, содержащей 1—2% кремнекислоты, глицериды располагались от старта следующим образом: моноглицериды, 1-ацетодиглицериды, диглицериды высших жирных кислот, 1,2-диацетотриглицериды, 2-ацетотриглицериды, триглицериды высших жирных кислот; внутри этих классов разделения не было достигнуто. На той же бумаге разделили метиловые эфиры гекса-, тетра- и дибромстеариновых кислот, а также насыщенных жирных кислот; свободные ди- и тетрабромстеариновые кислоты не отделялись друг от друга. Небромированные метиловые эфиры не разделялись между собой [766]. Метиловые эфиры ненасыщенных жирных кислот хорошо отделялись при хроматографии на бумаге, пропитанной силикагелем. По величине Rƒ эфиры ненасыщенных кислот совпадали с насыщенными эфирами, содержащими в цепи на шесть С-атомов меньше. Разделения насыщенных эфиров между собой не наблюдалось. Если растворителем при хроматографии на полоске с силикагелем служил изооктан, то холестерин обнаруживал большую подвижность, чем триглицериды; такая последовательность липидов еще не наблюдалась ни в одной адсорбционно-хроматографической системе. При добавлении к изооктану возрастающих количеств изопропилацетата, дихлорэтана, бензола или эфира холестерин занимает свое обычное место позади триглицеридов. Данную закономерность можно использовать для хроматографической идентификации липидов. Липиды, различающиеся только по m, на стеклянной бумаге не разделяются [339].

Желая обнаружить пятна липидов, бумагу опрыскивают концентрированной или 50%-ной серной кислотой и нагревают. При 200—300° и выше липиды обугливаются и выступают в виде темных пятен; метиловые эфиры жирных кислот, обладающие наибольшей устойчивостью к окислению, обугливаются в последнюю очередь. Для получения количественных данных оптическую плотность пятен измеряют денситометром [745]. Вместо серной кислоты можно использовать раствор К₂Cr₂O₇ в серной кислоте или хлорную кислоту [722]. Цветные реакции, применяемые на фильтровальной бумаге, вполне пригодны и для стеклянной бумаги, хотя по чувствительности они значительно уступают реакции с серной кислотой [221]. Обугливание липидов нагреванием с серной кислотой в сочетании с денситометрией использовали для количественного определения липидов в последовательных фракциях элюата хроматографической колонки и построения выходных кривых элюирования [980].

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Быстрое развитие биохимии липидов в течение последних 10 лет вызвало появление микрохроматографических методов разделения: газо-жидкостной хроматографии и обращенно-фазовой распределительной хроматографии. Для фракционирования сложной смеси природных липидов на отдельные классы возникла потребность в надежном, быстром и простом по выполнению микроадсорбционном методе. Отчасти эта потребность была удовлетворена использованием хроматографии на фильтровальной или стеклянной бумаге, пропитанной адсорбентом. Однако данные виды хроматографии не вошли в повседневную практику из-за необходимости длительной процедуры пропитывания для каждого определения, трудности препаративного выделения липидов и других причин. Начиная с 1959 г. в биохимии липидов широко применяется открытая Шталем хроматография в тонком слое адсорбента [681, 891], которая стала сейчас главным адсорбционно-хроматографическим методом. Общие сведения о принципах и аппаратуре тонкослойной хроматографии содержатся в имеющихся обзорах [6, 164a, 672a, 678a].

Слой адсорбента распределяют на обычной или матовой стеклянной пластинке. Поверхность стекла перед нанесением должна быть совершенно чистой. Иногда слои наносят на предметные стекла 7,6 × 2,5 см или на внутреннюю поверхность пробирок 150 × 13,5 см [65, 88, 380, 393, 626, 777, 778]. В качестве адсорбента для тонкослойной хроматографии липидов в большинстве случаев используют силикагель G, который содержит 85% силикагеля (200 меш) и 15% гипса — закрепителя слоя. Перед нанесением адсорбент перемешивают с двумя весовыми частями воды [682]. Реже применяют смеси силикагеля с 1—8% CaSO₄ или с 5% крахмала, а также суспензии силикагеля G в хлороформе [121, 236, 239, 392, 679, 967]. Из других адсорбентов для разделения служат Al₂O₃ без фиксатора, адсорбосил и гидроксилапатит, содержащий 8% CaSO₄ [381, 948].

Густую смесь силикагеля, воды и фиксатора нагревают до 70° или выдерживают в вакууме для удаления пузырьков воздуха и наносят аппликатором на пластинки при толщине слоя 250—500 мк. Пластинки подсушивают, активируют при 95—120° в течение 0,5—2 час. и хранят над Р₂О₅ [561, 920]. В случае неводных суспензий силикагеля пластинку или пробирку погружают для нанесения в эту суспензию на несколько секунд [626]. Для лучшего разделения удаляют адсорбент с краев пластинки, проделывают в нем бороздки, параллельные направлению тока растворителя, и промывают пластинку восходящим током СНСl₃ [682]. Для препаративного выделения нейтральных липидов наносят смесь силикагеля и 2—5% СаSО₄ с водой (1 : 1,57—1 : 1,70), слой подсушивают нагреванием, активируют 24 часа при 110° и промывают СНСl₃; при этих условиях слои до 3 мм толщиной не обра- <\br> зуют трещин при высыхании. Емкость таких пластинок достигает 25 мг для каждого компонента смеси на 1 мм толщины слоя [393].

При необходимости фракционирования смеси липидов, различающихся по е, применяют пластинки с тонким слоем силикагеля, содержащим ионы Ag⁺. Силикагель G перед нанесением перемешивают с 12—50%-ным раствором AgNO₃ и наносят на пластинки; иногда пластинки опрыскивают раствором AgNO₃ в воде или метаноле [9, 87, 637, 734, 735, 973]. Для разделения липидов, различающихся числом или положением ОН-групп, пластинки опрыскивают насыщенным раствором Н₃ВО₃, буры или арсенита натрия в метаноле [737]. В отдельных случаях силикагель до нанесения на пластинки пропитывали веществами, флуоресцирующими в УФ-свете, — цинк-кадмий-сульфидом или 2,7-дихлорфлуоресцеином; на таких хроматограммах положение липидов устанавливали без опрыскивания окрашивающим реактивом [149]. При обращенно-фазовой хроматографии пластинки обрабатывали растворами гидрофобных соединений (стр. 52) [554].

Липиды растворяют в наименее полярном из возможных растворителей и 0,5—200 мкг смеси наносят в 2—3 см от нижнего обреза пластинки в виде точек или полос; в случае препаративного разделения 0,5—10 мг смеси липидов помещают полосой в углублении слоя адсорбента, не достигающем поверхности стекла, избегая нанесения вблизи боковых краев пластинки [736]. При круговой хроматографии липиды наносят в центр пластинки. Разделение в тонком слое проводят в тех же условиях, что и разделение на стеклянной бумаге (стр. 34). При нисходящей или круговой хроматографии растворитель подают на пластинку «язычком» из фильтровальной бумаги. Пластинку выдерживают в камере в течение различного времени (до нескольких часов); при этом растворитель продвигается на 10—15 см [1016]. Липиды можно разделять многократно одним и тем же или другим растворителем в одном и том же направлении, благодаря чему зоны компонентов сужаются, или же фракционировать по двумерному способу, причем хроматография в другом направлении может быть и распределительной. Эффективность разделения увеличивается при непрерывном испарении растворителя с верхнего края пластинки [1015].

Для разделения нейтральных липидов чаще всего служат смеси петролейного эфира с более полярными растворителями. Раствор, содержащий 5—50% эфира в петролейном эфире, применяют при разделении метиловых эфиров насыщенных, ненасыщенных, окси-, кето- и бромзамещенных жирных кислот [683, 871], кислородсодержащих липидов [917], моно-, ди- и триглицеридов [308, 836] и озонидов триглицеридов [797, 799, 803], причем отдельные классы нейтральных липидов располагаются на пластинке в обычном порядке (стр. 24) [684]. При наличии в препарате свободных жирных кислот для разделения на классы используют тот же раствор, содержащий 1—3% уксусной кислоты или мета- <\br> нола [678, 834, 991], а также петролейный эфир : бензол 4 : 7 или 9 : 1 [555]. Смесь жирных кислот и моно-, ди- и триглицеридов разделяют в системе гептан : диизопропиловый эфир : уксусная кислота = 6 : 4 : 0,2 [381, 536]. В других исследованиях при разделении нейтральных липидов использовали растворители, не содержащие алифатических углеводородов. Так, для анализа восков применяли смеси бензола с CHCl₃ 1 : 1 или эфиром 4 : 1 [735]. Система CHCl₃ : ацетон : аммиак (45 : 5 : 0,1) была растворителем при разделении липидов сыворотки крови [239]. При помощи двумерной хроматографии, где растворителями были эфир и 1,5%-ный раствор уксусной кислоты в изопропиловом спирте, препарат липидов разделили на 11 различных классов [533]. Для отделения друг от друга 1(3)- и 2-моноглицеридов применяли смеси равных объемов диоксана с изоамилацетатом или бутиловым эфиром [381]. При разделении липидов в виде комплексов с Ag⁺ согласно их е использовали разнообразные системы растворителей. Например, для метиловых эфиров применяли гексан : эфир (41 : 9, 9 : 1, 3 : 2, 2 : 3), бензол : эфир (4 : 1), бензол : петролейный эфир (7 : 3, 8 : 2, 9 : 1) [9, 734]; для триглицеридов — хлороформ : уксусная кислота (149 : 1), CCl₄ : CHCl₃ : CH₃COOH : C₂H₅OH = 60 : 40 : 0,5 : 1,5 или бензол [87, 88]; для озонидов триглицеридов — петролейный эфир : эфир = 4 : 1 [797]. Продукты гидроксилирования эфиров жирных кислот фракционировали смесью CHCl₃ : CH₃OH : CH₃COОН (45 : 5 : 1) или CHCl₃ : CH₃OH (95 : 5—99 : 1) [737], а АОММО-производные — 1%-ным раствором уксусной кислоты в изопропаноле [683].

После аналитического разделения в тонком слое липиды можно обнаружить и количественно определить воздействием агрессивных реактивов (серной кислоты, хлорной кислоты и др.) при высокой температуре. Благодаря такой возможности тонкослойная хроматография по чувствительности, а следовательно, и по эффективности разделения превосходит другие адсорбционные и хроматографические методы и приближается к газо-жидкостной хроматографии. Обычно после улетучивания растворителя пластинки опрыскивают концентрированной серной кислотой, 50%-ной серной кислотой, насыщенным раствором К₂Сr₂O₇ в 80%-ной серной кислоте, 25%-ной хлорной кислотой или 5%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле с последующим нагреванием до 100—200° в течение 10—30 мин. до появления темных и голубых пятен. Таким способом можно обнаружить в пятне 0,5 мкг и менее липидов [537, 796, 798]. Интенсивность окраски темных пятен липидов определяли денситометрически без светофильтра. Достоверные количественные данные были получены при использовании раствора бихромата калия в 80%-ной серной кислоте с нагреванием до 180° в течение 25 мин.; при обугливании с серной кислотой ненасыщенные липиды дают более темную окраску по сравнению с насыщенными. Абсолютная ошибка определения составляла 1—3% [798]. Серную кислоту не сле- <\br> дует применять для обработки пластинок с Ag⁺; пятна глицеридов на таких пластинках обнаруживают и определяют количественно с 50%-ной фосфорной кислотой [88, 329].

Для универсального обнаружения липидов после препаративного разделения имеется ряд цветных реакций. Опрыскивание 0,2%-ным спиртовым раствором 2,7-дихлорфлуоресцеина и последующее облучение пластинок УФ-светом служат для определения отдельных классов неполярных липидов, в том числе метиловых эфиров жирных кислот и глицеридов; вместо 2,7-дихлор- иногда применяют дибромфлуоресцеин [106, 963]. Как и в хроматографии на бумаге, в тонкослойной хроматографии для проведения неспецифических реакций на липиды часто используют Родамин С или 6G и пары иода. После реакции с иодом липиды можно идентифицировать по скорости обесцвечивания; чувствительность проявления при 60° составляет 1 мкг [878, 881, 974, 976]. Если после разделения обработать силикагель на пластинке диметилдихлорсиланом, то при погружении в 20%-ный этанол триглицериды выступают в виде прозрачных пятен на матовом фоне [536]. АОММО-Производные ненасыщенных липидов обнаруживаются 0,1%-ным спиртовым раствором S-дифенилкарбазона. Все эти реакции используют и после аналитического разделения [683].

Препаративное получение липидов для количественного анализа и исследования их состава другими методами, а также для измерения радиоактивности осуществляется путем соскабливания соответствующего участка слоя с пластинки и элюирования пробы разными растворителями. Нейтральные липиды элюируют метанолом, хлористым метиленом, хлороформом или раствором сцинтиллятора. Эффективность элюирования достигает 90—97% [920]. Фотометрическое количественное определение липидов в элюате можно выполнять без удаления силикагеля. Для определения радиоактивности липидов проводят денситометрию радиоавтографов тонкослойных пластинок. Тонкослойные хроматограммы фотографируют сразу после окрашивания [736].

Последовательность расположения нейтральных липидов на пластинке с силикагелем в системах растворителей, содержащих уксусную кислоту, была указана выше (стр. 24). Если уксусная кислота в подвижной фазе не содержится, то жирные кислоты в ряду полярности занимают место между фосфолипидами и стеринами [218, 330]. Тонкослойной хроматографией можно очистить триглицериды жирных кислот от углеводородов, а также выделить из пчелиного воска некоторые липиды, например жирные кислоты, рицинолеиловый спирт, парафины, стеарилстеарат, стеарилрицинолеат, дистеарилсебацинат, стеарил-9,10-диоксистеарат и холестерин [231, 514]. На пластинке с силикагелем G разделили липиды с Δm = 4. Этот метод часто используют при оценке чистоты метиловых эфиров жирных кислот для газо-жидкостной хроматографии и других целей [779]. <\br> Благодаря разному числу полярных групп были разделены смеси моно-, ди- и триглицеридов — свободных и ацетилированных, смесь моно-, ди- и тририцинолеотриглицеридов, окси- и диоксистеариновые кислоты, окси- и эпоксижирные кислоты, а также метиловые эфиры этих жирных кислот [678, 684]. Из масла Sapium sebiferum выделили глицериды 2,4-декадиеновой кислоты [675] (стр. 192). Сродство липидов к адсорбенту определяется не только числом, но и положением полярных групп в молекуле. Так, достигнуто разделение 9,10-диокси-, 6-, 14- и 2-оксистеаратов, 9-окси-9,12-октадекадиеноата и 13-окси-9,11-октадекадиеноата, а также 12,13- и 9,10-эпоксиоктадеценоата [741, 742, 744]. Полученные глицеролизом 1(3)- и 2-моно- и 1,3- и 1,2(2,3)-диглицериды разделяли на силикагеле; при движении моноглицеридов в слое гидроксилапатита 2-изомер из-за ацильной миграции превращался в 1(3)-моноглицерид. Чтобы избежать этого, смесь 1(3)- и 2-изомеров до разделения окисляли периодатом; при этом 1(3)-моноглицерид превращался в эфир гликолевого альдегида, который хорошо отделялся от 2-изомера [795].

Большой интерес представляют те исследования, в которых для разделения липидов с разным е и различным положением двойных связей в цепи создавали новый градиент полярности путем присоединения к ненасыщенным связям тех или иных заместителей. После бромирования эфиров олеиновой, линолевой и линоленовой кислот их отделяли от насыщенных эфиров и разделяли между собой [871]. Озониды триглицеридов кукурузного, оливкового и соевого масел разделяли на силикагеле по е. Отдельные фракции элюировали и восстанавливали водородом над PdO₂. При этом цепи ацилов ненасыщенных кислот у девятого атома углерода разрывались, и в этих положениях возникали альдегидные группы. Насыщенные ацилы в данных условиях не изменялись. Продукты восстановительного озонолиза разделяли для определения [S₃], [S₂U], [SU₂] и [U₃] в типовом составе этих масел [797]. АОММО-Производные ненасыщенных метиловых эфиров разделяли по е, регенерировали исходные эфиры соляной кислотой и жирнокислотный состав каждой е-фракции определяли методом газо-жидкостной хроматографии [444].

Весьма эффективным оказалось фракционирование липидов на пластинке с силикагелем, пропитанным AgNO₃. Метиловые эфиры жирных кислот и триглицериды разделяются на таких пластинках в основном по олефиновому составу (Δе = 1). Этот метод может быть препаративным, а также использоваться для количественного определения триглицеридов [973]. Однако деление не всегда происходит строго по величине е, поскольку комплексообразующая способность ацилов с разным е не прямо пропорциональна величине е. Если у S-ацилов эту способность принять равной нулю, то у олеата она равна 1, у линолеата 2 + а, а у линолената 4 + 4а, где а < 1. Можно видеть, что линолеат по этому признаку превосходит два остатка олеата, а линоленат — <\br> два остатка линолеата; триолеин (е = 3) совпадает по положению на хроматограмме с дипальмитолинолеином (е = 2), а стеародилиноленин (е = 6) превосходит по подвижности дилинолеолиноленин с семью двойными связями [318].

В ряду метиловых эфиров с е = 1 и 2 и одинаковым значением m, но с разным положением двойной связи в цепи, величина Rƒ возрастала при увеличении расстояния между ненасыщенной связью и сложноэфирной группой [9]. Разделялись 1,3- и 1,2-позиционные изомеры диолеина, а также 1(3)- и 2-олео- и -линолеодистеарины [87]. Для метиловых эфиров моно-, ди- и триеновых кислот, а также триглицеридов различие в геометрической конфигурации только одной двойной связи обеспечивало разделение, причем транс-изомеры двигались на пластинке, содержащей ионы Ag⁺, дальше, чем соответствующие цис-изомеры [734].

Диастереоизомеры насыщенных липидов также могут разделяться на силикагеле, не содержащем комплексообразующих агентов. Цис-изомеры озонидов моноеновых эфиров двигались быстрее транс-изомеров, а эритро-формы бромированных метилстеаратов — впереди соответствующих трео-форм; в то же время в ряду эфиров жирных оксикислот трео-изомеры отличались большей подвижностью, чем эритро-формы [871]. Пропитывание адсорбента борной кислотой, бурой, арсенитом натрия или другими комплексообразующими агентами не изменяет последовательности элюирования стереоизомерных диоксистеаратов, но значительно увеличивает его эффективность; появляется также возможность фракционирования метиловых эфиров эритро-, трео-изомеров три- и тетраоксистеариновой кислоты [734, 737, 803, 871].

ЗНАЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ РАЗНОВИДНОСТЕЙ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Обилие и некоторая разноречивость приведенных выше данных требуют оценить и подытожить достоинства и недостатки каждой разновидности адсорбционной хроматографии липидов.

Использование вытеснительной хроматографии с носителем ограничивается сложностью требуемой аппаратуры, а также тем, что качественный состав анализируемой смеси надо знать до разделения. Носители обычно подбирают так, чтобы после проведения опыта их можно было легко отделить от исследуемых соединений. В настоящее время активированный уголь уступил место более эффективным адсорбентам.

Адсорбционная хроматография на колонках используется теперь главным образом как препаративный метод, поскольку в аналитической области она не может конкурировать по быстроте и эффективности разделения с другими хроматографическими методами. На адсорбционных колонках сравнительно легко получить до грамма отдельных классов липидов, причем даже для наиболее лабильных соединений выход обычно близок к 100%. <\br> Разделение и количественное определение фракций легко поддаются автоматизации; в этом отношении адсорбционный метод уступает только газо-жидкостной хроматографии. По емкости адсорбционные колонки далеко превосходят распределительные, поскольку удельная поверхность у адсорбента всегда значительно больше, чем у жидкой фазы в распределительно-хроматографической системе. Слабыми сторонами адсорбционного разделения на колонках являются его недостаточная эффективность и большая длительность; кроме того, метод еще маловоспроизводим в разных лабораториях. Препаративная работа на колонках возможна лишь при строгом контроле за всеми параметрами опыта [376].

Хроматография липидов на пропитанной адсорбентом фильтровальной бумаге имеет ряд преимуществ перед другими способами адсорбционной хроматографии. По сравнению с бумагой из стеклянных волокон целлюлозная бумага дешевле и удобнее в обращении [687]. Поскольку тонкослойная хроматография отличается более высокой эффективностью, отдельный класс липидов может давать более чем одно пятно. Это обстоятельство затрудняет разделение смесей неизвестного состава [833]. Адсорбционная хроматография на бумаге, в отличие от тонкослойной хроматографии, обычно не дает пятен с «хвостами», обеспечивает большую воспроизводимость величины Rƒ и не вносит ошибки, связанной с препаративным выделением вещества с пластинки вместе со слоем адсорбента [427]. В настоящее время этот метод довольно широко применяется для разделения липидов.

Преимущества бумаги из стеклянных волокон как носителя адсорбента в хроматографии липидов состоят в большой чувствительности проявления, устойчивости к высокой температуре и агрессивным веществам, в быстроте анализа, а также в возможности проведения количественных измерений. Высокая цена стеклянной бумаги и недостаточная механическая прочность несколько ограничивают ее применение.

Тонкослойная хроматография, как уже упоминалось, обладает многими преимуществами по сравнению с другими видами адсорбционной хроматографии. Изменяя в широких пределах свойства применяемого адсорбента, исследователь получает возможность анализировать смеси липидов различного состава и происхождения. Вследствие большой скорости движения растворителя по пластинке тонкослойная хроматография является самым быстрым из всех видов адсорбционной хроматографии; в отдельных случаях разделение смеси и универсальное разделение липидов занимают не более 7 мин. [777], что исключает разрушение липидов в процессе анализа. Как отмечалось выше, высокая чувствительность цветных реакций (< 0,1 мкг) позволяет работать в ультрамикроаналитическом масштабе, благодаря чему эффективность и четкость разделения малых количеств многокомпонентных смесей приближаются к соответствующим показателям га- <\br> зо-жидкостной хроматографии. Денситометрия отдельных зон после разделения дает возможность быстро получать количественные результаты с удовлетворительной точностью. Фракционирование на пластинках широко используется для выделения липидов в препаративном масштабе (0,5 г и более) и не уступает в этом отношении разделению на колонке. Параллельный адсорбционно-хроматографический анализ одной и той же смеси липидов на препаративной пластинке и на колонке дал аналогичные качественные и количественные результаты [106, 121].

Особенно эффективным является сочетание тонкослойной хроматографии с другими видами анализа (см. табл. 1). Так, при хроматографии на колонке разделение на пластинках успешно применяли для контроля состава липидов во фракциях элюата [833]. Наоборот, закономерности тонкослойного разделения можно широко использовать при осуществлении анализа на колонке. Распределительную хроматографию нередко проводят на той же самой пластинке до или после адсорбционного разделения, что позволяет фракционировать отдельные классы липидов по длине цепи входящих в их состав алифатических остатков [514, 533, 537, 554, 555, 679]. Тонкослойную хроматографию часто используют для очистки липидов отдельных классов [779, 973].

Наряду с очевидными достоинствами тонкослойной хроматографии, как и всякому другому методу, свойственны определенные ограничения. Скорость миграции липидов и порядок их расположения на пластинке в большой степени зависят от количества и сорта адсорбента, способа нанесения адсорбента, активации и охлаждения пластинки, насыщения камеры парами растворителя и количества пластинок в камере, длительности выдерживания пластинок в парах растворителя до разделения и температуры разделения. Поэтому для достоверной идентификации рядом с исследуемой пробой следует наносить растворы «свидетелей». Препаративное разделение липидов на пластинке обычно менее эффективно, чем аналитическое.

Глава 2. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ΧΡΟΜΑΤΟΓΡΑФИЯ С ПОЛЯРНОЙ НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗОЙ

Придерживаясь исторической последовательности, мы рассмотрим вначале системы, где неподвижная фаза более полярна, чем протекающий растворитель, хотя в настоящее время эти виды хроматографии применяются в области липидов значительно реже обращенно-фазовых систем.

В 1948 г. Рамсай и Паттерсон предложили использовать силикагель в качестве носителя для распределительной хроматографии <\br> жирных кислот. Этот метод был стандартизирован с С¹⁴-кислотами и неоднократно применялся для разделения липидов. Силикагель с этой целью суспендируют в нижней фазе системы и под давлением заполняют колонку. Пробу (3,3—3,8 мг липидов на 1 г носителя) растворяют в верхней фазе и вносят в колонку. Растворитель (верхнюю фазу) пропускают со скоростью 0,6—1,2 мл/мин [186, 253, 274, 570, 649, 650, 754, 809, 1013]. Кислоты разделяли в системах ¹: фурфуриловый спирт : 2-аминопиридин = 1 : 1/гексан, 0,25 н. раствор NН₄ОН в СН₃ОН/изооктан, 0,2 н. раствор NН₄ОН в смеси метилового эфира этиленгликоля и воды 9 : 1/гексан, 0,3 н. раствор NaOH в СН₃ОН/циклогексан. Таким образом, жирные кислоты двигались по колонке в виде солей [274]. Для разделения оксикислот использовали системы: 0,1 н. раствор NН₄ОН в 95% СН₃ОН/петролейный эфир или СН₃ОН : гексан : ацетон = 2 : 10 : 1, а для дикарбоновых кислот — продуктов окислительного расщепления липидов по двойным связям — системы 0,2 н. раствор NН₄ОН в смеси метилового эфира этиленгликоля и воды 9 : 1/смесь гексана и дибутилового эфира 1 : 1, 1 М раствор цитрата натрия, рН 5,4/CHСl₃-бутанол или СН₃ОН : вода : гексан : ацетон = 7,7 : 1,9 : 77 : 34 [173, 188, 241]. Продукты окисления триглицеридов смесью KMnO₄-КЈО₄ разделяли в системе 90%-ный этанол : петролейный эфир. Сложные эфиры кислот фракционировали в системах: нитрометан : петролейный эфир или 2-феноксиэтанол : гептан [254, 1008]. Время анализа на колонках с силикагелем достигало 20 час. Для количественного определения отдельные фракции элюата титровали 0,05 н. раствором NaOН с фенолфталеином или феноловым красным. В элюате содержалось 95—105% исходных липидов. Силикагель можно пропитать индикатором до разделения; в этом случае кислоты мигрируют в виде окрашенных полос. Производные жирных кислот образуют окрашенные зоны на колонке и при отсутствии индикаторов [1013].

Липиды выходили из колонки в порядке возрастания полярности. «Четные» насыщенные одно- и двухосновные кислоты с m = 10—22 хорошо разделялись между собой; для разделения дикарбоновых кислот с m = 6—10 было достаточно различия на СН₂-группу. Рицинолевая и диоксистеариновая кислоты отделялись друг от друга и от остальных кислот [173, 188]. Продукты окисления глицеридов делились на фракции SSS + SSAz и SAzAz + AzAzAz, где S и Az — ацилы насыщенных кислот и азелаиновой кислоты (стр. 170) [1008]. В ряду n-фенилазофенациловых эфиров насыщенных кислот с m = 2—18 и 2,4-динитрофенилгидразонов (2,4-ДНФГ) этих эфиров полностью разделялись гомологи, различающиеся на СН₂-группу. На колонке, приготовленной по методу Рамсая, было достигнуто фракционирование гомологического ряда 2,4-ДНФГ алифатических альдегидов с m = 2—18

¹ Неподвижная фаза/подвижная фаза. <\br> [254]. Согласно основному уравнению Мартина для распределительной хроматографии, логарифм удерживаемого объема Vᵣ этих соединений в колонке находился в линейной зависимости от длины цепи. Эта закономерность была использована для идентификации липидов [252].

ОСОБЕННОСТИ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ЛИПИДОВ

Выше рассматривалась хроматография липидов в обычных распределительных системах, где неподвижной является более полярная фаза системы. Между тем для эффективного распределительно-хроматографического разделения в качестве неподвижной фазы желательно использовать такое вещество, в котором все анализируемые компоненты имеют более высокую растворимость; в ходе хроматографического процесса эти соединения медленно элюируются большим объемом подвижной фазы, где они растворимы в меньшей степени. Липиды с m > 10 в воде малорастворимы, но отличаются высокой растворимостью в неполярных веществах. Последняя определяется взаимодействием между алифатическими цепями липидов и жидкой фазы в результате возникновения сил Ван-дер-Ваальса, значение которых возрастает с увеличением длины цепи и снижается при появлении двойных связей в молекуле. Транс-двойные связи в меньшей степени влияют на силы Ван-дер-Ваальса по сравнению с цис-связями, сильно сокращающими эффективную длину молекулы, что позволяет разделить геометрические изомеры. Появление двойной связи в цепи заметно увеличивает растворимость липидов в полярной фазе, благодаря возникновению дипольных взаимодействий (см. также стр. 77).

Таким образом, для разделения липидов лучше применять системы, в которых неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная. Эти системы, в которых липиды располагаются на хроматограмме в порядке, обратном приведенному выше (стр. 24), называются «обращенно-фазовыми» системами. Данный термин отражает историческое развитие хроматографии, поскольку системы с «нормальным» соотношением полярности отдельных фаз были разработаны раньше, чем обращенно-фазовая хроматография, впервые использованная Болдингом в 1948 г. для разделения метиловых эфиров жирных кислот [111], а затем развитая в работах Ховарда и Мартина [402], Кауфмана [501], Иноуэ [415], Шленка [852], Ганстоуна [326], Бьюкенена [156] и других исследователей.

Большую роль в разработке современной обращенно-фазовой хроматографии сыграл созданный ранее нехроматографический метод противоточного распределения, основанный на непрерывном автоматическом фракционировании смеси липидов в подвижной двухфазной системе растворителей. После уравновеши- <\br> вания концентраций разделяемых веществ в верхней и нижней фазах первой пробирки автомата верхняя фаза передается во вторую пробирку, содержащую только нижнюю фазу; там снова достигается уравновешивание концентраций, и этот процесс повторяется еще многократно. Вследствие разной величины коэффициента распределения α отдельных компонентов, в противоточной системе они разделяются на фракции различной полярности. Содержание вещества во фракциях описывается отдельными членами разложения бинома Ньютона {[1/(α + 1)] + [α/(α + 1)]}ⁿ, а концентрация в r-й пробирке после n переносов Tₙ,ᵣ = = {n!/[r!(n—r)!]} [1/(α + 1)]ⁿ × αʳ [689].

Разделение в обращенно-фазовых распределительных системах, как и в противоточных, происходит согласно величине α, но отличается меньшей величиной требуемой пробы и большей эффективностью. Метод распределительной хроматографии, который может применяться в виде хроматографии на бумаге, на колонке и в тонком слое, незаменим для фракционирования полиненасыщенных триглицеридов с е > 6, поскольку использование адсорбционной тонкослойной хроматографии комплексов с ионами Ag⁺ не обеспечивает достаточной четкости разделения этих глицеридов. Величина α в обращенно-фазовой системе определяется полярностью веществ, зависящей в пределах данного класса от числа «эффективных метиленовых групп» алифатического радикала, соединенных между собой простыми σ-связями. Другими словами, появление двойной связи в ацильном остатке (на достаточном удалении от концов цепи) и укорочение алифатического радикала на две СН₂-группы обычно в одинаковой степени увеличивают полярность липида, которую можно выразить константой полярности К = 100^(m—2e) или предложенным позднее «числом распределения» РN = m — 2е. Величины К и РN можно вычислить для каждого вида триглицерида. Триглицериды одинаковой полярности равны по значению α и в совокупности образуют «группу полярности», дающую одну зону смешанного состава при обращенно-фазовом разделении. Глицериды группы полярности с наименьшим значением PN элюируются из обращенно-фазовой системы в первую очередь, а с наибольшим — в последнюю. Поскольку положение двойных связей не влияет на α, можно, исходя из видового состава кислот в отдельных видах триглицеридов, предсказать хроматографическое поведение последних. Вычисленная величина PN = m — 2е для данной группы полярности должна равняться значению РN, найденному из жирнокислотного состава этой группы после ее элюирования: PN = Σ[(PN)₁ × p₁ + (PN)₂ × p₂ + ... + (PN)ₙ × pₙ]/100, где p₁, p₂, ... pₙ — содержание жирных кислот в триглицеридах данной группы полярности в мол. %. Величины (PN)₁, (PN)₂, ... (PN)ₙ для отдельных видов кислот были равны m — 2е. Вычисленные и найденные величины РN триглицеридов масла эфедры почти полностью совпадали [635].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Для экспериментального определения значения α жирных кислот в системе водный ацетон : парафиновое масло 2 мг кислоты растворяли в 0,5 мл неполярной фазы, смешивали с 0,5 г носителя (кизельгура) и прибавляли 5 мл водного ацетона. Систему уравновешивали несколько минут при 35°, центрифугировали и пробы верхней фазы по 2 мл оттитровывали А мл 0,001 н. КОН в СН₃ОН. К остатку прибавляли 5 мл 95% ацетона, который полностью элюирует кислоты из неполярной фазы, и пробы по 2 мл титровали Р мл щелочи. Величину α (соотношение концентраций кислоты в подвижной и неподвижной фазах) вычисляли по формуле α = AV/(6P — А), где V — объем неполярной фазы. Точность определения (Т в %), которую находили по уравнению Т = 100NE (2A+3P)/W, где N — нормальность щелочи, W и Е — соответственно вес и эквивалент кислоты, обычно составляла ± 5%. Откладывая в системе координат величину lg 100 α для различных жирных кислот в зависимости от концентрации ацетона в растворителе, получали семейство параллельных прямых. Для кислот одинаковой полярности эти прямые совпадали между собой. Оптимальные условия разделения обеспечиваются при такой концентрации растворителя, когда α данной кислоты равен 0,16, а значение α следующего высшего гомолога 0,08 [324].

Для математического описания обращенно-фазовой системы разделения пальмитиновой и стеариновой кислот рассматривалась колонка, содержащая р тарелок. Считая, что каждая тарелка действует подобно делительной воронке в процессе противоточного распределения, количество растворенного вещества Тр+1,ₙ определяли по формуле, приведенной на стр. 47. После р переносов фронт растворителя достигает последней р-й тарелки, а затем известное количество растворенного вещества Еₐ₊₁ выходит из колонки с (а + 1)-й фракцией элюата (каждая фракция элюата имеет тот же объем, что и объем подвижной фазы в теоретической тарелке обращенно-фазовой хроматографической системы):

Eₐ₊₁ = [(p+a)! / (p! a!)] × [(α')ᵃ / (α' + 1)ᵖ⁺ᵃ⁺¹] = α'/(α' + 1) × Eₐ, (1)

где: а — номер фракции элюата; Eₐ — количество растворенного вещества в элюате а; α' — коэффициент распределения жирной кислоты в условиях хроматографического разделения.

Фракция растворенного вещества в элюате достигает максимума (Емакс) в элюате ƒ, когда α' = р/а. Отношение а/р эквивалентно общему объема элюата f × v, который необходим для достижения максимума, выраженному в объемах подвижной фазы колонки Vₘ:

f/α' = a/p = f × v/Vₘ (2) <\br> Используя уравнение (2), а также величины положения и высоты каждого пика на экспериментальной выходной кривой, полученной с применением 67%-ного ацетона в качестве растворителя, вычисляли фактический коэффициент распределения α' для пальмитиновой (0,50) и стеариновой кислот (0,22). Разделив величины α' на соотношение между жидкими фазами в колонке (2,5), получали истинные значения коэффициентов распределения α, равные соответственно 0,20 и 0,09, что согласуется с найденными экспериментально величинами 0,16 и 0,08.

Из уравнений (1) и (2) можно получить уравнение (3)

p = 2π (1 + α') (Eмакс × Vₘ / α'v)² = 2π/(1 + c) (Eмакс)², (3)

где: v — объем каждого элюата; с — объем подвижной фазы в обращенно-фазовой колонке, выраженный числом фракций элюата в опыте (с = Vₘ/v). Уравнение (3) позволяет вычислить число тарелок р для каждой кислоты по положению и высоте максимума элюата на выходной кривой. Для пальмитиновой и стеариновой кислот величина р равнялась соответственно 70 и 114. Подставляя вычисленные значения α' и р в уравнение (1), построили теоретическую выходную кривую, которая удовлетворительно совпадала с кривой, полученной по экспериментальным данным.

Процент загрязнения каждого пика веществом соседнего пика (η) определяли по уравнению нормальной кривой ошибки:

η = 100 (0,5 - Aᵥ √(Vₐᵥ / (√B - √A)²)),

где: Aᵥ {x} — площадь нормальной кривой ошибки для аргумента x; А = 1 + 1/αₐ и В = 1 + 1/αᵥ. Таким образом, для достижения заданной чистоты фракции (η ≤ 0,2%) при отделении кислоты с α' = 0,50 в обращенно-фазовой системе с числом теоретических тарелок р = 100 от другой кислоты значение α' последней не должно превышать 0,23. Можно видеть, что использованная система обеспечивает практически полное разделение пальмитиновой (α' = 0,50) и стеариновой (α' = 0,22) кислот [324].

Математическая трактовка системы обращенно-фазовой хроматографии позволяет выбрать состав растворителя и оптимальные условия эффективности колонки для разделения смеси липидов.

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВАЯ КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В 1950 г. Ховард и Мартин предложили использовать гидрофобный, обработанный диметилдихлорсиланом Целит в качестве носителя неподвижной фазы. Целит смешивали с очищенным на окиси алюминия парафиновым маслом (1 : 0,8, 1 : 1 или 1 : 1,4 по весу), суспендировали в подвижной фазе и вносили в колонку. Парафиновое масло можно заменить силиконовым маслом (тем- <\br> пература кипения 195—230°/0,25 мм), ацетилированным касторовым маслом, изооктаном, гептаном или циклогексаном [103, 290, 295, 402, 802, 847, 949]. Порошок каучука после набухания в бензоле, петролейном эфире или ацетоне мог служить одновременно и носителем, и неполярной фазой. К каучуку близок по свойствам порошок полимеризованного с S₂Cl₂ соевого масла («фактис»). По эффективности разделения фактис не уступает Целиту с парафиновым маслом [25, 112, 375, 382, 465]. В отличие от вышеуказанных жидких фаз, которые могут использоваться не более 3—8 раз подряд, полиэтилен после набухания в ацетоне или полиэтилен на Целите могут многократно использоваться для разделения [307, 574, 936]. Применяли также обычную целлюлозу, пропитанную парафиновым маслом, и нейлоновые волокна, на которых 2—6 мкг кислот разделяли смесью ацетона, воды и этанола и отдельные компоненты обнаруживали бромкрезоловым зеленым [336, 673].

Пробу, содержащую 1—10 мг каждого липидного компонента для колонок диаметром 1—2 см или 150—250 мг смеси для колонок большего диаметра, вносят в виде раствора в жидкой фазе — подвижной или неподвижной в зависимости от растворимости данной смеси липидов [708, 876]. Объем вносимого раствора не должен превышать объема одной теоретической тарелки [103]. Скорость пропускания подвижной фазы изменяется в пределах от 4 до 300 мл/час. При меньшей скорости эффективность колонки несколько возрастает [227, 692]. Разделение проводят при постоянной температуре. Ненасыщенные кислоты обычно разделяют при 10° [876], смеси кислот — на колонках с каучуком и полиэтиленом — при 20—25° [112], а колонки с парафиновым маслом термостатируют при 35° [227]. Элюат собирают автоматическим коллектором и содержание липидов во фракциях учитывают гравиметрически или титрованием 0,01 н. КОН в СН₃ОН с бромтимоловым синим [227, 326, 949]. В других случаях для измерения концентрации липидов к элюату добавляют два объема воды и мутность эмульсии пробы и стандарта (S и S₀ соответственно) определяют нефелометром. В пределах от 2 до 20 мкг зависимость lg (S/S₀) от массы липидов была линейной [66]. Содержание глицеридов можно определить и колориметрически с гидроксиламином и ионами Fe³⁺ [103]. Для непрерывной регистрации триглицеридов на выходе колонки применили дифференциальный рефрактометр; площадь пиков хроматограммы не была пропорциональна массе [375]. В элюате обнаруживали 97—103% исходных липидов [465]. Чистота выделенных препаратов достигла 99—100% [852].

В качестве растворителей при разделении липидов обычно применяли водные растворы ацетона, насыщенные неполярной фазой. Для элюирования насыщенных кислот использовали следующие концентрации ацетона (указаны число атомов С и концентрации в %) C₈30, C₈40, C₁₀50, C₁₂53, C₁₄58—60, C₁₆ 65—67, C₁₈ 70—73, C₂₀ 75—78, C₂₂80—83, C₂₄ 85—90 [402]. Растворитель <\br> для разделения триглицеридов кокосового масла состоял из смеси ацетона, гептана и воды [103], а для глицеридов масла льна представлял собой 95%-ный ацетон [375]. Повышение концентрации воды увеличивает Vᵣ и эффективность колонки [103]. Для разделения кислот и их производных применяли также смесь СН₃ОН с ацетоном 3 : 1 [112], 65—100% CH₃OH [949], 40—70% этанола [574], смесь ацетонитрила с СН₃ОН 17 : 3 [802] и смесь CH₃COOH, НСООН и воды = 2 : 2 : 1 [336]. Кислоты и их метиловые эфиры разделяли в системе ацетонитрил : вода = 3 : 1 [295]. Применение водного этанола для фракционирования 2-моно- и 1,2(2,3)-диглицеридов приводило к их превращению в устойчивые 1(3)-моно- и 1,3-ди-изомеры; в водном ацетоне миграцию ацилов не наблюдали [847].

Насыщенные жирные кислоты, отличающиеся друг от друга на СН₂-группу, хорошо разделяются и выходят из колонки в порядке уменьшения константы К [402]. Разветвленная лактобацилловая кислота (11, 12-метиленоктадекановая кислота) по величине Rƒ совпадала со стеариновой кислотой [382]. Ненасыщенные кислоты разделяются между собой, но не отделяются от насыщенных кислот с тем же значением К [326].

Для количественного анализа смеси часть кислот гидрируют 24 час. с 5—20% Pd на угле; продукты гидрирования (насыщенные кислоты) хорошо разделяются на колонке [466, 651, 712, 789]. Другую часть кислот расщепляют по двойным связям 5%-ным раствором КМnО₄, гидроксилируют надмуравьиной кислотой или подвергают озонолизу в метилацетате при —40° в течение 5 мин. [71, 651]. Результаты одновременного определения исходных кислот и продуктов их гидрирования и окисления позволяют достаточно точно установить состав данной смеси. Так, олеиновая и петрозелиновая кислоты не разделяются в обращенно-фазовой системе, а возникшие при их окислении пеларгоновая и лауриновая кислоты в этой системе делятся хорошо [227].

Окси-, эпокси- и кетокислоты благодаря высокой полярности хорошо отделяются от обычных кислот и могут разделяться между собой как в незамещенном виде, так и в виде ацетатов на колонках с ацетилированным касторовым маслом. Оксистеариновая кислота по величине Vᵣ совпадала с лауриновой кислотой [326]. Хлорфенациловые эфиры разделялись подобно незамещенным кислотам [574]. На колонках с парафиновым маслом разделялись моно-, ди- и триглицериды, а также триглицериды, различающиеся между собой на четыре СН₂-группы или на две двойные связи; глицериды, отличающиеся на две СН₂-группы или на двойную связь, разделялись не полностью [103]. На колонке фактиса метиловые эфиры, эфиры холестерина и триглицериды разделялись на фракции с одинаковой К; величины lg Vᵣ находились в линейной зависимости от числа атомов углерода в этих соединениях [375].

ТОНКОСЛОЙНАЯ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Хроматография в тонком слое адсорбента, закрепленном на стеклянных пластинках, получила сейчас весьма широкое распространение как метод адсорбционного разделения липидов (стр. 37). Одновременно пластинки с силикагелем используются в хроматографии липидов в качестве носителя неполярной фазы.

Для разделения с обращенной фазой активированные пластинки обрабатывали 10—15%-ным ундеканом в петролейном эфире, 10%-ным додеканом в гексане [9, 524, 533, 537], 5%-ным тетрадеканом [513, 514, 527, 535, 538, 555], 0,5 и 10%-ным парафиновым маслом [536, 554, 556, 721, 723] или 5%-ным силиконовым маслом в эфире [679]. Тяжелые масла не могут быть удалены с пластинки нагреванием. Липиды разделяют и отдельные зоны обнаруживают методами, принятыми в тонкослойной хроматографии [6].

Распределительная хроматография на пластинках по своим результатам в общем не отличается от других видов обращенно-фазовой хроматографии; однако возможность работы в ультрамикромасштабе позволяет в ряде случаев достичь более высокой скорости и эффективности разделения. Пластинки часто используют для двумерной хроматографии; липиды разделяют в одном направлении на классы без нанесения неполярной фазы, а затем часть пластинки пропитывают углеводородами и липиды каждого класса разделяют на фракции различной полярности [9].

Жирные кислоты C₁₀—₁₈ (0,5—20 мкг) разделяли смесью CH₃COOH : CH₃CN (1 : 1) или 85%-ной СН₃СООН в течение часа. Для разделения кислот с одинаковой константой К в полярную фазу прибавляли 0,5% брома: присоединение брома по двойным связям ненасыщенных кислот значительно повышало их подвижность [524]. Липиды одинаковой полярности можно разделить и после гидрирования: кислоты на пластинке опрыскивают 1—2%-ной суспензией палладия, гидрируют Н₂ в эксикаторе, промывают 5%-ной НСІ и разделяют после пропитывания пластинки ундеканом [554]. Насыщенные кислоты с m = 18—34 разделяли в системе изопропанол : этанол : СН₃СООН : вода (8 : 3 : 4 : 1, 3)/тетрадекан при 42° и определяли количественно с ацетатом Сu (стр. 58) [514]. С 80%-ной СН₃СООН разделили C₁₃—₂₅-2-метил-4-кетокислоты и C₁₂—₂₂-оксикислоты [527]. Растворителями для C₁₂—₃₄-жирных спиртов служили 85%-ная СН₃СООН или 90%-ный ацетон [555].

Метиловые эфиры кислот разделяли в смеси СН₃COOH : CH₃CN : вода (2 : 14 : 5) или ацетон : CH₃CN (7 : 10) [9]. Насыщенные и ненасыщенные эфиры одинаковой полярности разделяли при 4—6° или в присутствии надуксусной кислоты. Метиловые и этиловые эфиры разделяли по числу двойных связей на непропитанной пластинке кремнекислоты четырехкратным пропусканием смеси петролейного эфира с бензолом (4 : 1); затем пластин- <\br> ку пропитывали парафиновым маслом и разделяли полученные фракции по числу атомов С. Метиловые эфиры отделялись от этиловых эфиров тех же кислот [554].

Триглицериды разделяли смесью ацетон : CH₃CN (4 : 1) или уксусной кислотой; за 35—100 мин. масло льна делилось на девять, а масло сои — на шесть фракций. Разделение триглицеридов одинаковой полярности обычно не происходило [721]. Однако подвижность глицеридов с одной и той же величиной К не всегда абсолютно одинакова. Многократное проявление пластинок одним растворителем с подсушиванием после каждого проявления приводит к разделению 1—2 мкг компонентов одинаковой полярности. Так, ЛеЛеЛе отделяется от ЛаЛаЛа, ЛЛЛ — от МММ, ООЛ — от МОО, ООЛ — от ППЛ, ООО — от ПОО, ООО — от ППП, ППО — от ППП и т. д. При трехкратном проявлении удалось разделить смесь ООО, ПОО, ППО и ППП, а также отделить глицериды олеиновой кислоты от соответствующих глицеридов элаидиновой кислоты. Масло льна разделяется при этом уже не на 9, а на 15 фракций, масло сои — на 13, арахиса — на 12 и т. д. [513]. Таким образом, двойная связь триглицеридов компенсируется не точно 2 СН₂-группами, как считали ранее, а приблизительно 2,4 группы; с увеличением различия в числе двойных связей между липидами одинаковой полярности Rƒ более ненасыщенного компонента возрастает. Снижение молекулярного веса неподвижной фазы, неблагоприятное соотношение между компонентами пробы и повышение ее веса отрицательно сказываются на эффективности разделения глицеридов [558]. Раствор 0,5%-ного брома в смеси пропионовой кислоты : CH₃CN = 3 : 2 вполне пригоден для разделения триглицеридов одинаковой полярности; применяют также описанный выше метод гидрирования [538].

ПОЛУЧЕНИЕ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ

Для разделения пригодны такие сорта хроматографической бумаги, которые обладают достаточной прочностью во время промывания в воде. Этим требованиям отвечают бумаги Ватман № 1, 3, 4 [81, 275, 310, 584, 854, 880, 905], Тойо № 2, и Машери Нагель № 214 [372, 978], Шлейхер и Шюлль № 595, 598, 2040, 2043 b и 2043 b Mgl [232, 302, 430, 460, 512, 530, 548]. Применяют также бумагу Б или М Ленинградской фабрики № 2 или № 69 «Гознак»; эти сорта менее удовлетворительны, чем перечисленные выше [2, 4, 13, 14, 28, 29, 32, 35]. Бумагу очищают промыванием 0,5—10%-ной НСІ, 3%-ной HNO₃, 20%-ной НСООН, 95%-ной СН₃СООН, водным ацетоном, этанолом, эфиром или бензолом, отмывают водой, сушат при 90—120° и сохраняют над СаСl₂ [3, 216, 534].

В ранних работах для придания бумаге гидрофобных свойств целлюлозу пытались превратить в ее эфиры. Для получения октадецилоксиметилового эфира бумагу обрабатывали 3 часа при <\br> 90° 0,5%-ным хлоридом октадецилоксиметилпиридиния в толуоле [80]. Гидроксаматы кислот разделяли на бумаге, ацетилированной (СН₃СО)₂О в бензоле при 70° или пальмитилированной тем же способом [725, 726]. Эфиры целлюлозы не получили распространения в хроматографии, поскольку гидрофобную бумагу легче получить пропитыванием обычной бумаги высококипящими липофильными веществами. Для разделения C₁₀—₂₀-жирных кислот бумагу обычно пропитывают ундеканом, насыщенным подвижной фазой, отжимают 10—30 мин. фильтровальной бумагой под грузом и выдерживают 10 мин. на воздухе [373, 416, 542—545, 625, 757, 762, 975]. Оптимальная концентрация ундекана равна 100—250 мг/г [1012]. После разделения содержание ундекана у фронта вдвое превышает исходную величину, а на старте падает почти до нуля. Стекание ундекана можно ослабить путем понижения его исходной концентрации, применения гидрофобной бумаги в качестве носителя и горизонтального проявления хроматограммы. Если не пропитывать начальный участок полосы, то скорость подвижной фазы заметно возрастает. Ундекан можно удалить с бумаги при 80—95° [542].

Как правило, с уменьшением полярности разделяемых липидов приходится использовать неподвижные фазы с более высоким молекулярным весом и пониженной полярностью. Благодаря меньшей растворимости таких веществ в подвижной фазе эффективность разделения и предельный вес пробы возрастают; однако удаление фазы перед обнаружением липидов становится невозможным. Для разделения насыщенных и ненасыщенных кислот и метиловых эфиров применяли 10%-ный тетрадекан в петролейном эфире, 5—10%-ное вазелиновое масло в бензоле, эфире или ССl₄ или 10%-ную смесь вазелинового и парафинового масла в бензоле [11, 30]. На бумаге, пропитанной 5—15%-ным парафиновым маслом (d = 0,895—0,890) в бензоле, эфире или петролейном эфире, разделяли насыщенные кислоты, начиная от C₂₀ и выше, а также триглицериды [68, 86, 169, 281, 563, 786, 965, 996]. Пропитывание обычно проводили протягиванием полосы через раствор или восходящим и горизонтальным насасыванием. Неполярная фаза составляла 10—15% от веса бумаги [889].

Бумага, пропитанная 10—30%-ным латексом каучука, после набухания в ацетоне могла служить для разделения кислот и метиловых эфиров в системах СН₃ОН — ацетон (1 : 1) и 80% СН₃ОН — изооктан. Применяли также смесь 0,5%-ного каучука и 30%-ного нафталина в бензоле (4 : 1) [26, 111]. С тетралином и декалином разделяли 2,4-ДНФГ n-бромфенациловых эфиров («бромазоны»), 2,4-ДНФГ, ацетол- и ацетоксимеркуриметокси-(АОММО)-производные ненасыщенных метиловых эфиров и глицеридов, а также жирные кислоты [413, 414, 417—421, 829, 857]. Растительные масла применяли для пропитывания только в ранних работах; лишь касторовое масло при разделении оксистеариновых кислот превосходит углеводородные фазы по <\br> эффективности [394, 763]. Из кремнийорганических соединений применяют силиконовое масло (1—5%-ный Родорсил 240, Доу Корнинг 200, Тип-2 в циклогексане или эфире), малорастворимое в подвижных фазах [844].

Концентрация неподвижной фазы в системе определяет длительность опыта: при содержании ундекана 150 мг/г бумаги анализ кислот занимает 1—2 час., а при 600—700 мг/г движение полярной фазы прекращается. Если содержится 0,1% фазы, то насыщенные кислоты до C₂₆ можно разделить без нагревания камеры [193, 541]. При снижении содержания фазы разности значений Rƒ (ΔRƒ) возрастают; следовательно, обращенно-фазовая система является истинно распределительной системой, где нет адсорбции. Для воспроизводимости Rƒ содержание фазы по длине полосы должно быть равномерным [541].

Если содержание отдельных липидов в смеси мало, их необходимо препаративно выделить до разделения. Высшие C₂₀—₃₆-кислоты из воска концентрировали кристаллизацией с мочевиной. Полиненасыщенные кислоты из рыбьих жиров фракционировали в виде Li-солей [732]. Жирные кислоты из древесины отделяли хроматографией от смоляных кислот [519]. Спирты на бумаге, пропитанной КОН, мигрировали вместе с фронтом толуола, а кислоты оставались на старте [529].

На стартовую линию в 2—6 см от края наносят по 10—100 мкг каждого компонента или 100—500 мкг смеси липидов в растворе хлороформа, спирта, эфира, ацетона или бензола в виде полосы или точек [428]. Насыщенные кислоты с m = 20—30 для предотвращения кристаллизации следует до разделения выдержать при 80—90°. Ненасыщенные кислоты с сопряженными связями, во избежание полимеризации, следует наносить сразу перед разделением. Ненасыщенные кислоты с изолированными двойными связями также разрушаются на бумаге при отсутствии растворителя [552].

Полосу выдерживают в парах подвижной фазы и проявляют нисходящим, восходящим, горизонтальным или круговым способом; последний метод обеспечивает препаративное разделение липидов (более 10 мг) [92, 522, 546, 604]. Подвижная фаза обычно продвигается от старта на 20—35 см. Эффективность разделения возрастает, если верхней части полосы придать клиновидную форму по Маттиасу. Для быстрого анализа кислот применяли восходящую хроматографию в пробирках [503].

ПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ И ТЕМПЕРАТУРА ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОГО РАЗДЕЛЕНИЯ

Подвижная фаза должна обладать высокой полярностью и низкой летучестью, хорошо растворять липиды пробы и мало смешиваться с неполярной фазой. С увеличением полярности фазы ΔRƒ возрастает, а растворимость липидов снижается. Если умень- <\br> шить количество воды, то длительность и эффективность разделения снизятся. Подвижные фазы непременно содержат неподвижную фазу системы (80—90% от насыщения).

Уксусная кислота почти всегда присутствует в подвижной фазе. Система 90%-ная СН₃СООН — ундекан разделяет C₁₆—₁₈-насыщенные и ненасыщенные кислоты, циклопентенил-жирные кислоты и жирные спирты. Иногда 90%-ную СН₃СООН используют с парафиновым и вазелиновым маслом. Для C₂₀—₃₄-насыщенных кислот и полиненасыщенных глицеридов применяют 95—100%-ную СН₃СООН, а для C₁₀—₁₄-насыщенных кислот и C₁₀—₁₈-окси-, -эпокси- и кетокислот, роданидов кислот, моноглицеридов и оксимов C₈—₁₈-альдегидов — 50—75%-ную СН₃СООН [74, 516, 521, 528, 532]. Если в пробе содержатся C₁₀—₂₄-жирные кислоты, используют разделение с градиентом концентрации СН₃СООН от 50 до 90%; концентрацию Сₜ в момент времени t вычисляют по формуле Cₜ = C₀e^(-Bt/V), где: C₀ — исходная концентрация кислоты; V — объем камеры смесителя; B — скорость поступления кислоты в камеру [281]. Применение муравьиной кислоты для разделения жирных кислот (98% CH₃COOH : 85% HCOOH : вода = 30 : 10 : 1; 85% CH₃COOH : 88% HCOOH = 1 : 1) увеличивает эффективность разделения и компактность зон [294]. Системы с ацетонитрилом или ацетоном хорошо растворяют нейтральные липиды, увеличивают скорость разделения и ΔRƒ и выдерживают температуру до 45°. Для анализа кислот использовали смеси СH₃COOH : CH₃CN (5 : 7), ацетон : СН₃СООН : вода (8 : 2 : 1), ацетон : СН₃СООН (3 : 1) или 85%-ный ацетон : 90%-ную СН₃СООН (3 : 2) [232, 541, 732], для триглицеридов — ацетон : CH₃CN (4 : 1), ацетон : CH₃OH (9 : 1) [534, 548, 563], для АОММО-производных аллиловых эфиров насыщенных кислот и аллилуретанов высших спиртов, а также оксимов сложных диэфиров диоксиацетона — СН₃СОOH : CH₃CN (3 : 1) [523]. Водные 80—90%-ные растворы ацетона служили для разделения моно- и триглицеридов и жирных кислот [183].

Для разделения «бромазонов» и АОММО-производных ненасыщенных липидов применяли системы, содержащие метанол — CH₃OH : CH₃COOH = 30 : 1; 90% CH₃OH : CH₃COOH (30 : 1); CH₃OH : CH₃COOH (5 : 1); 90% CH₃OH : CH₃COOH (5 : 1); 70% CH₃OH : CH₃COOH (3 : 2) [857]. Насыщенные кислоты с m = 20—36 разделяли в системе метилацетат : СН₃СООН : вода (5 : 20 : 2); 99,5%-ный изопропанол : 96%-ный этанол : СН₃COOH : вода (8 : 2,5 : 4 : 1,25) или СH₃OH : CH₃COОН : вода (5 : 4 : 1). Водный 75—95%-ный СН₃ОН и этанол, 55—65%-ный изопропанол и изопропанол : СН₃ОН : вода (11 : 5 : 4) в настоящее время почти не используют для разделения кислот вследствие низкой величины ΔRƒ и «взаиморастворения», т. е. поглощения зон с малым содержанием липидов более крупными соседними зонами [387]. Смеси СН₃ОН с хлороформом 1 : 3 или с тетрагидрофура- <\br> ном и ССl₄, и смесь СН₃СООН : CHCl₃ (16 : 3) применяли для разделения триглицеридов [334]. 2,4-ДНФГ C₈—₁₈-альдегидов разделяли в системе диметилформамид : формамид (5 : 2)/ углеводороды с температурой кипения 150—180°, а их АОММО-производные — в той же системе с тетралином [525, 526].

Взаимное насыщение фаз и хроматографическое разделение обычно проводят при 20 ± 2°. Подъем температуры увеличивает Rƒ и скорость разделения, но вызывает стекание неполярной фазы. Охлаждение до 17° останавливает разделение насыщенных кислот, растворимость которых (в г на 100 г СН₃СООН) при 20 и 30° равна, соответственно: C₁₂ — 81,8, 297; C₁₄ — 10,2, 51,1; C₁₆ — 2,14, 8,11; C₁₈ — 0,12, 1,68 [541]. Уменьшение растворимости с понижением температуры используют для разделения насыщенных и ненасыщенных кислот одинаковой полярности. Насыщенные кислоты можно осадить до разделения из петролейного эфира при —20° [431]. В системе ацетон : ундекан при —20° на старте остаются насыщенные кислоты от C₁₈ и выше, при —30° — C₁₆ и выше, при —38° — C₁₄ и выше, при —50° — C₁₂ и выше, а кислоты, подвижные при данной температуре, разделяются между собой [541]. После нанесения кислот полосу выдерживали при —30°, а затем проявляли 20 час. в системах: 1) ацетон : пропионовая кислота : вода (4 : 3 : 0,5)/ундекан при —30° или 2) 85% CH₃COOH : 85% НСООН : вода (10 : 10 : 1)/силиконовое масло при —10°. Насыщенные кислоты, начиная с C₁₄, в этих случаях не сдвигались со старта [854, 966]. При двумерной хроматографии в первом направлении применяют систему 2, а во втором — 93% СН₃СООН при 20°. При разделении цис-, транс-изомеров система 1 элюирует олеиновую кислоту, а элаидиновая кислота остается на месте [586, 720]. Для повышения растворимости C₂₀—₂₆-насыщенных кислот температуру в камере приходится поднимать до 30°, для C₂₄—₂₈ — до 45—55°, а для C₂₆—₃₄ — до 55—85° [996].

ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИЙ КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП

Окрашенные производные липидов, например «бромазоны» жирных кислот, можно сразу определить количественно при помощи фотометра [421]. Однако большинство липидов алифатического ряда бесцветно. Для их обнаружения и количественного определения применяют цветные реакции, даваемые карбоксильными и другими функциональными группами.

Жирные кислоты и другие кислые липиды легче всего определить неспецифической реакцией с индикаторами: 0,2—0,4%-ным бромтимоловым синим в спирте, рН 8—8,3, бромфеноловым синим или бромкрезоловым зеленым, 0,05%-ным крезоловым красным и крезолфталеином в 0,8%-ном NaOН, малахитовым зеленым, нильским голубым, тимолфталеином и феноловым красным. С пирогаллоловым красным наименьшее количество липида, которое <\br> можно визуально определить на распределительной хроматограмме z = 15 мкг [190, 429, 602, 603, 605]. Данные титрования кислот 0,005 н. NaOH по бромтимоловому синему после их экстрагирования с бумаги совпадали с результатами роданометрического определения [429, 681].

Обычно жирные кислоты определяют в виде солей тяжелых металлов. Например, после получения радиоактивных солей кобальта-60 количество жирных кислот можно установить с точностью до ± 2,5% [505, 507, 768].

Основной ацетат меди (II) используют чаще других солей. Полосу погружают на 20 мин. в смесь насыщенного ацетата меди и воды (1 : 49), промывают водой, подкисленной СН₃СООН, и обнаруживают бледно-зеленые зоны кислот. Для получения темно-бурой окраски ферроцианида меди применяют 1—1,5%-ный ферроцианид калия (z = 5 мкг). Если этот раствор подкислить, то соли переходят в свободные жирные кислоты. Таким образом, реакцию с ацетатом меди — ферроцианидом калия можно проделать многократно для повышения чувствительности. Под действием 5%-ного FeCl₃ ферроцианид калия дает голубые зоны FeCu[Fe(CN)₆] [541]. В реакции Си-солей, обработанных парами NН₃, с основным 0,03%-ным спиртовым дитиооксамидом (рубеановой кислотой) z = 0,1 мкг меди. Применяя многократное окрашивание, обнаружили C₃₀—₃₄-кислоты воска, способные разделяться только в очень малых количествах. Эту же реакцию дают альд- и кетоксимы [304, 549]. Соли меди можно обнаружить по выделению О₂ и вспениванию с Н₂О₂ и NH₄OH (z = 5—10 мкг). Окраску Си-солей жирных кислот усиливают 0,5%-ный родамин С и анилин : этанол = 1 : 1 [504, 507, 553].

Для определения жирных кислот измеряют площадь пятна Т' и вычисляют количество кислот С' по формуле Т' = klgC' + b, где для олеиновой кислоты k = 182, b = 166, а для линолевой — k = 134, b = 189 [428].

Обычно количественное соотношение зон определяют фотоэлектрическим денситометром. Над 1-миллиметровой целью фотоэлемента протягивают окрашенные хроматограммы или их фотографии и отмечают поглощение света. Площадь пиков на кривой пропорциональна молярной концентрации кислот [35]. Для получения равномерного низкого фона светопоглощения необходимо очистить бумагу (стр. 53) и возможно полнее удалить неподвижную фазу, СН₃СООН (без нагревания) и раствор Си-соли, рН которого не должен превышать 5 [347, 864]. Если нельзя удалить с бумаги неполярную фазу, то кислоты с низкой К не полностью переходят в Си-соли и при расчете надо вводить поправку. Когда светопоглощение между пиками не возвращается к нулю, площадь для каждого компонента находят при помощи вспомогательных линий. Закон Беера соблюдался в пределах от 1 до 60 мкг кислот. Точность определения кислот, содержание которых превышало 2%, достигала ± 3% [865, 866]. Стехиометрию реакции дока- <\br> зали методом полярографии и колориметрии. Ионы меди элюировали 0,06—1 н. раствором H₂SO₄. Линейность высоты ступени на полярограмме от количества меди наблюдалась в диапазоне 1—7 мкг меди на 1 мл. При колориметрии с 0,1 М тетраэтилтиурамдисульфидом или 0,001%-ным дитизоном закон Беера выполнялся от 10 до 30 мкг/мл. Точность обоих методов равна ± 5% [378, 500, 515, 760].

Соли серебра получали за 5—30 мин. в 1%-ном растворе аммиачного AgNO₃, избыток соли отмывали и фиксировали Ag разбавленной НСІ. Для C₂₀—₃₄-кислот раствор нагревали до 55—85°. Соли Ag окрашивали 10 мин. нагреванием до 140—150°, сульфидами NН₃ и Na, сероводородом, фенилгидразином и 0,03—0,5%-ным n-диэтиламинобензилиденроданином [275, 763, 780]. Точность денситометрии C₁₆—₁₈-кислот на МФ-4 с дополнительным проектирующим объективом была достаточно высокой, тогда как фотографии хроматограммы C₂₄—₃₄-кислот сканировали на приборе МФ-2 с неудовлетворительным результатом. После озоления бумаги точность анализа 0,2—2 мкмолей Ag с дитизоном составляла ± 5%. Жирные кислоты можно также определить радиометрически с Ag¹¹⁰ [432].

Соли ртути — 0,1%-ный ацетат Hg (II) и 0,5%-ный раствор CH₃COOH, 15 мин. — оказались устойчивее к гидролизу, чем соли меди, а фон бумаги был светлее. Соли окрашивали 0,2%-ным S-дифенилкарбазоном, окраску элюировали СН₃ОН с толуолом (1 : 1) и измеряли при 530 ммк. Радиометрическое определение проводили с Hg²⁰³ [432, 965]. Свинцовые соли (1—3%-ный ацетат Pb, pH 5,3—5,7, 20—40°) окрашивали H₂S, 1,5%-ным сульфидом NH₃ или раствором 2 г Na₂S, 100 г NH₄NO₃ и 30 мл Н₂О₂ в 1 л (z = 0,5 мкг кислоты). Не обнаруживаются Pb 2-оксикислоты. После экстракции с бумаги 10%-ным раствором HNO₃ свинец определяли с дитизоном при 520 ммк. Благодаря тщательной очистке бумаги, реактивов и кварцевой посуды от следов тяжелых металлов, достигалась удовлетворительная точность измерения [2]. Реакция кислот с нитратом Bi (при 70—80°) и сульфидом NН₄ по величине z не уступала реакции с Pb-солями [880].

ДРУГИЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

Вицинальные ОН-группы моноглицеридов и полиоксистеариновых кислот обнаруживали реакцией Шиффа: 1%-ным периодатом, SO₂ и n-розанилином (z = 10—20 мкг) или раствором 35% буры, 0,8%-ного КЈ, 0,9%-ного Н₃ВО₃ и 3% крахмала (липиды давали белые пятна на синем фоне). Для радиометрического определения моно- и диглицериды ацетилировали (C¹⁴H₃CO)₂O [199, 681, 994].

Ненасыщенные липиды обнаруживали путем реакций окисления или присоединения по двойным связям. При окислении <\br> в 0,1—1%-ном щелочном КМnО₄ ненасыщенные липиды за 1,5—5 мин. образуют бурые пятна МnO₂; кислый КМnО₄ дает белые пятна на розовом фоне [70]. Пятна, полученные после обработки щелочным КМnО₄, денситометрировали в отраженном свете; содержание жирных кислот, глицеридов и эфиров стеринов определяли по высоте или площади пиков с точностью 3—5%. Ненасыщенные кислоты окисляли 1%-ным NaJO₄ и 1%-ным КМnО₄ и сканировали на микрофотометре [918]. При озонировании полосу обрабатывали NaHSO₃, затем 20—60 мин. озоном и, наконец, реактивом Шиффа [283].

Ненасыщенные и в меньшей степени насыщенные липиды давали в парах иода пятна, коричневые или желтые при разном рН. Хроматограмму сканировали с синим фильтром. Присоединенный по двойным связям иод обнаруживали с 0,5—1%-ным крахмалом в виде синих пятен на светлом фоне (z = 3—4 мкг) или с 0,2 н. AgNO₃ и фотографическим проявителем эйкобромом [89]. Бром и родан можно частично отщепить от двойных связей в парах NH₃; Вr обнаруживали с феноловым красным и хлорамином (z = 0,1 мкг), а CNS⁻ — с солями Fe³⁺ [75]. Для радиометрического микроопределения массы и иодного числа липидов использовали растворы и пары J¹³¹Br [43, 506].

Для присоединения по двойным связям солей и эфиров жирных кислот применяют также ацетат Hg (II) в СН₃ОН:

—CH=CH— → —CH(OCH₃)—CH(HgOCOCH₃)—

АОММО-Производные эфиров синтезируют до разделения; производные солей получают на бумаге в 2%-ном ацетате Hg²⁺, содержащем 1%-ную СН₃СООН, только после разделения. Связанную Hg обнаруживают 0,1—0,2%-ным спиртовым S-дифенилкарбазоном и парами NH₃; H₂S окрашивает Hg после ее вытеснения из производных парами HCl (z = 1 мкг линолената) [547]. Для количественного анализа применяют колориметрическое определение ртути в виде ее комплексов с S-дифенилкарбазоном или дитизоном, а также полярографию и денситометрию [546]. Кауфман использовал АОММО-производные для определения насыщенных и ненасыщенных кислот с одинаковой К, например пальмитиновой и олеиновой. Параллельные хроматограммы окрашивали ацетатами Сu или Hg. Поскольку СООН-группа эквивалентна 1/2 атома Си и Hg, а двойная связь — одному атому Hg, С' (содержание насыщенной кислоты в %) вычисляли по формулам:

C' = [(2e+1—x)/2e] × 100; x = F_Hg^Cu : F_Cu^Hg = F_Hg^пр : F_Hg^ст (F_Cu^ст : F_Hg^ст),

где: е — число двойных связей ненасыщенной кислоты, которая не определяется от данной насыщенной кислоты; F_Cu и F_Hg — площади пиков неразделяющейся смеси насыщенной и ненасыщенной кислот, полученные при сканировании хроматограмм, окрашенных соответственно солями Си или Hg; F_Cu^ст и F_Hg^ст — площади для стандарта (стеариновой кислоты) [547]. <\br> При помощи паров OsO₄ обнаруживают 5 мкг олеиновой и 2,5 мкг линолевой кислоты в виде серых пятен на светлом фоне [501, 762].

Ряд методов обнаружения липидов основан на селективной адсорбции липофильных красок и других веществ из водно-спиртовых растворов и на образовании соединений включения. Из флуоресцирующих красок обычно применяют 0,05%-ный родамин С, который обнаруживает моно-, ди- и триглицериды и жирные спирты в виде белых пятен, флуоресцирующих синим, на розовом фоне (z = 2 мкг). Под действием КМnО₄ цвет пятен переходит в желтый. Окраску родамина усиливают нильским голубым, хинином, акридиновым оранжевым и т. д. [508, 509]. Родамин С был применен для приближенного определения моноглицеридов по площади пятна. Протопорфирин обнаруживает фосфолипиды, кислоты и глицериды в виде флуоресцирующих красных пятен на светлом фоне (z = 1 мкг) [919].

Комплексы липидов с жировыми красителями, хорошо заметные в видимом свете, образуются только после удаления углеводородов с бумаги. Испытывали судан IV, масляный красный О и другие красители; лучшим оказался судан черный Б, который обнаруживает эфиры многоатомных спиртов и стеринов, но, в отличие от родамина, не окрашивает эфиры одноатомных спиртов. Ненасыщенные липиды лучше связывают судан, чем насыщенные; на прямом свету окраска переходит в розовато-бурую [234, 518, 601]. Растворы жировых красителей в 50%-ном диацетате глицерина использовали для денситометрии глицеридов; пропитывание полосы парафиновым маслом, α-бромнафталином и эмульгирующим веществом повышало точность измерений [925]. Липиды, благодаря их поверхностно-активным свойствам, можно обнаружить по изменению гидрофильности отдельных участков полосы после разделения. На бумаге с парафиновым маслом триглицериды давали прозрачные пятна в растворе КОН. Триглицериды можно омылить на бумаге 10—20%-ным раствором КОН при 95°, а затем обнаружить солями меди. При полном омылении окрашивание суданом прекращается [510, 531, 557].

Циклодекстрин, связываемый липидами по типу реакций включения, не окрашивается парами иода, а дает белые пятна на синем фоне. Ди- и триглицериды, не образующие соединений включения, надо предварительно гидролизовать панкреатином на бумаге. Реакцию включения использовали для денситометрии триглицеридов и метиловых эфиров кислот [294, 681, 854].

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ПРЕДЕЛАХ ОТДЕЛЬНЫХ ГОМОЛОГИЧЕСКИХ РЯДОВ

В обращенно-фазовой системе разделяются гомологи, различающиеся между собой на одну СН₂-группу, а для рядов с одинаковой длиной цепи — на двойную или тройную связь, окси- или <\br> кетогруппу и т. д. До настоящего времени разделили гомологические ряды н-насыщенных жирных кислот с m = 10—36, «четных» и «нечетных» [156, 532, 880], моно-, ди-, три- и полиненасыщенных кислот с m = 11—28 [4, 544, 732], моно- и диацетиленовых кислот, циклопентенилненасыщенных кислот [81, 516]; н-насыщенных 2-оксикислот с m = 14—24 [880], миколевых кислот с m = 30 [786], окси-, диокси- и кетонасыщенных и ненасыщенных кислот [417], насыщенных 2-метил-4-кетокислот с m = 14—26 [528]; ди-, тетра- и гексабромстеариновых кислот [545], аддуктов малеинового ангидрида с кислотами, содержащими сопряженные двойные связи [190]; «бромазонов» н-насыщенных и ненасыщенных кислот, альдегидов и кетонов и их АОММО-производных с m = 2 — 26 [418], АОММО-производных ненасыщенных кислот и аллиловых эфиров насыщенных кислот с m = 20 — 30 [546], насыщенных и ненасыщенных спиртов с m = 10—18 и их аллилуретанов [529], АОММО-производных аллилуретанов насыщенных и ненасыщенных спиртов с m = 10 — 30 [523], 2,4-ДНФГ насыщенных и ненасыщенных альдегидов и их АОММО-производных [525], оксимов сложных эфиров диоксиацетона с m = 8 — 18 и высших альдоксимов [521]; эфиров насыщенных и ненасыщенных кислот с одно- и многоатомными алифатическими и ароматическими спиртами [518], моно-, ди- и триглицеридов одной кислоты или разных кислот [373, 430, 854], триглицеридов синтетического и природного происхождения, содержащих остатки C₈—₂₄-насыщенных и ненасыщенных кислот [530], а также АОММО-производных глицеридов [420].

Туберкулостеариновая и нонадекановая кислоты совпадают по Rƒ; следовательно, разветвление цепи в данном случае не влияет на подвижность [516]. Если двойная связь достаточно удалена от концов цепи, действует правило полярности (стр. 47). Двойная связь рядом с карбоксилом не изменяет Rƒ; так, 2-октадеценовая и стеариновая кислоты не разделяются между собой. Положение двойной связи в цикле или ряду, изолированное или сопряженное, цис- или транс-, не влияет на подвижность. Замена двойной связи в цепи тройной связью увеличивает Rƒ [81, 544]. Полярность ОН-группы выше, чем у СО-группы, поэтому 12-окси- и 12-кетостеариновые кислоты отделяются друг от друга. В ряду окси- и кетокислот приближение функциональной группы к карбоксилу вызывает снижение хроматографической подвижности [528, 545].

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ РАЗНЫХ ГОМОЛОГИЧЕСКИХ РЯДОВ И РАЗНЫХ КЛАССОВ

Если члены разных гомологических рядов совпадают по величине К и значению Rƒ, то для разделения таких липидов надо либо элиминировать ненасыщенные компоненты, либо сместить равновесие полярности в смеси насыщением двойных связей гидрофильными или гидрофобными заместителями. Жирные кислоты перед хроматографией разделяли на насыщенные и ненасыщенные <\br> старыми методами Твитчелла и Бертрама, а также кристаллизацией Си-солей из этанола или кристаллизацией кислот из 55%-ного ацетонитрила. Ненасыщенные компоненты обнаруживали и определяли параллельным разделением исходных и окисленных 1%-ным основным КМnО₄ липидов. Подвижную фазу CH₃COOH : HCOOH : H₂O₂ = 9 : 1 : 1 или 6 : 1 : 1 при 37°, содержащую надмуравьиную кислоту, применяли для полного разрушения ненасыщенных кислот во время разделения; насыщенные кислоты в этой фазе не окислялись [64, 156]. При гидроксилировании перманганатом и роданировании двойных связей Rƒ кислот возрастали, а при галоидировании JBr — снижались. Подвижность ненасыщенных кислот увеличивалась после бромацетокси- и бромметоксилирования с N-бромсукцинимидом, а также после образования АОММО-производных «бромазонов» этих кислот. Диастереоизомеры бром-ацетокси- и метоксипроизводных полиненасыщенных кислот образуют на хроматограмме по две зоны [459, 502, 585].

Жирные кислоты с одинаковым Rƒ разделяли путем гидрирования двойных связей с образованием соответствующих насыщенных кислот более низкой полярности. В одних случаях кислоты разделяли до и после гидрирования с PdO₂ на BaSO₄ в этаноле или с PtO₂ по Адамсу в СН₃СООН. Если в липидах присутствовала пальмитолеиновая кислота, то гидрировали не общую смесь кислот, а выделенную хроматографией фракцию, содержащую пальмитолеиновую, миристиновую и линолевую кислоты; продукты гидрирования разделяли повторно [551]. В других случаях гидрирование проводили непосредственно на бумаге (стр. 52), а затем разделяли гидрированные и негидрированные смеси [191, 511, 1004, 1005]. Для определения линоленовой и α-элеостеариновой кислот, совпадающих по Rƒ, получают аддукты элеостеариновой кислоты с малеиновым ангидридом в присутствии иода, смесь кислот гидрируют и разделяют повторно [189, 192]. Карбонильные группы липидов восстанавливают раствором NaBH₄ в тетрагидрофуране [520]. Для определения кислот одинаковой полярности применяют также низкотемпературную хроматографию (стр. 57) и реакцию взаимодействия двойных связей с солями Hg (стр. 60) [519—522].

Таким образом, правило полярности вносит значительные трудности в проведение анализа липидов. В то же время расшифровка сложных смесей, например смесей триглицеридов, где фракция определенной полярности может содержать 6, 7 и более компонентов, подчас сильно облегчается благодаря тому, что липиды известного строения двигаются в данной хроматографической зоне на основе строгой закономерности.

Обращенно-фазовые системы почти не применяются для фракционирования смеси липидов на классы: различия в полярности столь велики, что разделение в какой-либо одной системе становится невозможным. Кроме того, липиды различных классов, характеризуемые разными значениями К, часто совпадают по величине <\br> Rƒ. Так, олеиловый спирт не отделяется от миристиновой кислоты, а диглицериды накладываются на зону стеариновой кислоты [387]. Для сопоставления классов по абсолютной величине полярности ввели понятие «всеобщей» константы полярности — Квс. Системой отсчета служил гомологический ряд эфиров одноатомных спиртов и «четных» н-жирных кислот: значения Квс и К у них совпадали. Для липидов другого гомологического ряда Квс равна величине К того вещества системы отсчета, которое имеет одинаковое с этим липидом значение Rƒ. Инкремент і, т. е. разность между Квс и К данного липида, постоянен для определенного ряда. Аддитивная величина і зависит от числа СН₂-, СООН, ОН-групп, двойных или сложноэфирных связей, положения функциональных групп и других факторов. Для триглицеридов значение і равно 14, для сложных эфиров ненасыщенных кислот — 12, для 2-оксикислот — 10, для сложных эфиров ароматических спиртов — 2 и т. д. Такая абсолютная шкала полярности весьма полезна для идентификации липидов по их принадлежности к конкретному гомологическому ряду [518].

Как видно, подвижность липидов при разделении зависит от их состава. Связь величины Rƒ в различных системах [92, 232, 584] с параметрами молекулы насыщенных жирных кислот выражали эмпирическими уравнениями:

Rƒ = 1,671—0,1326m + 0,0028m²; Rƒ = 1,42 + (—0,062)m; Rƒ = 1,50—0,00625m,

а для ненасыщенных кислот — уравнениями:

Rƒ = 1,42—(—0,062) (m—2); Rƒ = 1,57—0,06m.

Зависимость значений Rƒ от m жирных кислот или их n-фенилазофенациловых эфиров была линейной [532]. Для триглицеридов такой зависимости не обнаружили [534]. Величина Rƒ ненасыщенных кислот с m = 18 была линейной функцией числа двойных связей в цепи [430].

ЗНАЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ РАЗНОВИДНОСТЕЙ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

В настоящее время методы распределительной хроматографии широко используются для разделения липидов природного происхождения. Однако не все эти методы равноценны.

Хроматография на колонках с полярной неподвижной фазой применима для анализа отдельного гомологического ряда алифатических соединений или их полярных производных; для разделения смеси нескольких рядов липидов нужны более эффективные методы. <\br> Значительно шире распространены обращенно-фазовые системы, которые применяют в колоночной хроматографии для препаративного выделения липидов, в частности липидов с кислородсодержащими функциональными группами в цепи. Этот метод, не требующий сложного и дорогого оборудования, в мягких условиях позволяет получить несколько граммов чистого препарата с достаточно высоким выходом. Для аналитического разделения этот вид хроматографии менее пригоден, поскольку для работы нужно несколько десятков миллиграммов материала, а сами рабочие операции довольно трудоемки [709].

Тонкослойная обращенно-фазовая хроматография в последнее время используется для аналитического разделения. При сочетании ее с высокоэффективными методами тонкослойной хроматографии, особенно с разделением на силикагеле, пропитанном AgNO₃, липиды определенного класса можно охарактеризовать по величине m и е на одной пластинке. Возможности препаративного выделения и количественного определения липидов здесь, по-видимому, более ограниченны, хотя и имеются указания на работы подобного рода [558].

Ведущее положение среди других распределительно-хроматографических методов исследования липидов продолжает сохранять обращенно-фазовая хроматография на бумаге. Изменяя состав неподвижной и подвижной фазы, температуру, длительность опыта и другие факторы, можно сравнительно быстро найти оптимальные условия разделения конкретной смеси липидов. По быстроте разделения (несколько часов) и чувствительности обнаружения липидов (доли микрограмма) хроматография на бумаге в ряде случаев приближается к тонкослойной и газо-жидкостной хроматографии. Для идентификации липидов имеется много качественных реакций, проводимых непосредственно на бумаге. Аналитическое разделение хорошо сочетается с денситометрическим количественным определением и автографическим измерением радиоактивности отдельных зон.

Простота и воспроизводимость разделения — главные преимущества хроматографии на бумаге: анализ может быть выполнен без значительных затрат труда и средств в каждой лаборатории с минимально необходимым оборудованием и реактивами. Данный метод не только очень удобен для быстрой оценки состава отдельных функций элюата хроматографической колонки, но и сам по себе может быть использован в препаративном масштабе для выделения липидов в количестве 1—50 мг.

Таким образом, обращенно-фазовая распределительная хроматография вполне пригодна для анализа классов и гомологических рядов липидов несложного состава. В целях расшифровки многокомпонентных природных смесей липидов и идентификации отдельных соединений этот метод необходимо сочетать с адсорбционной и газо-жидкостной хроматографией и другими современными методами анализа липидов.

Глава 3. ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

РАЗДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Газо-жидкостная распределительная хроматография была предложена в 1952 г. Джеймсом и Мартином как метод разделения летучих C₁ — C₁₂-свободных жирных кислот [436]. Для работы служила колонка с кизельгуром, пропитанным смесью силиконового масла и стеариновой кислоты 9 : 1; последнюю включали в состав жидкой фазы для подавления димеризации жирных кислот, молекулы которых отличаются повышенной полярностью. Ассоциацию карбоксильных групп и образование димеров, которые снижают летучесть кислот и приводят к появлению несимметричных размытых зон на хроматограмме, можно также несколько уменьшить, изменяя величину исследуемой пробы, концентрацию жидкой фазы в колонке и рабочую температуру [160]. В настоящее время в свободном виде разделяют главным образом низшие жирные кислоты [21, 540]. Имеется лишь несколько работ, посвященных газовой хроматографии свободных высших жирных кислот. Условия разделения этих кислот приведены в табл. 4.

Как показывают данные табл. 4, димеризацию свободных жирных кислот подавляли путем использования полярных жидких фаз, содержащих нелетучую минеральную кислоту [461, 717]. Свободные жирные кислоты в малых концентрациях разделялись на колонках с неполярной фазой; при этом повышение рабочей температуры снижало асимметрию пиков [93]. На полиэфирной колонке асимметрия пиков возрастала при увеличении температуры и снижении концентрации жидкой фазы [912]. При всех условиях разделения наблюдалось значительное растягивание нисходящей части пика (образование «хвостов»).

По сравнению с соответствующими метиловыми эфирами свободные кислоты имели более высокие значения удерживаемых

Условия анализа свободных высших жирных кислот методом газо-жидкостной хроматографии

УСЛОВИЯ РАЗДЕЛЕНИЯ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

В 1953 г. было обнаружено, что для газохроматографического разделения лучше применять не свободные жирные кислоты, а их менее полярные производные — метиловые эфиры. Благодаря такой замене достигли более высокой эффективности разделения при меньших температуре и времени анализа, а также большей точности идентификации и количественного определения [228, 229]. В настоящее время газо-жидкостную хроматографию метиловых эфиров высших жирных кислот можно считать стандартным методом исследования состава и строения природных липидов [359]. При помощи этого метода можно анализировать различные жирные кислоты от C₁ до C₃₀ и выше: насыщенные, разветвленные, ненасыщенные (цис- и транс-изомеры), окси-, эпокси-, кето-кислоты и т. д. Применение современных методов позволяет быстро превратить все эти кислоты в метиловые эфиры с количественным выходом. Полученные эфиры разделяют на насадочных или капиллярных колонках, нагретых до 150—300°; колонку наполняют твердым носителем (обычно разными сортами кизельгура) с нанесенной на него высококипящей неполярной или полярной жидкой фазой. В качестве газа-носителя используют азот, гелий или аргон, которые проходят через колонку со скоростью 30—100 мл/мин. Метиловые эфиры детектируют и количественно определяют при помощи катарометра, β-ионизационного или пламенно-ионизационного детекторов. В табл. 5 приведено несколько примеров разделения метиловых эфиров.

Таблица 4

ПОЛУЧЕНИЕ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Существуют две группы методов получения метиловых эфиров жирных кислот для хроматографических целей: 1) каталитическая переэтерификация липидов в растворе метанола (метанолиз); 2) омыление липидов, выделение жирных кислот и их последующая этерификация.

До проведения метанолиза липиды растворяют в абсолютном метаноле, содержащем тот или иной катализатор этой реакции; в случае неполного растворения прибавляют бензол или толуол [909]. Чтобы обеспечить количественный выход эфиров, все применяемые реактивы должны быть тщательно очищены от сопутствующих загрязнений [627]. Условия реакции, используемые различными авторами, приведены в табл. 6. Как видно из данных табл. 6, метанолиз в основной среде обычно заканчивается гораздо быстрее, чем в кислой; при этом НСІ и H₂SO₄ не различаются по каталитической активности, а калий превосходит натрий [657]. В 1%-ном растворе Nа в первичных спиртах алкоголиз триглицеридов проходит полностью за 2ᵐ мин., где m = 1—6 — число атомов углерода в молекуле спирта [291]. В отсутствие кислорода выход метиловых эфиров несколько повышается. Окончательная очистка эфиров перед хроматографией может быть достигнута фракционной перегонкой [671], возгонкой в вакууме [235, 909] или же адсорбционной хроматографией на колонке с силикагелем, либо в тонком слое [291, 657]. Полученные метиловые эфиры можно полностью защитить от окисления в течение длительного времени пу- <\br> тем хранения их бензольного раствора в темноте в атмосфере инертного газа при температуре ниже 0° [412].

Условия переэтерификации вполне пригодны и для превращения жирных кислот, выделенных омылением липидов, в их метиловые эфиры (см., например, [935]). Однако существуют и более быстрые методы этерификации, занимающие не более нескольких минут [793, 794]. Уже в течение ряда лет метиловые эфиры получают этерификацией кислот диазометаном. Для проведения реакции к эфирному раствору жирных кислот (100 мг) при-

Таблица 6 Условия получения метиловых эфиров жирных кислот методом метанолиза

Недостаток этого метода состоит в том, что диазометан ядовит и взрывоопасен. Кроме того, он может давать артефакты — продукты присоединения CH₂N₂ к двойным связям жирных кислот [909]. В последнее время было обнаружено, что свежеприготовленный раствор СН₂N₂ в смеси СН₃ОН и эфира 1 : 9 позволяет получать метиловые эфиры за 10 мин. с количественным выходом и без примеси продуктов разрушения или полимеризации. По-видимому, метанол играет в данной реакции роль катализатора [851]. В другой работе рекомендуется синтезировать эфиры, выдерживая жирные кислоты в слабом растворе диазометана при —34° в течение двух с половиной дней [101]. Этерификация жирных кислот в растворе трехфтористого бора в метаноле заканчивается всего за 2 мин., но выход метиловых эфиров не превышает 90—95%; эпоксикислоты и кислоты с сопряженными двойными связями не могут быть этерифицированы этим методом [718]. Активность CH₂N₂, HCI и BF₃ в реакции образования эфиров высших жирных кислот приблизительно одинакова [412, 693]. Наиболее удобным методом получения метиловых эфиров, обеспечивающим количественный выход эфиров независимо от жирнокислотного состава масла, можно считать омыление жира с последующей этерификацией возникших в этой реакции жирных кислот метанолом в присутствии хлористого водорода. Для получения количественного выхода более летучих эфиров низших кислот C₁—C₁₀ следует применять диазометан [693] и использовать докозан в качестве растворителя [539] или же вместо метиловых эфиров получать этиловые эфиры [62].

В цереброзидах мозга содержатся жирные 2-оксикислоты. Для этерификации этих кислот и их 2-ацетоксипроизводных применяют реакцию с 2,2-диметоксипропаном в подкисленном метаноле [578, 807]. Эпоксикислоты при омылении разрушаются и переходят в соответствующие диоксикислоты; при наличии эпоксикислот в липидах следует использовать метанолиз в присутствии натрия [944].

Существуют и другие методы получения летучих производных липидов для газо-жидкостной хроматографии. Так, гидрогенолизом триглицеридов с алюмогидридом лития получен свободный глицерин и высшие спирты, соответствующие отдельным жирным кислотам. Продукты ацетилирования этих соединений — триацетин и ацетаты жирных спиртов — определяли газо-жидкостной хроматографией [399]. Для получения эфиров летучих и нелетучих органических кислот предложена реакция солей серебра с иодистым метилом в атмосфере инертного газа в течение 5 час.; выход метиловых эфиров составлял 96—100% [292].

ВВОД ПРОБЫ И ТЕМПЕРАТУРА РАЗДЕЛЕНИЯ

Летучие компоненты жидкой фазы и пары воды удаляют из колонки при температуре на 5—10° выше рабочей в токе газа-носителя в течение 48—96 час. [631]. Иногда колонку с твердым носителем, содержащим 10—25% жидкой фазы, стабилизируют нагреванием до 300° при 10 мм рт. ст. в течение 5 час. [160].

Ввод пробы в колонку производят с максимальной быстротой, предпочтительно без перерыва потока газа-носителя. Обычно метиловые эфиры вводят в хроматограф в виде раствора в летучих органических веществах [434]. Описано приспособление для ввода малых проб метиловых эфиров в хроматографическую колонку с замкнутой системой инъекции [821].

Для успешного разделения метиловые эфиры высших жирных кислот необходимо сразу же после их введения в хроматограф перевести в газообразное состояние [499, 793, 794, 944]. Для этого многие модели хроматографов снабжены испарительными камерами, где поддерживается температура на 50—100° выше температуры колонки [631]. При использовании капиллярных колонок эта разность температур может достигать 150° [644, 765]. Если испарение пробы на входе колонки не происходит достаточно быстро, то эффективность разделения снижается, особенно для компонентов с большой величиной удерживаемого объема Vᵣ [821]. Эфиры насыщенных и ненасыщенных кислот обычно при испарении химически не изменяются [910]. Однако ненасыщенные кислоты с сопряженными двойными связями и гидроксильными группами в испарительной камере могут подвергаться цис,транс-изомеризации или дегидрироваться [743]. Эфиры кислот тунгового масла, содержащего более 70% элеостеариновой кислоты, полимеризуются в хроматографической колонке при высоких температурах [793]. Поэтому для проведения газохроматографического определения кислот с указанными выше особенностями строения необходимо применять минимально возможную температуру и использовать для разделения более устойчивые производные кислот.

Правильный выбор рабочей температуры и ее регулирование в течение всего опыта во многом определяют успех работы. Раньше высокую температуру в колонке создавали при помощи паровой бани, содержащей высококипящие жидкости (типа этиленгликоля, температура кипения 197°) [93]; сейчас обычно пользуются воздушным термостатом.

Температурный режим газохроматографического разделения зависит от состава метиловых эфиров пробы и химической природы жидкой фазы колонки. Наилучшие результаты разделения эфиров кислот от C₁₆ до C₃₀ включительно на неполярных жидких фазах (апьезонах М и L, силиконовом масле) достигаются при температуре колонки 250—300° [94, 573, 794]. При более высоких температурах скорость хроматографии возрастает, но эффективность разделения снижается [434, 644]. Для полиэфирных фаз температу- <\br> ра редко превышает 200—210° [62, 101, 794], так как дальнейшее нагревание вызывает деструкцию неподвижной фазы [397]. В ряде случаев разделение одной и той же смеси на капиллярных колонках достигалось при более низких температурах, чем на насадочных колонках [614, 632, 633, 644].

Температура колонки оказывает значительное влияние на удерживаемый объем отдельных компонентов. Так, на полиэфирной колонке метилстеарат не отделяется от метилолеата при 125°, но хорошо отделяется при 158—168° [632]. «Фактор разделения» — отношение удерживаемого объема Vᵣ данного компонента смеси к Vᵣ предыдущего гомолога ¹ [437] — для эфиров насыщенных кислот и кислот с разветвленной цепью с повышением рабочей температуры обычно снижается, а для ненасыщенных эфиров (по отношению к предшествующим насыщенным эфирам с той же длиной цепи) — возрастает [614]. Эту закономерность можно использовать для хроматографической идентификации жирных кислот. При разделении смеси метиловых эфиров на полярной колонке без предварительной калибровки катарометра повышение температуры приводило к завышенным результатам для легколетучих компонентов и заниженным значениям для эфиров с большим временем удерживания. С падением температуры анализа ошибка определения снижалась [631, 765] (стр. 85).

Если смесь метиловых эфиров содержит компоненты, резко различающиеся по своей летучести, то анализ такой смеси при одной температуре колонки становится невозможным. В подобных случаях проводят два анализа: более летучие эфиры с m = 2—10 определяют при 100—120°, а метиловые эфиры высших жирных кислот разделяют при 180—200°; при этом эфиры низших кислот выходят как один пик в начале хроматограммы [280, 437, 793, 968].

В последнее время хроматографию производных низших и высших кислот осуществляют в условиях программирования рабочей температуры [793, 801]. Температуру колонки от начального значения (130—170°) повышают согласно заданной программе со скоростью 3—5° в минуту, пока из колонки не выйдет последний компонент разделяемой пробы. При этом температура детектора поддерживается на постоянном уровне, находящемся около середины выбранного температурного диапазона. Анализ жирнокислотного состава с программированием температуры имеет ряд преимуществ по сравнению с изотермическим. Эффективность разделения метиловых эфиров, особенно их наиболее летучих компонентов, возрастает, а сам анализ ускоряется благодаря снижению величины Vᵣ менее летучих фракций. В условиях программирования пики всех эфиров имеют оптимальную симметричную форму и приблизительно одинаковую ширину, что позволяет с большей точностью определять их площадь. В то же время при работе на

¹ В отечественной литературе это понятие обозначают «относительная летучесть». <\br> колонках с полярной жидкой фазой в программированном температурном режиме в конце разделения может наблюдаться дрейф нулевой линии. Для устранения дрейфа применяют систему из двух колонок и двух детекторов, в которой унос жидкой фазы из рабочей колонки компенсируется такой же потерей из параллельной колонки, не используемой для разделения. Кроме того, программирование затрудняет идентификацию эфиров по Vᵣ, а постепенное повышение скорости газа-носителя при нагревании колонки может сказаться на точности количественного определения метиловых эфиров [47а, 315, 689].

Для получения достоверных количественных данных катарометр следует тщательно термостатировать [765]. Обычно температура катарометра на 25—75° превышает температуру колонки [631]. В некоторых случаях такой температурный градиент создают и для ионизационных детекторов [499, 644].

Срок работы колонки значительно увеличивается, если в нерабочее время снижать ее температуру [272, 644].

ТВЕРДЫЙ НОСИТЕЛЬ

В различных исследованиях по газо-жидкостной хроматографии липидов применяли твердые носители с размером частиц 50—150 меш; диапазон зернения для одной колонки не должен превышать 20 меш. В качестве твердого носителя чаще всего использовали различные сорта кизельгура (диатомовой земли) — Целит-545 [93, 223, 612], Хромосорб [397, 498, 671, 771, 894], Стерхамол [573] и Эмбасел [235]; иногда применяют и другие материалы — толченый огнеупорный кирпич [944], стеклянные шарики [396], хлористый натрий [229] и др. Перед нанесением жидкой фазы твердый носитель отмывают концентрированной соляной кислотой, затем раствором КОН, раствором NН₄ОН, водой и тщательно высушивают [222, 765]. Для увеличения термостойкости колонки и снижения ее адсорбирующей способности носитель рекомендуют обрабатывать парами диметилдихлорсилана [396, 830, 895].

В хроматографические колонки вносят твердый носитель с нанесенной на него жидкой фазой. Наполнитель уплотняют при помощи вибратора. В отдельных случаях для уплотнения применяют давление того газа, который используется в процессе анализа [631, 765], либо при заполнении выходное отверстие колонки соединяют с вакуумным насосом [93].

Разделяющая способность колонки в большой степени зависит от качества ее приготовления. Природа твердого носителя также влияет на характер разделения метиловых эфиров: так, полиэтиленгликоль-сукцинат на Целите не обеспечивает разделения эфиров линоленовой и арахиновой кислот; если ту же фазу нанести на Хромосорб W, то эфир арахиновой кислоты выходит на хроматограмме между пиками линолеата и линолената [792]. В то же время применение Хромосорба В и Целита-545, пропитанных по- <\br> ливинилацетатом, дало сходные результаты при разделении искусственной смеси метиловых эфиров жирных кислот [396]. Значительного разрушения метил-цис-9,10-эпоксиоктадеканоата на колонке с силиконовым маслом при 235° можно избежать при использовании в качестве твердого носителя Целита вместо огнеупорного кирпича С-22 [944].

Метиловые эфиры насыщенных и ненасыщенных кислот могут адсорбироваться при разделении на колонке со Стерхамолом или иными сортами кизельгура, пропитанного неполярной или полярной жидкой фазой. Так, при использовании Стерхамола 8% радиоактивности меченого метилпальмитата-1-C¹⁴ задерживается в колонке и элюируется позже основного пика. Для понижения адсорбирующей способности Стерхамол обрабатывали гексаметилдисилазаном или 2%-ным раствором лаурата Na, а кизельгур промывали соляной кислотой и раствором КОН в метаноле. После такой обработки адсорбция метилпальмитата-1-C¹⁴ снижалась до 4% [159].

ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА НЕПОЛЯРНЫХ ЖИДКИХ ФАЗАХ

В работах по газовой хроматографии метиловых эфиров высших жирных кислот раньше других жидких фаз стали применять не содержащие полярных групп высококипящие вакуумные смазки кремнийорганической или парафиновой природы — силикон ДС-550, апьезоны М и L и др. [93, 94, 228, 436, 437, 613].

Значения удерживаемого объема метиловых эфиров определяются различиями в парциальном давлении пара этих соединений, когда они растворены в жидкой фазе колонки; парциальное давление в свою очередь зависит от природы и величины сил взаимодействия между молекулами эфира и жидкой фазы. При концентрации паров органического вещества 3—5 мкг/мл и ниже между эфирами высших жирных кислот и молекулами неполярных фаз действуют исключительно дисперсионные силы Лондона, которые ослабевают при снижении молекулярного веса и разветвлении алифатической цепи [434]. Эти фазы обеспечивают полное разделение эфиров н-насыщенных кислот, различающихся по m на единицу (фактор разделения 1,56), в диапазоне m = 1—24 [1, 437]. Время удерживания сравнительно велико и для метилстеарата при 250° обычно превышает 60 мин. Эфиры кислот с разветвленной цепью выходят из колонки раньше неразветвленных эфиров с тем же числом атомов углерода [434, 540]; изоформы разветвленных кислот движутся быстрее соответствующих антеизоформ (у изоформ алифатическая цепь оканчивается изопропильной, а у антеизоформ — изобутильной группой) [272, 444, 997].

Для отделения эфиров ненасыщенных кислот перед хроматографией используют бромирование; бромированные эфиры (кроме бромидов мононенасыщенных эфиров) не летучи при температуре разделения [437]. Длину цепи ненасыщенной кислоты можно <\br> определить препаративным выделением данного эфира и последующим каталитическим гидрированием; полученный насыщенный эфир идентифицируют по величине удерживаемого объема [439]. Переэтерификации метиловых эфиров при гидрировании с катализатором Адамса можно избежать, проводя реакцию в метаноле [790]. Другие методы идентификации изложены на стр. 79.

При разделении на колонке с неполярной жидкой фазой эфиры ненасыщенных кислот располагаются на хроматограмме впереди эфиров соответствующих насыщенных кислот. Насыщенные и мононенасыщенные эфиры разделяются полностью; ди- и триненасыщенные эфиры образуют смешанный пик, который частично отделяется от пика мононенасыщенных эфиров [433]. Разделение метиллинолеата и метиллинолената не было достигнуто даже на капиллярной колонке с апьезоном L эффективностью в 200 тысяч теоретических тарелок [633]. При сокращении расстояния между карбоксильной группой и двойной связью величина удерживаемого объема Vᵣ мононенасыщенных эфиров несколько возрастает [434, 437]. На капиллярной колонке с полибутеном частично разделены изомеры метиллинолеата — эфиры 8,11-, 9,12-, 10,13- и 11,14-октадекадиеновых кислот [613]. Полиненасыщенные эфиры с сопряженными двойными связями хорошо разделялись на колонке с апьезоном L, в то время как эфиры с изолированными двойными связями совершенно не отделялись друг от друга в этих условиях [235].

Неполярные жидкие фазы с успехом применяют для разделения геометрических изомеров ненасыщенных кислот, образующихся при неполном гидрировании в промышленных условиях; при этом величина Vᵣ цис-изомеров моно-, ди- и триненасыщенных эфиров с изолированными и сопряженными двойными связями меньше, чем у соответствующих транс-изомеров [93, 434, 437, 498, 632]. На капиллярной колонке с апьезоном L геометрические изомеры метиллинолеата разделены на цис, цис-, цис, транс- и транс, цис- → транс, транс-формы; цис, цис, цис-метиллиноленат элюировался впереди транс, транс, транс-изомера. Достигнуто также разделение геометрических изомеров октадекадиеновых кислот с сопряженными двойными связями [644].

На колонке с силиконовым маслом метиловый эфир цис-9,10-эпоксиоктадекановой кислоты из уредоспор ржавчинного гриба отделяли от продукта ацетилирования — ацетоксиоктадеканоата [944]. Было описано также разделение метиловых эфиров 2-оксикислот [573].

В настоящее время неполярные жидкие фазы применяют главным образом для сравнительной идентификации жирных кислот (стр. 80), для предварительного препаративного фракционирования метиловых эфиров по числу атомов углерода и для определения цис- и транс-изомеров. При изучении состава сложных смесей жирных кислот из природных источников чаще всего используют хроматографию на полярных жидких фазах.

ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ПОЛЯРНЫХ ЖИДКИХ ФАЗАХ

Полярные жидкие фазы предложены для разделения эфиров насыщенных и ненасыщенных кислот в 1958 г. [628, 764]. Первые полярные фазы, производные адипиновой кислоты — полиэтиленгликольадипат (LAC-1-296) и полипропиленгликольадипат (Реоплекс-400) — широко применяются до сих пор. Подобные полиэфиры [—О—СО—(CH₂)ₙ—CO—О—]ₘ синтезируют поликонденсацией янтарной [223], адипиновой [434, 461] и других дикарбоновых кислот с этиленгликолем или иным многоатомным спиртом при 150—180°, обычно в присутствии катализатора (n-толуолсульфокислоты, хлористого цинка и т. д.) и в атмосфере инертного газа; продукт растворяют в спирте или ацетоне и очищают от примеси катализатора и свободных кислот ионообменной хроматографией на Амберлите IR-120 или Дуолите А-4 [222, 223, 467, 613, 771]. Для выделения более термостойкой высокомолекулярной фракции полиэфиры можно переосадить гексаном из ацетонового раствора [223]; упругость пара жидкой фазы при рабочей температуре не должна превышать 0,5 мм рт. ст. [629].

В качестве полярной жидкой фазы для аналитического и препаративного разделения используют также поливинилацетат (Винилит АYАС) с молекулярным весом 1500—23 000. В отличие от вышеупомянутых полиэфиров, образующих высокомолекулярные продукты разложения, поливинилацетат при нагревании выделяет только небольшое количество уксусной кислоты, которую после препаративного разделения легко удалить из собранных фракций; уровень фона катарометра в таких условиях не превышает 0,2 мв [397]. На колонках с поливинилацетатом происходило разложение диметилмалоната; при использовании силиконового масла распада не наблюдалось [48]. В последние годы для хроматографии метиловых эфиров применены ацилированные β-циклодекстрины, которые отличаются низким содержанием кислорода, отсутствием полярных концевых групп, однородным молекулярным весом и повышенной термостойкостью [842, 853].

Полярную жидкую фазу в количестве 5—25% наносят на твердый носитель и материал колонки стабилизируют как описано на стр. 71. В данном случае стабилизацию колонки следует проводить особенно тщательно, поскольку полиэфиры неустойчивы при высоких температурах. При недостаточной стабилизации колонки или излишне высокой температуре разделения большие количества жидкой фазы могут попасть в детектор и вывести его из строя. Унос фазы из колонки приводит к снижению эффективности разделения, а также вызывает дрейф и «шум» нулевой линии детектора. Поступающий в колонку газ-носитель следует тщательно высушивать во избежание гидролиза полиэфиров [222, 223]. Если колонка хорошо стабилизирована и правильно эксплуатируется, срок ее службы может достигать нескольких месяцев [434]. <\br> Рассмотрим теперь физико-химические основы разделения эфиров ненасыщенных жирных кислот на полиэфирных жидких фазах. Разделение этих соединений становится возможным благодаря возникновению межмолекулярного взаимодействия между их поляризуемыми двойными связями и сложноэфирными группами полярных жидких фаз. Это взаимодействие, усиливающееся с ростом числа двойных связей в алифатической цепи, избирательно замедляет движение ненасыщенных метиловых эфиров по колонке. Поэтому на хроматограмме они располагаются после соответствующих насыщенных эфиров, т. е. в порядке, обратном тому, который наблюдается при хроматографии на неполярных жидких фазах [434].

На полиэфирных колонках величина удерживаемого объема метиловых эфиров насыщенных кислот при равной температуре и одинаковом весовом содержании жидкой фазы снижается в 2—3 раза по сравнению с колонками с апьезоном L, а хроматографическое разделение соответственно ускоряется [793]. Свободная энергия сольватации СН₂-групп также снижается, и величина фактора разделения эфиров, различающихся на СН₂-группу, становится меньше, чем на неполярных колонках: 1,40 вместо 1,56 [434]. Эфиры разветвленных насыщенных кислот располагаются впереди соответствующих насыщенных эфиров с прямой цепью, как и в случае неполярных фаз [354, 671]. Геометрическая конфигурация двойных связей оказывает на величину Vᵣ значительно меньшее влияние, чем при использовании неполярных жидких фаз [434].

С увеличением числа двойных связей в цепи полярность метиловых эфиров ненасыщенных жирных кислот и их растворимость в полярных жидких фазах возрастают. По этой причине моно-, ди- и триненасыщенные эфиры выходят из колонки (в указанном порядке) вслед за насыщенными эфирами с тем же числом атомов углерода. В то же время различия в полярности полиэфиров разного состава оказывают сильное влияние на эффективность разделения.

При уменьшении числа атомов углерода в остатке дикарбоновой кислоты, связанном с полиэтиленгликолем, или при укорочении монокарбонового кислотного остатка в ацилированных β-циклодекстринах полярность полиэфира и разделяющая способность колонки возрастают; одновременно снижаются термостойкость жидкой фазы и абсолютный удерживаемый объем насыщенных метиловых эфиров [540, 853]. Метилолеат можно полностью отделить от метилстеарата на колонках с полиэтиленгликольсукцинатом и частично — на колонках с полиэтиленгликольадипатом [223, 631, 632, 765]. На колонках с сильно полярными фазами относительное удерживание ненасыщенных эфиров возрастает до такой степени, что пик триненасыщенного метилового эфира накладывается на пик насыщенного эфира, содержащего на два атома углерода больше. Так, на колонках с полиэтиленгликольсукцинатом или полиэтиленгликольпентаэритритадипатом (LAC-2-P446) соотношение удерживаемых объемов метиллинолената и метилового <\br> эфира арахиновой кислоты равно единице; с возрастанием полярности колонки при увеличении содержания жидкой фазы и рабочей температуры это соотношение больше единицы. Для разделения подобных пар метиловых эфиров обычно используют менее полярные полиэфирные фазы — полиэтиленгликольадипат, бутандиолсукцинат и диэтиленгликольсебацинат [223, 623, 631, 765].

Выдерживание полиэфирной колонки при высокой температуре в течение нескольких недель приводит к снижению полярности фазы [793]; при этом появляется возможность разделения на выдержанной колонке таких пар метиловых эфиров, которые не отделялись бы друг от друга на «свежей» колонке того же полиэфира [671].

Применение полиэфирных фаз дало наилучшие результаты при анализе метиловых эфиров жирных кислот растительного и животного происхождения, которые в разных объектах могут различаться по длине цепи от C₁ до C₃₀ и по числу двойных связей от 0 до 6 [540].

На колонках β-циклодекстрин-валерата, -бутирата, -пропионата и -ацетата разделены девять разветвленных метил-, диметил- и триметилизомеров метилгептадеканоата [653].

Ненасыщенные эфиры с одинаковым числом атомов углерода и двойных связей, различающиеся по расположению связей в цепи, плохо делятся на насадочной колонке, но могут быть разделены при использовании капиллярной колонки. Так, 8,11-, 9,12-, 10,13- и 11,14-изомеры метиллинолеата на капиллярной колонке полиэтиленгликольглутарата полностью отделялись друг от друга и от метиловых эфиров стеариновой, олеиновой и линоленовой кислот; на обычной колонке с полиэтиленгликольадипатом происходило лишь разделение 11,14-изомера и суммы 8,11- + 9,12-изомеров. При удалении двойной связи от карбоксила величина Vᵣ несколько возрастала, но метиловые эфиры олеиновой и петрозелиновой кислот на обеих колонках не могли быть разделены [613]. Метиловые эфиры линоленовой и линолевой кислот с сопряженными двойными связями хорошо отделялись от соответствующих эфиров с изолированными связями [235].

На заполненной сорбентом колонке цис, транс-изомеры ненасыщенных кислот не разделяются [498, 632]. На капиллярной колонке с полиэтиленсукцинатом удалось отделить метилолеат от метилэлаидата, у которого величина Vᵣ была меньше. Геометрические изомеры метиллинолеата разделены на транс, транс-, цис, цис- + цис, транс- и транс, цис-формы, а изомеры метиллинолената — на транс, транс, транс-, моно-транс-, ди-транс-, цис, цис, цис- + ди-транс- и моно-транс- + моно-цис- формы. Разделение геометрических изомеров метиллинолеата с сопряженными двойными связями было столь же эффективным, как и на неполярной колонке [644].

Описана хроматография метил-цис-9,10-эпоксиоктадеканоата <\br> и его производных на полиэфирной колонке [944]. На колонке с полиэфиром сукцината разделены метиловые эфиры эритро- и трео-дибромоктадекановых кислот, из которых трео-формы с большим дипольным моментом обнаруживали более высокое значение удерживаемого объема. Величина Vᵣ трео-формы в 20 раз превышала значение Vᵣ метилстеарата [894].

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Методы идентификации жирных кислот, входящих в состав сложной природной смеси, можно разбить на две основные группы: 1) идентификацию по хроматографическим данным, полученным при различных условиях в зависимости от полярности жидкой фазы, состава твердого носителя, вида детектора, температуры разделения, скорости газа и т. д.; 2) идентификацию путем сочетания хроматографических и нехроматографических методов (окислительное расщепление, галоидирование или каталитическое гидрирование двойных связей, спектрофотометрия в ИК- или УФ-свете, масс-спектрометрия и т. д.).

Величины удерживаемых объемов Vᵣ метиловых эфиров жирных кислот в значительной степени зависят от параметров разделения; в целях идентификации отдельные компоненты смеси обычно характеризуют численным значением относительного удерживаемого объема Vᵣᵒᵗʰ, которое равно отношению Vᵣ данного эфира к Vᵣ известного вещества (метилового эфира миристиновой, пальмитиновой или стеариновой кислот [765]). Величину Vᵣ измеряют от вершины пика газа, не адсорбируемого при данных условиях разделения (на практике при анализе эфиров высших жирных кислот таким газом обычно служит воздух) [422]. Наиболее простой метод хроматографической идентификации — это идентификация по величине Vᵣᵒᵗʰ; однако ввиду возможного содержания в одной хроматографической полосе двух или нескольких различных компонентов такая идентификация при анализе сложных смесей жирных кислот иногда оказывается недостаточно надежной [540]. Идентификация разветвленных и ненасыщенных кислот по величине фактора разделения описана на стр. 72.

Газохроматографическое разделение липидов, как и всякий процесс распределительной хроматографии, подчиняется правилу аддитивности [437, 690, 968]. Согласно этому правилу, прибавление новой функциональной группировки в цепи изменяет величину коэффициента распределения вещества только соответственно природе этой группировки и ее распределению в фазах хроматографической системы, но независимо от состава остальной части молекулы. Поэтому на неполярных и полярных фазах для гомологических рядов метиловых эфиров насыщенных н-жирных кислот [765], разветвленных насыщенных кислот, изо- и (+-)-антеизо-разветвленных кислот [354], мононенасыщенных кислот [354, 765], ди-, три- и полиненасыщенных кислот [434], бромированных <\br> жирных кислот [894], моно- и дикарбоновых кислот с короткой цепью [439] и других липидов [306, 595, 706] в системе координат lg Vᵣᵒᵗʰ — число атомов углерода в алифатической цепи (m) получается семейство прямых, которые в диапазоне C₈ — C₂₆ практически параллельны между собой. Для метиловых эфиров с одинаковой длиной цепи установлена линейная зависимость между lgVᵣᵒᵗʰ и числом двойных связей [765]. Функциональная зависимость для жирных кислот описывается уравнением вида lg Vᵣᵒᵗʰ = a + bm, где а и b — константы, зависящие от параметров опыта [229, 573]. При увеличении температуры разделения тангенсы углов наклона между параллельными прямыми и осью абсцисс уменьшаются [730]. Жирные кислоты, принадлежащие к известному гомологическому ряду, можно идентифицировать, используя линейную зависимость между lg Vᵣᵒᵗʰ и m.

Если гомологическая принадлежность неизвестна, то метиловый эфир идентифицируют по величине Vᵣᵒᵗʰ на колонках с неполярной и полярной жидкими фазами на основе закономерности, обнаруженной Джеймсом для н-насыщенных кислот и н-ненасыщенных кислот с изолированными двойными связями. Джеймс показал, что между отложенными на осях координат величинами lg Vᵣᵒᵗʰ метиловых эфиров данного гомологического ряда на колонках с апьезоном L, с одной стороны, и на колонках с полиэтиленгликольадипатом — с другой, существует линейная зависимость, причем насыщенные, моно-, ди-, три- и полиненасыщенные жирные кислоты образуют ряд параллельных прямых. Положение точки, в которой линия, проведенная параллельно оси абсцисс или оси ординат из найденного для данной кислоты значения lg Vᵣᵒᵗʰ, пересекается с той или иной из этих прямых, позволяет характеризовать неизвестную кислоту по числу атомов углерода и двойных связей. Точки пересечения, соответствующие эфирам с одинаковой длиной цепи, но различающимся по ненасыщенности, лежат вдоль перпендикуляра, который проведен к прямой для эфиров насыщенных кислот в точке, соответствующей метиловому эфиру насыщенной жирной кислоты с данным числом атомов углерода [434]. Аналогичные закономерности получены при разделении смеси жирных кислот на двух полиэфирных колонках различной полярности [853].

Вместо Vᵣᵒᵗʰ для идентификации жирных кислот можно использовать другую относительную величину, которая получила название «углеродного числа» [997] или «эквивалентной длины цепи» (ЭДЦ) [731]. Для нахождения ЭДЦ неидентифицированного пика хроматограммы строят эталонную прямую зависимости lg Vᵣᵒᵗʰ метиловых эфиров нормальных насыщенных жирных кислот от числа атомов углерода m для данных условий разделения, а затем по этой прямой определяют величину m, соответствующую найденному значению lg Vᵣᵒᵗʰ идентифицируемого компонента; получен- <\br> ная величина m и является ЭДЦ данного метилового эфира. При отсутствии эталонной прямой ЭДЦ можно вычислить из уравнения ЭДЦ = (s₂—s₁) lg (tₓ : tₛ₁) : lg (tₛ₂ : tₛ₁) + s₁, где s₁ и s₂ — ЭДЦ стандартных метиловых эфиров; tₓ, tₛ₁ и tₛ₂ — Vᵣᵒᵗʰ исследуемого эфира и стандартов [730]. Очевидно, что для насыщенных эфиров величины ЭДЦ на полярных и неполярных фазах совпадают и равны числу атомов углерода в алифатической цепи. Включение двойной связи или определенной функциональной группы в молекулу дает известный инкремент ЭДЦ по сравнению с ЭДЦ насыщенного эфира с той же длиной цепи, характеризующий данную связь или группу. Величины инкрементов ЭДЦ для некоторых заместителей приведены в табл. 7. С помощью ЭДЦ неизвестного компонента на колонках с неполярной и полярной жидкими фазами можно идентифицировать данный компонент и входящие в его состав функциональные группы. Величины ЭДЦ были использованы для идентификации девяти изомеров разветвленных жирных кислот с m = 17 на полярных фазах — ацилированных β-циклодекстринах [296].

Таблица 7 Величины инкрементов эквивалентной длины цепи для различных функциональных групп при газо-жидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот на неполярных и полярных жидких фазах

• На колонке с силиконовым маслом. ** На колонке с 1,4-бутандиолсукцинатом.

В последнее время разработаны методы, позволяющие определить не только число (е), но и расположение изолированных двойных связей в цепи жирных кислот по величине Vᵣᵒᵗʰ на жидких фазах, обладающих высокой полярностью [47, 49, 50]. Значение Vᵣᵒᵗʰ на полиэфирных фазах при «смещении» двойных связей из цен- <\br> трального положения к карбоксильному или метильному концу алифатической цепи возрастает. Откладывая в системе координат величины lg Vᵣᵒᵗʰ метиловых эфиров ненасыщенных кислот против числа атомов углерода (см. выше), заметили, что это возрастание носит закономерный характер. Оно происходит таким образом, что прямые между точками, полученными в системе координат и соответствующими гомологическому ряду ненасыщенных эфиров с одинаковым числом несопряженных двойных связей, будут параллельны между собой лишь при определенном условии. Параллельность будет наблюдаться только в том случае, когда при возрастании длины цепи в каждом гомологическом ряду число атомов углерода от центра двойной связи, наиболее удаленной от карбоксильной группы, до концевой метильной группы включительно остается одинаковым. Иными словами, прямые будут параллельны лишь при условии, что наращивание метиленовых групп в каждом гомологическом ряду ненасыщенных эфиров идет только с карбоксильного конца цепи [47]. Аналогичные ряды параллельных прямых получены группированием ненасыщенных жирных кислот с одинаковым числом атомов углерода между центром ближайшей к карбоксилу двойной связи и СООН-группой, а также кислот одинаковой ненасыщенности с равным числом атомов углерода, у которых двойные связи регулярно смещаются от карбоксильного конца алифатической цепи к метильному [49]. Сравнивая при помощи таких графиков найденные величины lg Vᵣᵒᵗʰ со значениями lg Vᵣᵒᵗʰ эфиров с известным расположением двойных связей, определили строение полиненасыщенных кислот китового жира [50].

При газо-жидкостной хроматографии на неполярных жидких фазах почти не происходит разделения эфиров с одинаковым числом атомов углерода и двойных связей, но с различным положением связей в цепи; на насадочных колонках с полиэфирными фазами разделение таких эфиров (например, метилолеата и метилпетрозелината) также невозможно. Для идентификации ненасыщенных кислот в подобных случаях служит окисление по двойным связям с последующим газо-хроматографическим определением получаемых продуктов.

Олеиновую, линолевую и другие жирные кислоты окисляли КМnО₄ в уксусной кислоте при ~70°, избыток перманганата разрушали метабисульфитом, а полученные ди- и монокарбоновые кислоты в виде их метиловых эфиров разделяли на колонке с апьезоном М. В продуктах окисления олеиновой кислоты обнаружили азелаиновую и пеларгоновую кислоты. Наличие многочисленных побочных продуктов окисления показывает, что в данном случае разрыв цепи ненасыщенных кислот происходил не только по двойным связям [439]. Этот же метод использовали для идентификации ненасыщенных кислот из рыбьих жиров [830]. Окисление смесью КМnO₄-KJO₄ также давало много вторичных продуктов разрушения [761]. При окислении ненасыщенных кислот надму- <\br> равьиной кислотой, гидрировании полученных ненасыщенных диоксикислот с Pd-катализатором и разрыве диоксигрупп смесью KMnO₄-KJO₄ с образованием всех возможных моно- и дикарбоновых кислот побочные продукты окисления не возникали. Жирные кислоты с тройными связями в этой системе реакций почти не подвергались разрушению [325].

Разрыв цепи ненасыщенных кислот можно осуществить при помощи окислительного или восстановительного озонолиза. В первом случае жирные кислоты озонируют в растворе хлороформа при —60° и озонид разлагают водой с одновременным окислением конечных атомов углерода до карбоксила под действием Ag₂O. Полученные кислоты превращают в метиловые эфиры и разделяют при помощи газо-жидкостной хроматографии с программированным температурным режимом [166, 908]. Окислительным озонолизом продуктов распада полиненасыщенных жирных кислот с несопряженными двойными связями можно выделить малоновую кислоту, которая образуется при отщеплении группы —CHCH₂CH—; периодатное окисление разрушает малоновую кислоту [175].

Наиболее достоверные данные для установления структуры ненасыщенных кислот получены методом восстановительного озонолиза. Образовавшиеся при низкой температуре озониды разлагают Н₂ в присутствии Pd-катализатора или путем восстановления трифенилфосфином; при этом в местах разрыва двойных связей возникают альдегидные группы. Газо-жидкостную хроматографию альдегидов и диальдегидов проводят на приборе с пламенно-ионизационным детектором, так как малоновый диальдегид плохо обнаруживается β-ионизационным детектором [799, 801, 895].

В нескольких работах для идентификации кислот после разделения использована инфракрасная спектроскопия (обнаружение транс-изомеров) [671] и масс-спектрометрия [337], а также сочетание газо-жидкостной хроматографии с другими видами хроматографии [444, 671].

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Газо-жидкостная хроматография позволяет проводить количественное определение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с гораздо большей быстротой и точностью, чем другие аналитические методы. Однако чтобы количественный анализ смеси жирных кислот стал возможным, необходимо существование прямой пропорциональности между величиной сигнала хроматографического детектора, с одной стороны, и концентрацией отдельных метиловых эфиров жирных кислот различного строения — с другой [435]. Мерой количества компонента в газовой хроматографии обычно служит площадь соответствующего пика дифференциальной хроматограммы, выраженная в процентах к сумме площадей всех пиков. Существует ряд методов измерения площа- <\br> дей пиков: 1) определение веса бумаги после вырезания пика из хроматограммы; 2) планиметрия; 3) вычисление произведения высоты пика на ширину пика на половине высоты; 4) непрерывное определение при помощи интегратора во время хроматографического анализа. Наиболее широким распространением, вследствие простоты и достаточной надежности, пользуется метод 3 [280], однако интегрирование превосходит другие методы по быстроте и высокой точности достигаемых результатов [550].

В первой работе по газо-жидкостной хроматографии Джеймс и Мартин определяли свободные жирные кислоты, используя фотометрическую кювету, содержащую раствор щелочи и кислотноосновной индикатор; изменение окраски последнего при поглощении выходящих из колонки кислот регистрировали в виде интегральной кривой при помощи записывающего колориметра. Высота каждой ступени этой кривой соответствовала молярному содержанию данной кислоты [436].

Позднее те же исследователи применили в качестве детектора весы Мартина для измерения плотности газа [437]. Весы дают показания, прямо пропорциональные массе разделяемых метиловых эфиров, и, следовательно, не требуют калибровки; однако на практике весы Мартина применяются сравнительно редко [93, 94, 422].

В настоящее время для количественного определения метиловых эфиров используют в основном три вида газохроматографических детекторов — катарометр, аргоновый (β-ионизационный) и пламенно-ионизационный.

Катарометр, измеряющий разность между теплопроводностью неорганического газа-носителя и органического вещества, впервые был использован для газохроматографического анализа метиловых эфиров высших жирных кислот раньше других детекторов, в 1953 г. [228]. Чувствительность катарометра 10⁻⁶ г. С повышением температуры разделения детектор теряет чувствительность, что вынуждает увеличивать объем пробы [793]. Для определения абсолютного количества жирных кислот в пробе применяют метод внутреннего стандарта. К определенному объему образца перед анализом прибавляют аликвотное количество метилгептадеканоата, который обычно не содержится в биологических материалах, и вычисляют соотношение площадей пиков метиловых эфиров пробы и стандарта [412, 765, 935].

В гомологическом ряду эфиров жирных кислот между логарифмами площади пика и массы эфира существует линейная зависимость [442]. Количественное определение состава жирных кислот проводили при помощи хроматографии с катарометром и одновременно стандартными нехроматографическими методами [311, 677]. Сравнение полученных данных показало, что на полиэфирных жидких фазах при измерении более летучих насыщенных компонентов катарометр давал завышенные результаты, а для эфиров с высоким значением удерживаемого объема — заниженные <\br> [223, 357, 719]. Это явление пытались объяснить более интенсивной переэтерификацией высококипящих компонентов с полиэфирами колонки при высокой температуре разделения; действительно, при снижении температуры колонки до 200° различие в результатах, полученных разными методами, значительно уменьшалось [765]. Однако позднее тот же эффект наблюдался при хроматографии на неполярной жидкой фазе (апьезоне), где возможность переэтерификации была исключена [116, 575]. Другие исследователи объясняли наблюдаемые различия неточным измерением площадей пиков при большой величине удерживаемого объема [631].

В результате подробного исследования стандартных смесей метиловых эфиров известного состава было установлено, что в гомологическом ряду жирных кислот отсутствует пропорциональность между молекулярным весом и удельной теплопроводностью. Так, если площадь пика, приходящуюся на 1 мг вещества, для метилкаприната принять за 1,00, то для метилстеарата эта величина составит только 0,84 [575]. Были предложены следующие эмпирические уравнения для внесения поправки на теплопроводность: lg A = m × lg M + lg К, где А — площадь пика, М — вес вещества, m — число атомов углерода и К — константа [887]; R = 24,68 + 5,79 m + 0,075 m², где R — относительный молярный сигнал детектора по отношению к сигналу для метилпальмитата [400]; lg y = 0,001007 х — 0,161, где y — поправочный фактор, х — относительный удерживаемый объем [260]. В работе Кауфмана обнаружена линейная зависимость между величиной калибровочного фактора (отношения весового содержания метилового эфира к площади пика) и числом атомов углерода в данном гомологическом ряду жирных кислот [550].

Все эти исследования показали, что при работе с катарометром точные количественные результаты можно получить только после тщательной калибровки детектора при помощи стандартной смеси метиловых эфиров для данных условий: величины пробы, силы тока в чувствительном элементе, скорости тока газа-носителя, температуры и природы колонки [292, 412]; после длительной работы на одной и той же колонке калибровку повторяют или же определяют по графику поправки [260]. В качестве эталона при калибровке детектора можно использовать весы Мартина [272].

В 1958 г. Лавлок предложил новый тип детектора [653], где органические вещества обнаруживаются и количественно определяются за счет их ионизации метастабильными атомами аргона. Эти атомы, возникающие при облучении проходящего через детектор аргона β-частицами стронция-90, имеют потенциал возбуждения (11,6 eV), который выше потенциала ионизации большинства органических веществ. Ионизация органических веществ приводит к усилению тока ионизации, которое регистрируется самописцем прибора. Высокая чувствительность ионизационного детектора (10⁻⁹ г) позволяет применять для разделения малые количества веществ, что значительно увеличивает эффективность <\br> разделения. Для эфиров с молекулярным весом 150 и выше площадь пика пропорциональна массе метилового эфира, поэтому детектор обычно не требует калибровки [412, 632, 654].

Линейная зависимость сигнала детектора от концентрации вещества в пробе в пределах 10⁻⁷—10⁻⁵ г была подтверждена при анализе стандартных смесей метиловых эфиров высших жирных кислот [15, 40, 498]. Относительная ошибка измерения концентрации для максимального пика не превышала 1% [412]. Для проверки линейности сигнала C₄—C₁₀-свободные жирные кислоты разделяли на колонке с апьезоном L; при увеличении весового содержания кислорода в молекулах кислот относительный сигнал ионизационного детектора снижался [116]. В другой работе отмечалось, что площади пиков низших жирных кислот пропорциональны их молярному проценту [654]. Заметное отклонение от нормы неоднократно наблюдалось при анализе образцов, содержащих метиллиноленат [968]. Так, содержание линоленовой кислоты в масле льна, по данным спектрофотометрии, в УФ-свете составляло 48,5%, а по данным газовой хроматографии с ионизационным детектором — 54,2% [499]. Причина такого поведения линоленовой кислоты остается пока нераскрытой.

Несмотря на перечисленные осложняющие обстоятельства, β-ионизационный детектор, благодаря высокой чувствительности, простоте и надежности в работе, широко используется при количественном определении метиловых эфиров высших жирных кислот.

Количественное определение с помощью пламенно-ионизационного детектора основано на определении относительной концентрации ионов в пламени путем непрерывного измерения электропроводности последнего. Этот детектор был разработан в 1958 г. [670а]. Выходящий из колонки газ-носитель (обычно азот) смешивается в определенном соотношении с водородом, и полученная газовая смесь сгорает в специальной горелке, работа которой поддерживается потоком сжатого воздуха. Находящиеся в пламени платиновые электроды, соединенные с источником напряжения постоянного тока, служат для измерения электропроводности горящего газа. Проводимость водородного пламени в воздухе невелика, однако она значительно возрастает при сгорании выходящих с газом-носителем паров органических веществ, образующих большое количество ионов. Изменение силы ионизационного тока регистрируется самописцем прибора. Наибольшая чувствительность детектирования достигается при использовании параллельной горелки, отличающейся от основной тем, что в нее не поступают пары органических соединений [394а, 670a, 689].

К преимуществам пламенно-ионизационного детектора относятся высокое соотношение сигнала и фона, стабильность нулевой линии при не слишком большом изменении температуры и концентрации паров воды, широкий диапазон линейности сигнала, а также простота конструкции и эксплуатации. Скорость газа-но- <\br> сителя сравнительно мало влияет на работу прибора, однако чувствительность, линейность и величина относительного сигнала детектора удовлетворительно воспроизводятся только при поддержании постоянного соотношения между поступающими в горелку неорганическими газами [47a, 394a, 670a]. По абсолютной чувствительности к метиловым эфирам жирных кислот (как правило, более 10 мвольт мл/мг) пламенный детектор превосходит лучшие катарометры, но обычно уступает β-ионизационному детектору. Однако меньший уровень «шума» при ионизации в пламени приводит к тому, что в практической работе оба ионизационных детектора сходны по чувствительности детектирования метиловых эфиров. Недостаток пламенно-ионизационного детектора по сравнению с другими состоит в том, что выходящие из колонки эфиры разрушаются в пламени горелки [47а, 670а].

Сигнал эфиров жирных кислот в пламенно-ионизационном детекторе обусловлен ионами, возникающими при сгорании в пламени так называемых «активных» атомов углерода, в число которых не входят атомы С карбонильных и карбоксильных групп. В то же время насыщенные эфиры с m > 20 сгорают в детекторе не полностью. Поэтому при калибровке весового определения метиловых эфиров, где сигнал для метилстеарата принимается равным 1,00, площадь пика 12 : 0 умножают на поправочный коэффициент 1,08, а для пика 20 : 0 — на 1,20 [47а, 394а]. В практической работе с природными смесями насыщенных кислот с m, равным 8—22, определение их весового процента только по площади пиков, без применения поправочных факторов, дает относительную ошибку, не превышающую ±3%. Величина сигнала для метиловых эфиров с определенной длиной алифатического радикала почти не зависит от числа двойных связей в цепи [47a, 267, 394а]. В работах по количественному определению метиловых эфиров жирных кислот с применением пламенно-ионизационного детектора были получены удовлетворительные по достоверности и точности данные [394б]. Использование этого детектора для определения эфиров гомологического ряда в условиях программирования температурного режима разделения дало лучшие результаты, чем использование детекторов другого типа [786а]. В настоящее время пламенно-ионизационный детектор в основном заменил аргоновый в качестве главного детектора при газо-жидкостной хроматографии липидов [47a].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ МЕЧЕНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ПОСРЕДСТВОМ ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Для биологических исследований с использованием меченых атомов необходимо не только качественное и количественное определение отдельных соединений, но и измерение их радиоактивности. Предложен ряд методов решения этой задачи в применении к газо-жидкостной хроматографии. Все эти методы можно разбить <\br> на две группы: 1) препаративное получение отдельных фракций и определение их радиоактивности после окончания хроматографического разделения; 2) одновременное измерение и регистрация массы и радиоактивности фракций на выходе колонки в процессе самого разделения.

Ловушками для препаративного сбора фракций служат обычно стеклянные коллекторы с градиентом охлаждения [855], змеевиковые холодильники с нанесенным на внутренние стенки стеклянным порошком [830] или специальные микропористые фильтры [333]; применяют также короткие стеклянные трубки, наполненные покрытыми силиконовым маслом кристаллами антрацена [467, 469], и трубки, содержащие смоченную толуолом вату и выдерживаемые при комнатной температуре [912]. При использовании ионизационного детектора разрушение пробы практически не происходит; это дает возможность полностью собирать метиловые эфиры, вышедшие из колонки [653]. По мере улавливания фракций ловушки меняют от руки [469, 716] или при помощи автоматического коллектора фракций [467]. Собранные метиловые эфиры вымывают раствором сцинтилляторов (2,5-дифенилоксазола и n-втор-2,5-фенилоксазолилбензола) в толуоле и просчитывают на сцинтилляционном спектрометре до достижения заданной точности. Обычно улавливается 90% радиоактивности, введенной в колонку [716]; остальная часть выходит из колонки позже вследствие поглощения, вызванного переэтерификацией метиловых эфиров с полиэфирной жидкой фазой колонки и их адсорбцией на твердом носителе [159, 771]. Это поглощение можно понизить, если перед нанесением жидкой фазы обработать носитель соляной кислотой и раствором щелочи, удалить из жидкой фазы катализатор переэтерификации (n-толуолсульфокислоту, использованную для получения полиэфира) и проводить разделение при минимально возможной температуре [159, 467, 771]. Метод сбора фракций применяется для работы с образцом, обладающим низкой удельной радиоактивностью.

Если активность отдельных метиловых эфиров превышает 1000 имп/мин, следует использовать более быстрые методы непрерывной регистрации радиоактивности [255]. Выходящие из колонки пары сгущаются в охлажденном растворе сцинтиллятора, циркулирующем с большой быстротой под действием тока газа в замкнутой системе трубок между окошками одного или двух фотоумножителей спектрометра. Радиоактивность раствора регистрируется в виде интегральной кривой, где высота отдельной ступени пропорциональна активности данного метилового эфира. Эту кривую совмещают во времени с дифференциальной кривой регистрации массы, идентифицируют пики и определяют удельную радиоактивность каждого эфира. Эффективность счета на такой установке достигает 80% для C¹⁴ и 28% для Н³ [787, 788]. Если удерживаемые объемы соседних компонентов на дифференциальной хроматограмме близки по величине (метилстеарат — метило- <\br> леат), то такие эфиры не могут быть раздельно определены на интегральной кривой радиоактивности [467].

По другому методу метиловые эфиры после выхода из колонки сжигают над СиО до СО₂ и воды, воду поглощают активированным MgClO₄ или восстанавливают до водорода, а активность C¹⁴O₂ определяют на пропорциональном или сцинтилляционном счетчике, получая дифференциальную кривую записи радиоактивности [438, 468].

РАЗДЕЛЕНИЕ ГЛИЦЕРИДОВ

Все изложенное выше показывает, что для липидов, содержащих по одной алифатической цепи в молекуле, газо-жидкостная хроматография стала сейчас стандартным методом качественного и количественного анализа; этого нельзя еще сказать о триглицеридах, хотя за последние годы эффективность их разделения и точность количественного определения их углеродного состава методом газовой хроматографии значительно возросли. В использовании этого наиболее современного аналитического и препаративного метода для исследования триглицеридов достигнуты определенные успехи. Кроме того, этот метод уже сейчас имеет большое практическое значение для высокочувствительного контроля качества пищевых и технических жиров. Он позволяет, например, обнаружить примесь растительного масла или свиного жира в сливочном масле в количестве 1—5% [596]. Уже достигнуто разделение триглицеридов с m = 6—66 и с Δm = 2, а в последнее время — с Δm = 1 [639, 640] (рис. 2).

Работы по газохроматографическому разделению триглицеридов начали появляться с 1960 г. [284, 411, 595]. До сих пор газо-жидкостная хроматография применялась для определения углеродного состава триглицеридов сливочного масла и его молекулярных дистиллятов (рис. 3) [592, 597]; свиного жира [279]; жировой ткани крысы [639]; пяти гидрированных рыбьих жиров [351]; пальмоядрового и кокосового масел; масел 17 видов растений из сем. Lauraceae, Lythraceae и Ulmaceae [641]; масел диких тропических растений Cuphea miniata, Myrica carolinensis и Virola surinamensis, богатых насыщенными кислотами с m = 8—14 [233, 350, 638]; масла какао [639]; масел рапса и других растений из сем. Cruciferae и Tropaeolaceae, богатых эруковой кислотой [351]; масел арахиса, хлопчатника, кунжута, сафлора и сои, оливкового масла, масел Acanthsyris spinescens и Hydnocarpus wightiana и других природных жиров [273, 279].

Рис. 2. Хроматограмма смеси C₄₅-, C₄₆-, C₄₇- и C₄₈-триглицеридов Условия разделения см. стр. 91 <\br> Рис. 3. Газо-жидкостные хроматограммы триглицеридов молекулярного дистиллята молочного жира, полученные в программированном температурном режиме а — исходный дистиллят; б, в — фракции триглицеридов с е = 0 и е = 1 соответственно, выделенные тонкослойной хроматографией комплексов триглицеридов с ионами Ag⁺. Цифры у пиков — число атомов углерода данной фракции

Триглицериды разделяют на колонках, содержащих 1—3% термостойких полиметилсилоксановых неполярных жидких фаз следующих марок (в порядке возрастания полярности): апьезон L, SE-30, JXR, QF-1-0065, OV-1, SE-52 и OV-17 [273, 590, 639]. С целью снижения значительных потерь триглицеридов с m > 48 при разделении колонку стабилизируют нагреванием до 350—400° в течение 6—8 час. в токе азота или гелия; о полноте стабилизации судят по времени выхода, по количеству вышедшего из колонки стандарта (тристеарина) и по эффективности разделения [279, 351, 593, 594, 640]. Однако даже длительная стабилизация не предотвращает потери жидкой фазы из колонки из-за очень высокой температуры последней. Поэтому устойчивость нулевой линии хроматограммы можно обеспечить только применением системы компенсации из двух спаренных колонок и их одновременной стабилизацией, с тем чтобы унос фазы из них был одинаков. При разделении триглицеридов с m = 30—56 на стабилизированной колонке с SE-30 ее диаметр составлял 3 мм, а длина — 35—45 см; уменьшение длины вело к снижению эффективности разделения, а увеличение — к росту потерь глицеридов в колонке [590, 592—594]. Стеклянные колонки по эффективности превышали стальные; описан способ плотного соединения стеклянных колонок с металлической испарительной камерой и детектором при 400° [639]. Вес аналитической пробы триглицеридов не превышает 1—100 мкг; применение минимальной пробы приводит к наилучшим результатам разделения [638—641]. Скорость тока газов-носи- <\br> телей (N₂ или He, обычно 100—300 мл/мин) мало влияет на точность определения, а применение гелия обеспечивает более высокую эффективность колонки [592—594, 639]. Нагретый до 250° газ-носитель поступает в испарительную камеру, которая по температуре выше колонки на 50—75°; увеличение температуры камеры с 285 до 385° не изменяет величину сигнала [279, 351, 590, 641]. Экстраполированная к атмосферному давлению температура кипения триглицеридов приближается к температуре их крекинга; однако для газохроматографического разделения триглицеридов вполне достаточна температура 200—350°. В изотермических условиях разделение природной смеси триглицеридов обычно невозможно из-за резко различной летучести крайних членов их гомологического ряда. Поэтому температуру колонки обычно программируют в диапазоне 170—350°, применяя линейный градиент

Рис. 4. Диаграмма измерений газовой хроматограммы, используемых для вычисления разделяющей способности колонки

2—3° в 1 мин. (стр. 72). В этих условиях анализ занимает не более 30—60 мин. [273, 590, 640]. Таким образом, оптимальное разделение триглицеридов достигается на стеклянных колонках 183 см × 2,5 мм, содержащих 3% полимера JXR на носителе Gas Chrom Q 100—120 меш, при скорости гелия 100 мл/мин, температуре колонки, испарительной камеры и пламенно-ионизационного детектора 170—375 (2—4° в 1 мин.), 320—350 и 300—340° соответственно и весе пробы 10—20 мкг [639].

Как уже упоминалось выше, при помощи газо-жидкостной хроматографии можно полностью разделить триглицериды с Δm = 2 [212]. Оптимальная эффективность разделения наблюдается в диапазоне m = 42—48, а при m > 48 она снижается. При анализе на высокоэффективных колонках природных жиров до m = 56, имеющих «нечетные» ацилы, достигнуто полное разделение глицеридов с Δm = 1 (см. рис. 2) [639, 640]. В обычных условиях триглицериды молочного, рыбьего и других природных жиров из-за содержания в них остатков «нечетных» и разветвленных кислот разделяют менее эффективно, чем растительные триглицериды. Это выражается в неполном возврате к нулевой линии между «четными» пиками и в их расширении [590—594]. Эффективность данной колонки в указанном оптимальном диапазоне значений m можно охарактеризовать величиной ΔC — минимальной разностью числа атомов углерода двух триглицеридов, разделяющихся с полным возвратом к нулевой линии (рис. 4): ΔC = 9,6 × (Wₕₐₙ + Wₕₐₙ) : Δt. При оптимальных условиях разделения (см. <\br> выше) ΔС = 1,6, в то время как разделение «четных» триглицеридов требует колонки с ΔС = 2, а отделение «нечетных» триглицеридов от соседних «четных» гомологов — колонки с ΔC = 1 [639].

Триглицериды с Δm = 0 обычно не отделяются друг от друга; это правило относится и к позиционным изомерам, за исключением тех, у которых разность между длиной отдельных ацилов очень велика, например 1-ПМаМа и 2-ПМаМа (Ma — остаток масляной кислоты) [248, 279, 590, 592]. Другое исключение составляют триглицериды, содержащие циклопентановое кольцо, которые задерживаются сильнее, чем их алифатические аналоги с тем же m [279, 624]. Кокосовое масло или другие растительные масла разделяются хуже, чем искусственные смеси однокислотных триглицеридов. Снижение эффективности вызвано тем, что в каждой «четной» фракции природной смеси содержится 10 и более насыщенных и ненасыщенных компонентов [590—594]. Расширения и деформации «сложных» пиков можно избежать путем применения в одной колонке смеси нескольких жидких фаз различной полярности или путем исчерпывающего гидрирования пробы [351, 640]. В обычных условиях даже частичного разделения по числу двойных связей внутри отдельных фракций с Δm = 0 не происходит, хотя после уноса большей части жидкой фазы из колонки в результате длительной стабилизации иногда наблюдается некоторая деформация хвостовой части отдельных «четных» пиков [593, 597]. В последнее время, используя колонки с упомянутыми уже смесями апьезона L, JXR и OV-17, удалось частично отделить О₃ от С₃, а также По₃ от П₃; однако практического значения для анализа природных ненасыщенных жиров эти работы пока не имеют, поскольку разделения глицеридов с разностью числа двойных связей Δе = 1 не происходило [640].

Отдельные пики хроматограммы идентифицировали при помощи стандартов или после препаративного выделения [350, 638]. В последнем случае газовый поток на выходе колонки делили, направляя 90% пробы в коллектор. При фракционировании искусственных смесей были получены достаточно однородные триглицериды, но фракции, выделенные из природных жиров, были в той или иной мере загрязнены соседними глицеридами. Загрязнение вызывалось сложностью точной синхронизации детектора и коллектора при отделении расположенных рядом острых пиков и трудностью точной регулировки температуры в соединениях между испарительной камерой, колонкой и коллектором [594, 639]. За 10—20 инъекций собирали 10—50 мг глицеридов, которые затем очищали от вынесенной из колонки жидкой фазы адсорбционной хроматографией; продукты окисления глицеридов в хроматографическом элюате отсутствовали [71, 594]. Выход более летучих фракций составлял 95% и выше, а глицериды с m > 48 сильно поглощались в колонке [594, 640]. Выделенные триглицеридные фракции подвергали дальнейшему исследованию (см. табл. 1, стр. 16). <\br> Для количественного определения триглицеридов обычно служит пламенно-ионизационный детектор. В отличие от катарометра, он достаточно чувствителен к этим соединениям, а по сравнению с аргоновым детектором значительно более устойчив к засорению жидкой фазой, уносимой из колонки [233]. При вычислении площадей пиков методом триангуляции или интегрирования обычно принимают в расчет только «четные» компоненты; минорные пики триглицеридов, содержащих «нечетные» или разветвлен-

Рис. 5. Зависимость калибровочных факторов от числа атомов углерода простых насыщенных триглицеридов Условия разделения см. стр. 91

ные кислоты, учитывают редко [640]. Расчет пиков сложного состава основан на допущении, что независимо от величины е равные концентрации глицеридов с одинаковым m дают одинаковый сигнал детектора. Правильность этого предположения была показана путем количественного определения триглицеридов до и после гидрирования природной смеси [351, 590—598]. Разделение глицеридов, особенно их высших гомологов, как правило, связано со значительной потерей вещества в колонке или в испарительной камере, поэтому для определения углеродного состава необходима тщательная и повторная калибровка детектора по каждому компоненту. Простое добавление внутреннего стандарта обычно не достигает цели, поскольку глицериды стандарта могут также задерживаться колонкой [590, 639]. В случае препаративного разделения для оценки потери сравнивают жирнокислотный состав пробы, найденный непосредственно, с вычисленным из состава кислот в отдельных глицеридных пиках [638]. Для аналитического разделения наилучшие результаты дала калибровка со смесью известных количеств 16 однокислотных «четных» триглицеридов с m = 36—54; расчет глицеридного состава вели при помощи относительных поправочных факторов f_w и f_m (рис. 5), равных соответственно отношению вес% или мол% данного глицерида в смеси к площади его пика, выраженной в % от суммарной площади пиков. Для трилаурина, который обычно не поглощается колонкой, значения f_w и f_m принимали равными единице и соответственно вычисляли относительные факторы для других глицеридов. На колонке с ΔС = 1,6 линейная зависимость между введенным количеством тристеарина и его найденным содержанием, рассчитанным путем умножения площади соответствующего пика на f_w, наблюдалась в диапазоне 2—20 мкг. Следовательно, в указанных пределах потеря тристеарина была пропорциональна весу введенной пробы. Как показывает рис. 5, глицериды до тримиристина <\br> (m = 42) включительно почти не поглощаются колонкой; с увеличением m с 42 до 56 пропорциональная поглощению величина f_w возрастает. Потеря насыщенных и ненасыщенных высших триглицеридов могла достигать 25—50%, причем для тристеарина и триэруцина эта величина составила 6 и 24% соответственно [639]. В работах лаборатории Куксиса потерю триглицеридов природных жиров характеризовали величиной возврата атомов углерода триглицеридов после газохроматографического разделения Y = Y_ex × 100/Y_t, где Y_ex — найденное число атомов С в 100 молекулах триглицеридов, Y_t — рассчитанное число атомов С в 300 молекулах жирных кислот, которые получены омылением 100 молекул триглицеридов. При расчете учитывали только «четные» жирные кислоты, причем насыщенные и ненасыщенные кислоты с одинаковым m рассматривали как одну кислоту. Если в углеродном составе кислот данного жира содержится n видов кислот с длиной цепи m₁, m₂, ..., mₙ атомов углерода и концентрацией (в мол%) M₁, M₂, ..., Mₙ, то Y_t = 3 [(M₁m₁) + (M₂m₂) + ... + (Mₙmₙ)]. Если углеродный состав глицеридов того же жира, найденный по данным их газохроматографического определения, насчитывает n' различных фракций (например, C₅₂, C₅₄ и т. д.), у которых суммарное количество атомов углерода равно m'₁, m'₂, ..., m'ₙ', а концентрация (в мол%) M'₁, M'₂, ..., M'ₙ', то Y_ex = M'₁m'₁ + M'₂m'₂ + ... + M'ₙ'm'ₙ'. Точность анализа можно также оценить сравнением рассчитанного (m_t = Y_t/300) и экспериментально найденного (m_ex = Y_ex/300) среднего числа атомов углерода жирнокислотного остатка триглицерида. Найденные и вычисленные величины для сливочного масла, кокосового масла и других растительных и животных жиров с преобладанием кислот с m = 8—14 или с m = 16—24 совпадали в пределах 96—100%. Суммирование данных анализа отдельных фракций молекулярного дистиллята молочного жира также привело к результату, в основном отвечающему углеродному составу жира до дистилляции [590, 592—598].

Для определения других категорий состава кроме углеродного состава газо-жидкостную хроматографию триглицеридов необходимо сочетать с другими методами анализа (см. табл. 1) [212, 558, 590]. Так, установление U-видового состава в 5—20 мг жира требует предварительного окисления триглицеридов по Рудлоффу (стр. 45) и этерификации диазометаном СООН-групп образовавшихся моно-, ди- и триазелаотриглицеридов. Окисление хлопкового, оливкового и соевого масел не приводило к гидролизу сложноэфирных групп при остатке глицерина. Метиловые эфиры азелаоглицеридов, имеющие меньший, чем у исходных триглицеридов, молекулярный вес, разделяли на колонке длиной 1,2 м в программированном температурном режиме. При идентификации пиков исходили из того, что по величине инкремента Vᵣ остаток азелаиновой кислоты эквивалентен лаурату. Сочетание разделения азелаоглицеридов с их препаративным выделением и липаз- <\br> ным гидролизом позволяет определить позиционно-U-видовой состав триглицеридов. Для расчета мол% азелаоглицеридов площадь каждого пика делили на m. После калибровки пламенно-ионизационного детектора с каждым азелаоглицеридом были получены точные количественные данные состава их смеси (± 0,5%). Весь анализ занимает 4 часа. Этот метод особенно применим к жирам, содержащим только жирные кислоты с m = 16 и 18, поскольку при газо-жидкостной хроматографии без предварительного окисления эти жиры обычно дают не более 2—3 главных глицеридных пиков. Разделение в виде азелаоглицеридов позволило определить внутри каждого из S₃-, S₂U- и SU₂-типов 14 растительных и животных жиров до 10 различных компонентов, отличающихся разными сочетаниями стеарата и пальмитата. Свиной жир после окисления дал 24 пика (рис. 6) [913, 915, 1010].

Газовая хроматография азелаоглицеридов не обеспечивает разделения триглицеридов с одинаковым m, но разным е [606]. Поэтому для определения углеродно-фракционного и видового состава жира требуется сочетание газо-жидкостной хроматографии природных триглицеридов (без окисления) с их предварительным разделением на адсорбенте, пропитанном AgNO₃ [248, 318]. Непосредственное определение этих категорий состава газохроматографическими методами невозможно из-за отсутствия достаточно термостойкой полярной жидкой фазы. Каждую из выделенных в тонком слое глицеридных фракций определяли количественно методом внутреннего стандарта, устанавливали ее жирнокислотный состав, а затем элюировали с адсорбента и подвергали препаративному газохроматографическому разделению [639]. В некоторых случаях полученные препараты были достаточно просты для того, чтобы позиционный состав их ацилов можно было определить липазным гидролизом [273, 594]. Однако для большинства природных жиров глицеридный состав внутри выделенных препаратов отличается сложностью. Поэтому даже в сочетании с фракционированием по величине е количественное определение этого состава не представляется возможным, так как число неизвестных величин превышает число независимых уравнений, которые можно составить из данных анализа [558]. В подобных случаях в расчет вводят допу-

Рис. 6. Газо-жидкостные хроматограммы метиловых эфиров азелаоглицеридов, полученных окислением свиного жира а — исходный жир; б—е — фракции жира с 0, 1, 2, 3 и 4 двойными связями соответственно, полученные хроматографией комплексов триглицеридов с ионами Ag⁺. Пики хроматограмм: 1 — S₃Az₃; 2 — П₂Az₂; 3 — C₂Az₂; 4 — ПСAz₂; 5 — ПС₂Az; 6 — C₃Az + П₃; 7 — П₂С; 8 — ПС₂ <\br> щения (стр. 17) [638, 639]. Так, масло Virola surinamensis разделили на 28 компонентов, ни один из которых не был отдельным глицеридным видом. Для расчета видового состава этого масла вычислили все возможные для е, m и жирнокислотного состава данного типа триглицериды, затем исключили из расчета триглицериды, содержащие минорные жирные кислоты, и, наконец, установили минимально и максимально возможные величины содержания главных триглицеридов масла [233, 350]. Для предварительного фракционирования триглицеридов применяют также кристаллизацию [212, 590].

Газо-жидкостная хроматография моно- и диглицеридов осуществляется только после перевода их в летучие производные, например ацетаты. В виде ацетатов удалось разделить моноглицериды до моноарахина и диглицериды до пальмитомиристина. При этом ацетаты 1 (3)-моно- и 1,3-диглицеридов элюировались позже, чем производные 2-моно- и 1,2 (2, 3)-диглицеридов соответственно [410]. Для определения 2- и 1(3)-моноглицеридов в их смеси последние разрушали периодатным окислением, а 2-изомеры хроматографировали в виде аллиловых эфиров жирных кислот [670]. Этот метод может найти применение при изучении специфического гидролиза триглицеридов липазой поджелудочной железы [160].

Для количественного определения продуктов липазного гидролиза триглицеридов, содержащих кислотолабильные группы в алифатической цепи, использовали также газо-жидкостную хроматографию оставшихся нерасщепленными триглицеридов и триметилсилильных (ТМС) производных моно- и диглицеридов и свободных жирных кислот. Для получения ТМС-производных к продуктам гидролиза прибавляли 20%-ный раствор бис-(триметилсилил)ацетамида в пиридине. Смесь простых ТМС-эмиров моно- и диглицеридов и сложных ТМС-эфиров жирных кислот

  CH₂OH             OSi(CH₃)₃
  |                  |
R-CO-O-CH + RCOOH + 3CH₃-C=N-Si(CH₃)₃ →
  |                  |
  CH₂OH              CH₂OH

  CH₂O-Si(CH₃)₃
  |
→ R-CO-O-CH + R-CO-O-Si(CH₃)₃ +
  |
  CH₂O-Si(CH₃)₃
+ 3CH₃-CO-NH-Si(CH₃)₃

сразу же разделяли в программированном температурном режиме. Этот метод служил для позиционного анализа глицеридов вернолиновой кислоты, содержащей цис-12,13-эпоксидную группу, диморфеколиновой кислоты, содержащей транс-10,12-диен-9-ольную группу, и α-элеостеариновой (9-цис, 11-транс, 13-транс-октадекатриеновой) кислоты; продукты распада, образующиеся при использовании других методов силилирования, здесь не обнаруживались [924]. <\br> Можно видеть, что газо-жидкостной хроматографии триглицеридов свойственны как недостатки, так и преимущества. На имеющихся в настоящее время жидких фазах невозможно разделить между собой преобладающие в природных жирах ненасыщенные триглицериды, а также триглицериды, изомерные по положению ацильных групп. Для разделения триглицеридов требуется высокая температура, что приводит к значительным потерям глицеридов в колонке. Воспроизводимость метода в целом еще недостаточна. С другой стороны, газохроматографический анализ триглицеридов отличается высокой чувствительностью, дает возможность получить достаточно достоверные количественные данные и может быть автоматизирован. При анализе природных жиров использование этого метода наиболее оправдано в случае смесей с широким диапазоном m, например сливочного или кокосового масла. В то же время нельзя сомневаться в применимости газовой хроматографии ко всем природным триглицеридам. Последовательно сочетая различные методы разделения, можно получить глицеридные фракции значительно более простого состава, чем исходный жир. На этом этапе анализа триглицериды можно разделить газохроматографически с наибольшей пользой [212, 351, 590, 606]. В будущем газовая хроматография триглицеридов, по-видимому, сможет стать прочной методической основой для создания теорий распределения ацилов в природных жирах [208].

Последние годы ознаменовались быстрым развитием газохроматографического метода в теоретическом и экспериментальном направлениях, а также широким применением этого вида хроматографии к изучению разнообразных проблем химии и биохимии липидов.

Тем не менее газохроматографическое разделение не является универсальным средством, которое позволяло бы решать любые вопросы, поставленные развитием науки перед исследователем. Этот метод, как было указано выше, имеет определенные ограничения. Однако при сочетании газо-жидкостной хроматографии с тонкослойной, распределительной и другими разновидностями хроматографии, а также с нехроматографическими методами анализа можно решить большинство проблем, возникающих при изучении химического строения и биохимических превращений липидов.

Глава 4. ДРОБНАЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

РАННИЕ РАБОТЫ ПО КРИСТАЛЛИЗАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Для исследования глицеридного состава твердых жиров дробная кристаллизация из растворителей (ацетона и др.) при низких положительных температурах использовалась еще в середине ХІХ в. Следовательно, она представляет собой самый ранний метод исследования триглицеридов, позволивший в тот период путем сотен повторных кристаллизаций выделить чистый трипальмитин и тристеарин [244, 646]. До середины 20-х годов ХХ в. многократная кристаллизация применялась почти исключительно для качественной идентификации отдельных видов триглицеридов без количественной оценки их содержания [208]. Эти работы позволили еще в 1897 г. выделить из природного источника первый смешанный триглицерид олеодистеарин и показать, что большинство глицеридов жиров и масел (всего охарактеризовали 25 триглицеридов) относится к смешанно-кислотным. Простые триглицериды, например трилаурин в масле лавра, встречались значительно реже. Сейчас кристаллизацию используют и как аналитический метод для определения типового состава природных жиров [315, 368].

При охлаждении растворов триглицеридов в безводном ацетоне и других растворителях растворимость триглицеридов снижается, и ниже температуры плавления может выпасть осадок наименее растворимых компонентов данной глицеридной смеси. При этом глицериды близкого состава легко образуют эвтектические смеси [473], поэтому эффективность разделения повышается при увеличении длительности массообмена между кристаллической и жидкой фазами вплоть до установления равновесия [208, 368, 689]. Существующие схемы разделения глицеридов методом кристаллизации основаны, с одной стороны, на данных растворимости триглицеридов, а с другой — на теории идеальных растворов, которая применима к расплавам и растворам природных жиров. Процесс кристаллизации включает два этапа: собственно кристаллизацию и отделение твердой фазы системы от жидкой. Сначала молекулы глицеридов образуют пространственную сеть в виде параллельных плоскостей, которая сохраняется в течение некоторого времени и после расплавления жира (стр. 141). В соответствии с фазовой диаграммой Гиббса, триглицериды в твердой и жидкой фазах системы различны по составу. Однако равновесия между фазами и их полного разделения достичь весьма трудно. Поэтому получаемые кристаллы обычно являются смешанными, т. е. содержат не индивидуальные триглицериды, а группы глицеридов [840]. Игольчатые кристаллы триглицеридов представляют собой <\br> моноклинные призмы. Фракционирование смеси СОО, ССЛ и ССО показало, что скорость образования кристаллического осадка зависит от содержания насыщенных ацилов в молекуле, а не от числа двойных связей. Этот вывод был подтвержден опытами с продуктами переэтерификации перечисленных глицеридов, а также с подсолнечным маслом и говяжьим жиром [819, 1009].

Вначале работы по качественной идентификации отдельных видов триглицеридов при помощи дробной кристаллизации проводились только с твердыми жирами. Жидкие ненасыщенные компоненты жира не образуют осадка при положительных температурах. Перевод жидких глицеридов в твердое состояние путем полного или частичного гидрирования или элаидирования их двойных связей позволил получить осадок этих триглицеридов [208]. При помощи гидрирования идентифицировали ряд ненасыщенных глицеридов в маслах рапса, какао и чаульмугры. По содержанию тристеарина в продуктах реакции можно было судить о концентрации три-C₁₈-триглицеридов в исходных растительных маслах; при низком уровне пальмитата в масле этот метод давал менее четкие результаты [646]. Кристаллизацией гидрированного молочного жира при 55° выделили глицеридную фракцию с m ≥ 26, обогащенную остатками масляной кислоты. Кристаллизация не сопровождается миграцией ацилов [248]. Осаждение бромированных триглицеридов высыхающих масел из ацетона или спирта позволило получить данные об их качественном составе [365, 366], а аналогичные опыты с маслом семян Sapium sebiferum дали и количественные результаты [747]. Наконец, элаидирование селеном при 220° в сочетании с кристаллизацией из ацетона использовали для изучения глицеридного состава миндального масла [368]. Сейчас все эти методы имеют только исторический интерес [368].

НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ПО ХИЛДИТЧУ

Результаты кристаллизации при положительных температурах были в основном качественными [606, 955]. Первым количественным методом кристаллизации триглицеридов, содержащих главным образом жирные кислоты с соотношением m : е, равным 18 : 1, 18 : 2, 18 : 0 и 16 : 0, стало систематическое количественное осаждение при низких температурах [332, 360], которое ранее [148] было разработано Брауном для определения жирнокислотного состава жиров. Этот метод, предложенный Хилдитчем, позволивший получить значительную часть современных данных о глицеридном составе, основан на выдерживании 5—10%-ного раствора жира в безводном ацетоне, эфире или петролейном эфире в течение 4—24 час. в твердой углекислоте при постоянном перемешивании, исключающем переохлаждение и обеспечивающем оптимальные условия теплопереноса. Возникший осадок многократно перекристаллизовывают, ступенчато повышая температуру осаждения [362, 826]. Ниже представлена схема низкотемпературной <\br> кристаллизации масла арахиса (цифры перед скобками — вес фракции в г; цифры в скобках — иодное число фракций; Е — эфир; А — ацетон; А — Е — конечные фракции).

Для фракционирования менее ненасыщенных триглицеридов предпочтительнее постепенно понижать температуру раствора, отбирая каждый раз выпавший осадок [473, 884]. Для успешного разделения глицеридов необходимо строго контролировать все условия процесса, поддерживать одинаковую концентрацию триглицеридов на всех стадиях кристаллизации и добавлять антиоксиданты в каждый раствор. Перекристаллизацию при одной и той же температуре продолжают до тех пор, пока не будет получен осадок с постоянным жирнокислотным составом. Этот состав определяют обычными методами (см. табл. 1, и, л, м) [478]. Был описан прибор для проведения систематической низкотемпературной кристаллизации; однако этот прибор не получил широкого распространения. Имеющиеся количественные данные проверяли независимым анализом исходного жира и отдельных кристаллических фракций (см. табл. 1) [67, 257, 819]. Типовой, а иногда и видовой состав триглицеридов каждого осадка вычисляли, допуская, что в данной фракции содержится только бинарная смесь двух соседних типов: S₃ + S₂U при [S] > 66%, S₂U + SU₂ при [S] = 33—66% или SU₂ + U₃ при [S] < 33% [249, 658]. <\br> Точность анализов типового состава методом кристаллизации зависит от сложности жирнокислотного состава пробы и соотношения растворимостей отдельных глицеридов в данном растворителе [819]. Независимая проверка показала, что для жиров с [S] > 30% точность может достигать ± 2%, а для жидких масел обычно получаются заниженные величины [Л₂], [Лез] и других U₃-глицеридов [658, 826, 923]. Как правило, систематическая низкотемпературная кристаллизация не приводит к получению отдельных видов триглицеридов, хотя крайние фракции могут различаться по величине иодного числа в 4—10 раз и более [258, 747, 862]; тем не менее кристаллизация как простой метод предварительного фракционирования природных жиров в мягких условиях была использована для разделения триглицеридов в нескольких десятках жиров и масел [45, 366, 562, 772]. Этот же метод был применен для промышленного фракционирования жидких растительных масел на высоконенасыщенное высыхающее техническое масло и на более насыщенное пищевое масло [257, 300, 367, 884]. Кристаллизацию использовали и для разделения гидрированных жиров [714].

Таким образом, кристаллизация по Хилдитчу представляет собой эмпирический метод полуколичественного определения типового состава триглицеридов, в котором для каждого нового жира требуется построение собственной схемы процесса, а количественный выход той или иной фракции нельзя предсказать заранее [368]. Недостаточная эффективность кристаллизации вызвана сильным растворяющим действием SU₂ и U₃ по отношению к более насыщенным типам и друг к другу [361]. Так, нерастворимые в ацетоне при 0° S₂U-глицериды выделили кристаллизацией масла какао и свиного жира, которые богаты триглицеридами этого типа. Были получены концентраты S₂O с иодным числом 31—35, которые сравнением с синтетическими образцами идентифицировали с 2-ОПС и 2-ПОС соответственно [181]. В то же время из ацетонового раствора жира с [U₃]/[SU₂] > 5, например масла арахиса ([S₂U] = 10%), осадок S₂U получить вообще не удается [317]. Именно взаиморастворяющим действием триглицеридов объясняется то, что в кристаллическом осадке обычно содержатся глицериды не двух соседних типов, как принималось первоначально, а трех или даже четырех [951]. Ошибки при количественном определении приводят к получению значений [S₃], не подтверждаемых независимыми методами, к заниженным величинам [U₃] и [S₂U] и к завышенным величинам [SU₂] [458, 474, 824]. Кроме использования не всегда убедительных предположений к недостаткам низкотемпературной кристаллизации относятся большая трудоемкость и длительность анализа, который занимает иногда несколько месяцев и требует большого количества жира и растворителей, а также низкая эффективность разделения (много ниже предсказанной из соотношения растворимостей) по сравнению с современными методами [476, 608].

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Недостатков метода Хилдитча в значительной степени лишен метод кристаллизации по Картха. Этот метод, правда, не ставит целью полный анализ типового состава, а ограничивается выделением S₃ с m кислот ≥ 16 путем их осаждения из 13—25%-ного раствора жира в ацетоне при 25°. Параллельно определяют содержание S₃ окислительным методом (стр. 157) и средний молекулярный вес составляющих S₃ жирных кислот [470, 478, 487]. Хотя полученная величина [S₃] совпадала со значением [S₃]к, вычисленным по теории Картха (К) из [S] и температуры плавления жира (см. ниже) [488, 748], позднее было показано, что этот метод нельзя считать вполне надежным, поскольку в осадке S₃ содержалась примесь S₂U-глицеридов [606, 950].

В дальнейшем Картха установил, что для определения величины [S₃] в жирах, богатых насыщенными кислотами с m = 16—18, выделение S₃ кристаллизацией не обязательно [478]. На основе теории идеальных растворов эту величину можно вычислить из температуры плавления триглицеридов (Т_тг) жира, температуры плавления полученных его омылением жирных кислот Т_жк и статистической (RD) концентрации [S₃]RD, рассчитанной из найденного значения [S] жира [758, 759]. Зависимость Т_тг от [S₃] была впервые открыта при исследовании масла какао и бараньего жира; при одинаковом уровне [S] ≈ 60% эти жиры резко различаются по величине Т_тг (30 и 50° соответственно) вследствие разного содержания S₃ (2 и 26%) [860]. Имеется корреляция между [S₃] данного жира и значением разности точек плавления ΔТ = Т_тг — Т_жк: при [S₃] ≈ [S₃]RD величина ΔТ ≈ 2°, а при [S₃] < [S₃]RD эта величина становится отрицательной [689]. Для оценки степени отклонения глицеридного состава от статистического уровня служит число Бёмера, равное сумме Т_тг + 2ΔТ. При переэтерификации жидких масел, где [S₃] < [S₃]RD, число Бёмера и Т_тг значительно повышаются: Т_тг соевого масла на 12°, хлопкового на 24°, оливкового на 10°, ненасыщенной фракции говяжьего жира — на 18° [691, 928]. Наоборот, если уровень S₃ превышает статистический, то переэтерификация приводит к снижению Т_тг (смесь О₃ и П₃, натуральный и гидрированный свиной жир, говяжий жир, гидрированное растительное масло) [147]. Было показано, что при повышении вдвое уровня S₃ кислот с m = 16—18 в ненасыщенных глицеридах величина Т_тг возрастает на 5,8°. Установление этой закономерности позволило вывести формулу [S₃]к = = (0,5 [S₃]RD) ΔT/5,8 [475, 478]. Вычисленные по этой формуле величины [S₃]к для большинства изученных жиров, кроме молочного жира, богатого кислотами с m = 4—14, совпадали со значениями [S₃], найденными по весу кристаллического осадка, состоящего из S₃ [110, 493]. Температуру плавления T_s этого осадка можно также использовать для установления величины [S₃] в триглицеридах жирных кислот с m = 16—18: если разность T_s — Т_тг пре- <\br> вышает 23,6; 26,8 и 30,0°, то уровень [S₃] в жире соответственно ниже 0,4; 0,2 и 0,1 вес% [478].

Кристаллизация смесей ненасыщенных триглицеридов в виде их координационных комплексов с ионами Ag⁺ в большей степени снимает действие взаиморастворения и повышает эффективность разделения. Осаждением 15—20%-ного раствора триглицеридов масла Jatropha multifida в смеси ацетона и 2,5%-ного раствора AgNO₃ в метаноле (3 : 7) при —10° получали фракцию S₂U, а осаждением при —70° фракцию SU₂ с примесью U₃; фракцию U₃ извлекали из надосадочной жидкости. Степень чистоты полученных фракций (рис. 7) достаточно высока [317, 321].

Значительно превосходит по эффективности обычную кристаллизацию и кристаллизация в термоградиенте, принцип которой состоит в пропускании смеси триглицеридов через наполненную сорбентом вертикальную колонку с понижающимся линейным градиентом температуры при помощи растворителей с возрастающей элюирующей способностью; в результате глицериды по мере движения непрерывно осаждаются и сразу же повторно растворяются в элюенте [672]. Для разработки теории термоградиентной кристаллизации постулировали, что для группы близких по составу триглицеридов отклонения их растворимости от идеальной приблизительно одинаковы и что, следовательно, их разделение в колонке можно предсказать на основе теории идеальных растворов. Согласно этой теории, ln (1/S) = ΔH (1/Т — 1/Т_тг)/R, где S — молярная доля глицерида; ΔН — его теплота плавления; Т — абсолютная температура; R — газовая постоянная. Если для простых триглицеридов ΔH = 3 [(m—2) a + b] и ΔH/Т_тг = 3 [(m—2) c + d], где m — число атомов углерода в одной ацильной группе, а, b, c и d — константы, то для смешанно-кислотных глицеридов с длиной одного ацила m₁ и m₂ справедливо уравнение ln (S₂/S₁) = 3 (m₁ — m₂) [(a/T) — c]/R, где S₂/S₁ — соотношение растворимостей, возрастающее прямо пропорционально m₁ — m₂ и обратно пропорциональное T. Если принять а = 1,06 ккал/моль

Рис. 7. Тонкослойная хроматограмма триглицеридов масла семян Jatropha multifida и отдельных фракций триглицеридов в виде их комплексов с ионами серебра а — маточная жидкость, содержащая U₃; б — кристаллическая фракция SU₂ (—70°); в — кристаллическая фракция S₂U (—20°) <\br> и с = 0,00269 ккал/моль, то легко показать, что при 0—10° разделяются простые глицериды с m₁ — m₂ ≥ 2 и смешанно-кислотные глицериды с m₁ — m₂ ≥ 4. Можно считать, что при S₂/S₁ ≥ 19 разделение обеспечено, если оно не ограничивается образованием эвтектических смесей, которое нельзя предсказать заранее; при m₁ — m₂ ≥ 4 и е₁ — е₂ ≥ 1 эвтектики почти не мешают. Если же эвтектическая смесь уже образовалась, то ее состав можно рассчитать по теории идеальных растворов. Так, для тройной смеси (температура плавления — Т₄) из СОС, ПОС и ПОП масла какао с температурой плавления Т₁, Т₂ и Т₃ и теплотой плавления ΔH₁, ΔH₂ и ΔH₃ соответственно [COC] + [ПОС] + [ПОП] = 1 и ln [COC] = (ΔH₁/R) (1/T₁ — 1/T₄). Аналогичные уравнения можно составить для [ПОС] и [ПОП]. Решение этих уравнений позволяет установить, что концентрации соответствующих глицеридов в эвтектической смеси с температурой плавления 33,7° составляют 11,6; 44,7 и 43,7%. В наполненной ацетоном колонке с градиентом 35—10° путем элюирования петролейным эфиром частично разделили бинарную смесь трипальмитина и трилаурина, причем последний был загрязнен 5—8% П₃, растворимость которого в ацетоне оказалась в 20—25 раз выше теоретической. При разделении ППП и ОПП или П₃ и М₃ загрязнение более растворимого компонента было еще выше. Степень разделения глицеридов какао методом термоградиента была той же, что и при повторной низкотемпературной кристаллизации [714]; отдельные фракции были обогащены S₂U и SU₂, но фракции, содержащие отдельные типы триглицеридов, выделить не удалось. Полное разделение U₃ и S₂U не происходило. Таким образом, термоградиентную кристаллизацию нельзя считать стандартным методом [458, 672].

В отдельных работах кристаллизацию применяли для определения [S₃] в жировой ткани крыс и цыплят методом изотопного разведения по уравнению [S₃] = {Wₕ [(Aₖ — Aᵤₖ) — 1] — w₀}/(W × 100), где Aₖ и Aᵤₖ — радиоактивность стандарта и осадка, Wₕ, W и w₀ — вес стандарта, пробы и глицеридов типа S₂U в осадке соответственно. Стандартом служил трипальмитин-C¹⁴ (П₃) [817]. Достоверность полученных данных была поставлена под сомнение на том основании, что П₃ мог при кристаллизации переходить в другие фракции, поскольку S₃ изученных жиров не являются чистым трипальмитином [497]. Однако обычно различия между эндо- и экзогенными S₃ по жирнокислотному составу не столь велики, чтобы существенно повлиять на точность результатов [818].

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЗИЦИОННЫХ КАТЕГОРИЙ СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ. ПОЛИМОРФИЗМ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

В этом разделе рассматриваются результаты исследований в области позиционного распределения ацилов в триглицеридах. Работы по переэтерификации впервые обнаружили нестатистический характер строения природных жиров. Затем методами полиморфизма и липазного гидролиза была установлена неэквивалентность 1,3- и 2-положений глицеридов. Наконец, в последнее время было открыто асимметрическое распределение жирных кислот в крайних положениях триглицеридов животных и растений.

Глава 5. УСТАНОВЛЕНИЕ НЕСТАТИСТИЧЕСКОГО ХАРАКТЕРА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АЦИЛОВ В ПРИРОДНЫХ ТРИГЛИЦЕРИДАХ МЕТОДОМ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ

ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Остатки жирных кислот, находящиеся в молекулах сложных эфиров, при определенных физических и химических воздействиях могут вступать в реакции ацильной миграции: отрываться от исходных молекул, перемещаться и образовывать новые сложные эфиры. Реакция сложного эфира со свободным спиртом называется алкоголизом. Один из видов алкоголиза (метанолиз) был описан ранее (стр. 68). Ниже в этой главе рассматривается другая разновидность алкоголиза — глицеролиз, состоящий в образовании больших количеств моно- и диглицеридов при взаимодействии триглицеридов с избытком глицерина. Если же происходит обмен ацилами между разными сложными эфирами, то протекающая при этом реакция называется реакцией переэтерификации. Переэтерификация может быть между двумя молекулами сложных эфиров одноатомных спиртов, между эфирами одно- и многоатомных спиртов и, наконец, между двумя сложными эфирами многоатомных спиртов, в частности между триглицеридами. В данной главе описывается в основном эта последняя разновидность переэтерификации. Как исходными, так и конечными продуктами этой реакции являются триглицериды; в зависимости от того, мигрируют ли ацилы внутри одной глицеридной молекулы или же между разными молекулами глицеридов, различают соответственно интра- и интермолекулярную переэтерификацию триглицеридов. В результате переэтерификации природных или синтетических триглицеридов между собой распределение ацилов в триглицеридах становится статистическим («random distribution», RD). Поэтому такая переэтерификация триглицеридов называется еще рандомизацией [208, 689]. <\br> Работы по рандомизации, начавшиеся в 1925 г., показали, что переэтерификация сильно изменяет точку плавления и иные свойства природных жиров и масел. Чтобы понять непосредственные причины наблюдающихся изменений, потребовалось изучение строения триглицеридов исходных жиров природного происхождения.

Поэтому реакция рандомизации является первым по времени методом исследования структурной химии природных триглицеридов. Наряду с теоретическим проблема переэтерификации имеет и крупное практическое значение. Как уже отмечалось выше, полиморфизм, температура плавления, текстура, диапазон пластичности и другие свойства жира при его рандомизации сильно изменяются. Это оказывает значительное влияние на перевариваемость жира и его пригодность для производства маргаринов, моноглицеридных эмульгаторов и различных технических продуктов с заданными свойствами [298, 517, 729, 758].

Для переэтерификации используют жир, не содержащий влаги, жирных кислот и перекисей [298]. Проведение рандомизации без катализатора требует высокой температуры (300°) [517]. Применяют щелочные катализаторы (метилат натрия, бутилат натрия), кислые (например, β-нафтилсульфокислота), а также олово и его соединения (Sn, SnCl₂ или Sn (ОН)₂). Наибольшую скорость реакции обеспечивает метилат натрия. Содержание катализатора в смеси составляет 0,005—1%, а температура процесса 100—200° (в отсутствие растворителя) или 30—60° (при рандомизации в гексане или диметилформамиде) [130, 146, 758]. Статистическую смесь триглицеридов, содержащих остатки высших жирных кислот и уксусной кислоты, можно получить переэтерификацией метиловых эфиров жирных кислот в присутствии триацетина [107]. Переэтерификация смеси масла какао с тристеарином-C¹⁴ и Н³-пальмитиновой кислотой дает смесь равномерно меченых C¹⁴- и Н³-триглицеридов [259]. При высокой температуре полной рандомизации триглицеридов получить не удается; проведение реакции в более мягких условиях приводит к получению чисто статистической глицеридной смеси [598] (число и концентрацию возможных триглицеридов этой смеси см. на стр. 152). По окончании реакции катализатор нейтрализуют, а триглицериды подвергают очистке [174]. На основе правила мультипликаторов Лагранжа можно показать, что для системы из двух жирных кислот А и В максимальная величина [A₂B]RD достигается при [А] = 2 [B]: тогда [А₂В] = 44,4%, [A₃] = 29,7%, [AB₂] = 22,2% и [В₃] = 3,7%. Эти закономерности используются в подборе концентраций жирных кислот для синтеза смеси глицеридов нужного состава [82, 689].

Как уже упоминалось, переэтерификация природных жиров приводит к значительным изменениям в свойствах, составе и строении их триглицеридов. Число Бёмера и температура плавления изменяются в зависимости от отклонения [S₃] данного жира от статистического уровня (стр. 102) [298]. Заметные изменения <\br> Рис. 8. Углеродный состав триглицеридов нативного молочного жира 1 — статистический; 2 — найденный; 12—56 — число атомов углерода в отдельных фракциях

происходят и в фазовой структуре триглицеридов. Так, в быстро застывшем расплаве натурального свиного жира, содержащего 25% 2-ПОС, образуются крупные грубые кристаллы β'-3-полиморфной формы этого глицерида (стр. 148), что препятствует использованию этого жира в кондитерском производстве. После переэтерификации благодаря снижению [2-ПОС] до статистического уровня (3,4%) и возникновению легкоплавких S₂U-глицеридов «растительного» типа, кристаллизующихся в β'-2-форме, зернистость продукта исчезает и эмульгирующая способность жира улучшается (стр. 149) [663, 689]. Изменения свойств жира

Рис. 9. Углеродный состав триглицеридов переэтерифицированного молочного жира Обозначения те же, что на рис. 8 <\br> Рис. 10. Жирнокислотный состав фракций, полученных противоточным распределением природного масла какао М — вес суммы метиловых эфиров

Рис. 11. Жирнокислотный состав фракций, полученных противоточным распределением переэтерифицированного масла какао М — то же, что на рис. 10

в нужную сторону можно также достичь путем направленной переэтерификации, при которой рандомизация жидких растительных масел типа хлопкового сочетается с низкотемпературной кристаллизацией, непрерывно удаляющей из смеси насыщенные кислоты в виде твердого осадка S₃ [82, 517].

Как правило, переэтерификация природных масел и искусственных глицеридных смесей приводит к увеличению общего числа различных триглицеридов фракционного состава. Например, в оливковом масле появляются новые глицериды ОПЛ и ОСЛ, а из бинарной смеси С₃ + О₃ возникает более сложная статистическая смесь ССС, ОСC, COC, COO, ОСО и ООО [174, 691]. Отдельные категории состава в переэтерифицированных жирах обычно близки к статистическому распределению независимо от наличия растворителя в реакционной смеси. В то же время селективно действующие физико-химические параметры реакции, например преимущественная реэтерификация жирных кислот с более длинной цепью или различия в реакционной способности 1 (3)- и 2-оксигрупп глицерина (стр. 109), могут вызывать более или менее значительные отклонения в распределении ацилов рандомизированного масла от вычисленного теоретически [298].

Такие отклонения наблюдаются, в частности, в углеродном составе триглицеридов переэтерифицированных жиров, богатых летучими кислотами, — кокосового масла и рандомизированного молочного жира, который заметно отличается от исходного жира по содержанию триглицеридов с m = 50—54 (рис. 8, 9) [119, 598]. <\br> Олефиновый состав равновесных смесей, полученных переэтерификацией C₃ + О₃ + Э₃ или смеси метиловых эфиров высших жирных кислот с триацетином, соответствует статистическому распределению [107, 200, 972, 973]. Определение фракционного состава показало, что при переэтерификации жидких масел (сафлорового и оливкового) он изменяется не столь значительно, как при рандомизации твердого масла какао (рис. 10 и 11) [259, 560, 859].

Из индивидуальных категорий глицеридного состава переэтерифицированных жиров подробно изучен типовой состав. Переэтерификация подсолнечного и хлопкового масел не изменяла соотношения ненасыщенных кислот в отдельных типах триглицеридов [1009]. Видовой состав оливкового масла, позиционно-видовой состав молочного жира, свиного жира, соевого и оливкового масла, а также стереовидовой состав соевого масла после переэтерификации соответствовали статистическому распределению [67, 146]. Уменьшение величины [S]₂ после рандомизации растительных масел можно использовать для обнаружения примеси масел, полученных переэтерификацией, в натуральном масле [707].

ГЛИЦЕРОЛИЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Для проведения глицеролиза жир выдерживают при высокой температуре в присутствии избытка глицерина и 0,1% NaOH в токе инертного газа. Окончание реакции и установление динамического равновесия миграции ацилов наступает в тот момент, когда реакционная смесь становится растворимой в двух — пяти частях метанола. Константу равновесия реакции глицеролиза Кₑ рассчитывают по содержанию глицерина, 1(3)- и 2-моноглицеридов (МГ), 1,3- и 1,2 (2,3)-диглицеридов (ДГ) и триглицеридов (ТГ) в продуктах этой реакции. Для анализа применяют адсорбционную хроматографию, периодатное окисление, а также определяют гидроксильное число, кислотное число и число омыления [119, 128, 701]. Полученные данные позволили установить один из кардинальных фактов химии триглицеридов — неравноценность их 1(3)- и 2-оксигрупп в реакциях ацилирования [230, 517, 729]. Действительно, если бы глицеролиз протекал строго статистически и вероятность этерификации первичных и вторичных гидроксилов была одинаковой, то по молярному содержанию этерифицированных (а) и неэтерифицированных (б) ОН-групп в смеси можно было бы легко вычислить статистические концентрации (RD) три-, ди- и моноглицеридов, а также свободного глицерина, равные а³ × 10⁻⁴, 3a²b × 10⁻⁴, 3ab² × 10⁻⁴ и b⁴ × 10⁻³ соответственно [124, 689]. В случае чисто статистического механизма в положении равновесия RₐOH + R₁OOCR ⇌ RₐOOCR + R₁OH, где RₐОН и R₁ОН — производные глицерина, содержащие свободную первичную и вторичную гидроксильную группу соответственно, соотношения молярных концентраций позиционных изомеров в моно- и диглицеридах составляли бы <\br> [1(3)-МГ]RD = 2 [2-МГ]RD; [1,2 (2,3)-ДГ]RD = 2 [1,3-ДГ]RD, а величина Кₑ, вычисленная по уравнениям Кₑ = [1(3)-МГ]RD/2 [2-МГ]RD = [1,2 (2,3)-ДГ]RD/2 [1,3-ДГ]RD, была бы равна единице. Однако найденные при обычных условиях глицеролиза (175—180°) равновесные концентрации составили [1 (3)-МГ] / [2-МГ] = 88 : 12 и [1,2 (2,3)-ДГ]/[1,3-ДГ] = 40 : 60, а найденная величина Kₑ = 3,0 ± 0,6. Следовательно, величина свободной энергии первичной ОН-группы глицерина в реакции этерификации ΔF = — RT ln Kₑ выше, чем у вторичной группы приблизительно на 1,2 ккал/моль [124, 125]. Данные о составе равновесной смеси глицеролиза, вычисленные при Кₑ = 3,4, удовлетворительно совпадают с найденными, а вычисленные при Кₑ = 1 — значительно от них отклоняются (табл. 8) [128]. Увеличение значения m и снижение величины е в ацильном остатке уменьшают скорость ацильной миграции, но не влияют на значение Кₑ и на соотношение компонентов в равновесной смеси [102]. Замещение одной из первичных ОН-групп не изменяет скорости этерификации другой первичной группы. При снижении температуры реакции величина Кₑ возрастает [230].

Таблица 8 Найденный и вычисленный состав равновесной смеси продуктов глицеролиза (в вес. %) [128]

Механизм переэтерификации и глицеролиза триглицеридов изучен еще мало. Возможно, что собственно переэтерификацию следует рассматривать как частный случай глицеролиза, когда под влиянием катализатора и следов свободных ОН-групп воды, служащих инициаторами реакции, в смеси непрерывно образуются и исчезают небольшие количества глицерина, моно- и диглицеридов и в конечном итоге возникает динамическое равновесие (рандомизация) жирнокислотных остатков [689]. Предполагают, что ацильная миграция осуществляется путем промежуточного образования циклического ортоэфира (I) [342]. <\br>

  CH₂-O-CO-R₁
  |
R₂-O-CO-CH
  |
  CH₂OH

⇌

  CH₂-O-CO-R₁
  |
  CH-O
  |    \
  CH₂-O

⇌

  CH₂-O-CO-R₁
  |
  CH-OH
  |
  HO-CH

⇌

  CH₂OH
  |
R₂-CO-O-CH
  |
  CH₂OH

⇌

  CH₂OH
  |
R₂-CO-O-CH
  |
  CH₂-O-CO-R₃

I

При изучении миграции ацилов моно- и диглицеридов в эфирном растворе НСІ обнаружилось, что для осуществления этой реакции требуется присутствие следов воды. При переэтерификации 2-моноглицеридов в реакционной смеси содержится эфир (II), а при переэтерификации 1(3)-моно- и 1,3-диглицеридов образуются соответствующие производные последних. Согласно одной точке зрения, в безводном растворе возникают равновесная смесь 2-моноглицеридов и эфира (II), а в присутствии воды простая эфирная связь гидролизуется с одновременной интрамолекулярной миграцией ацила и образованием 1 (3)-моноглицерида [157]. По мнению другого автора, эфир (II) представляет собой не промежуточный, а конечный продукт реакции, который синтезируется при взаимодействии моно- и диглицеридов с соответствующими хлоргидринами этих глицеридов, образующимися из них под действием НСІ [962].

ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ОПРЕДЕЛЕННОГО ПОЗИЦИОННО-ВИДОВОГО СОСТАВА

Наряду с переэтерификацией к числу ранних методов исследования жиров принадлежит идентификация отдельных видов природных триглицеридов путем их сравнения по точке плавления, полиморфизму и другим физическим свойствам с синтетическими триглицеридами известного состава и строения [181, 646]. Краткое описание химического синтеза одно-, двух- и трехкислотных триглицеридов приведено ниже. Однокислотные глицериды (ААА) можно получить прямой этерификацией избытка жирной кислоты глицерином в присутствии катализатора (n-толуолсульфокислоты). Синтез двух- и трехкислотных триглицеридов состоит из нескольких стадий с защитой тех или иных оксигрупп на отдельных его этапах [352, 729].

Для получения симметричных двухкислотных триглицеридов (АВА) 1,3-диглицериды кислоты А, выделенные кристаллизацией из раствора равновесной смеси диглицеридов (стр. 110), ацилируют хлорангидридом кислоты В в растворе CHCl₃ — C₅H₅N; миграция ацилов при синтезе не происходит [624]. Таким путем из <\br> олеоилхлорида и «статистической» смеси 1,3-диглицеридов пальмитиновой и стеариновой кислот синтезировали триглицериды, близкие по свойствам к маслу бобов какао [259].

  CH₂OC(C₆H₅)₂
  |
  HO-CH
  |
  CH₂OX

2RCOCl / пиридин →

  CH₂OC(C₆H₅)₂
  |
  ROCO-CH
  |
  CH₂OCOR

HCI / эфир →

  CH₂OCOR
  |
  HO-CH
  |
  CH₂OCOR

I II III

  CH₂OH
  |
  HO-CH
  |
  CH₂OH

ацетон / 1% HCI →

  CH₂O
  |    \
  CH-O
  |    /
  CH₂

C(CH₃)₂ →

  CH₂O
  |    \
  CH-O
  |    /
  CH₂OH

C(CH₃)₂ RCOCl / хинолин →

  CH₂O
  |    \
  CH-O
  |    /
  CH₂OCOR

C(CH₃)₂ IV V VI

  CH₂OH
  |
  HO-CH
  |
  CH₂OCOR

кислотный гидролиз / на холоду → VII

Для получения трудно кристаллизующихся ненасыщенных 1,3-диглицеридов (III, RCO — остаток полиненасыщенной кислоты А) 1 (3)-монотритиловый эфир глицерина (I, X = Н) ацилируют хлорангидридом этой кислоты. Последующее детритилирование продукта ацилирования II, которое сопровождается количественной миграцией среднего ацила в крайнее положение, приводит к образованию эфира III. При синтезе рацемических несимметричных глицеридов (ААВ) исходят из 1 (3)-моноглицеридов (VII, RCO — остаток кислоты В), полученных с применением 2,3 (1,2)-изопропилиденовой защиты (IV—VII). Моноглицериды VII ацилируют хлорангидридом кислоты А [680, 701].

Для синтеза рацемического трехкислотного триглицерида (АВС) сначала по механизму IV — VII получают 1 (3)-моноглицерид VII (RCO — остаток кислоты А). Последний тритилируют с образованием эфира (І, Х — остаток кислоты А), эфир І ацилируют хлорангидридом кислоты С в положение 2, и соединение ІІ при помощи ацильной миграции (см. выше) превращают в 1,3-диглицерид кислот А и С (III). На последней стадии синтеза вещество III ацилируют в положение 2 хлорангидридом кислоты В с образованием глицерида АВС. Если кислота С — ненасыщенная, то тритильную защиту в ІІ снимают гидрогенолизом без миграции ацила С. Возникший 1,2 (2,3)-диглицерид кислот А и С ацилируют хлорангидридом ненасыщенной кислоты В. Таким путем можно получить трехкислотный триглицерид АСВ, принадлежащий к типу SUU [368, 689]. Стереоспецифический синтез триглицеридов описан на стр. 126.

Глава 6. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА

РЕАКЦИЯ ЛИПАЗНОГО ГИДРОЛИЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Еще в 1945 г. было обнаружено, что липазный гидролиз жиров в кишечнике останавливается задолго до расщепления всех сложноэфирных связей [208, 212, 240, 258, 368]. Последующие опыты с синтетическими триглицеридами известного ПВС показали, что в диглицеридах, содержащихся в продуктах неполного гидролиза, преобладают 1,2 (2,3)-изомеры [201, 243]. О преимущественном отщеплении липазой поджелудочной железы именно крайних ацилов в триглицеридах насыщенных и ненасыщенных кислот с m = 12—18 in vivo и in vitro свидетельствует также включение C¹⁴-свободных жирных кислот (СЖК) в присутствии липазы и жира только в 1,3-положения триглицеридов, а также образование при липазном гидролизе 2-изомеров моноглицеридов, доказанное путем их изомеризации в присутствии хлорной кислоты и периодатным окислением [207, 265, 848—850]. На основе этих открытий в 1956 г. был предложен метод определения состава ацилов в 1,3- и 2-положениях триглицеридов природного жира по составу СЖК и 2-моноглицеридов, возникших при его ферментативном расщеплении [694]. Липазный гидролиз является сейчас главным методом структурного анализа триглицеридов [213, 656].

В отличие от различных эстераз, гидролизующих водорастворимые субстраты, липаза (гидролаза эфиров глицерина, КФ 3.1.1.3) обнаруживает почти абсолютную специфичность к ограниченно растворимым в воде сложным эфирам 1,3-ОН-групп глицерина [733], не расщепляя, например, в масле спорыньи (стр. 194) эстолидные связи, содержащиеся в цепи рицинолеата [740]. Липаза не обладает стереоспецифичностью гидролиза (стр. 122) [201]. В упрощенной форме липазную реакцию можно представить в виде двух этапов: триглицериды (ТГ) → 1,2 (2,3)-диглицериды (ДГ) → 2-моноглицериды (МГ). Каждый из этих этапов характеризуется собственной константой скорости k₁ и k₂; для масла Madhuca longifolia k₁ = 0,35, k₂ = 0,36, а для свиного жира k₁ = 0,31, k₂ = 0,36. Из уравнения реакции (е — основание натуральных логарифмов): [ТГ] = [ТГ]₀ × e⁻ᵏ¹ᵗ; [ДГ] = [ДГ]₀ + [ТГ]₀ × [k₁/(k₂—k₁)] × (e⁻ᵏ²ᵗ — e⁻ᵏ¹ᵗ); [МГ] = [МГ]₀ + [ТГ]₀ {1 — [1/(k₂—k₁)]} (k₂e⁻ᵏ¹ᵗ — k₁e⁻ᵏ²ᵗ), где t — продолжительность реакции, о — обозначение начальной концентрации ТГ, ДГ и МГ [209]. Перед гидролизом ферментный белок адсорбируется на поверхности триглицеридных мицелл, и потому скорость реакции зависит от степени эмульгирования субстрата в водном растворе, определяющей площадь этой поверхности, а также от соотношения между количествами фер- <\br> Рис. 12. Зависимость липазного гидролиза жира растения Madhuca latifolia от времени реакции 1, 4, 5 — концентрации, вычисленные по уравнениям на стр. 113; 2, 3 — концентрации, найденные экспериментально; 1 — триглицериды; 2 — моноглицериды; 3 — глицерин; 4 — моноглицериды + глицерин; 5 — диглицериды

мента и жира [846]. Возникшие при гидролизе жирные кислоты и моноглицериды десорбируются в водную фазу [733]. Поскольку из-за позиционной специфичности триглицериды на 1 моль глицерина отщепляют 2 моля кислот, 1,2 (2,3)-диглицериды — 1 моль, а 2-моноглицериды — ни одного, скорость реакции постепенно снижается [425]. Максимумы концентраций ди- и моноглицеридов наблюдаются после 40 и 70%-ного гидролиза соответственно (рис. 12). После 25—40%-ного гидролиза, вследствие ацильной миграции, в среде может появляться свободный глицерин (стр. 118) [209, 656]. Более подробные данные о свойствах, кинетике и механизме реакции панкреатической липазы содержатся в ряде обзоров [208, 212, 240, 243, 606].

УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА

Источником фермента обычно служит поджелудочный сок или препараты поджелудочной железы свиньи — панкреатин, стеапсин и др. [67, 213, 251, 740]. Ниже показан состав реакционной смеси (в расчете на 1 г жира) и обобщенные условия проведения липазного гидролиза, используемые различными исследователями при изучении строения триглицеридов [73, 146, 208, 251, 317, 368, 464, 656, 704, 733, 740, 907, 1007].

Разные препараты могут значительно различаться по активности гидролиза и позиционной специфичности, поэтому количество фермента подбирают так, чтобы достичь 65—70%-ного расщепления жира за минимальное время; специфичность препарата проверяют с синтетическими триглицеридами известного ПВС [73, 243, 656, 848, 1007]. Очистка фермента может повысить его активность в 135 раз и обычно включает обезжиривание препарата, экстракцию водой, адсорбцию на геле гидроокиси алюминия, осаждение сульфатом аммония, диализ и хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Однако концентрирование не увеличивает позиционной специфичности, поэтому для изучения глицеридов можно в большинстве случаев ограничиться второй стадией очистки по Денюэллю [203, 207, 240, 264]. Более важно удалить из препарата эндогенные липиды, а также устранить возможную актив- <\br> Параметр реакционной смеси и единицы измерения Численное значение

• Данные в скобках относятся к микромодификации метода липазного гидролиза.

ность неспецифических эстераз (если исследуются глицериды кислот с m > 12) и лишенной позиционной специфичности «липазы», которая составляет подчас 2—10% общей липазной активности, стимулируется таурохолеатом и тормозится двухчасовым выдерживанием при рН 9 и 40° [686, 691, 704, 907].

Очистке от возможной примеси моно- и диглицеридов подвергают также субстрат гидролиза — природные и синтетические триглицериды, а также другие компоненты смеси [85, 243]. Расщепляться липазой может только жидкий и хорошо эмульгированный субстрат [67, 201]. Гидролиз ненасыщенных глицеридов проводят в атмосфере N₂ (см. выше) [73]. До прибавления липазы смесь субстрата и эмульгатора гомогенизируют при нагревании. Выше 40° усиливаются ацильная миграция и инактивация фермента, поэтому для обеспечения гомогенности среды лучше применять быстрое механическое перемешивание [207, 240, 656]. Обычным эмульгатором служит таурохолеат Na, который, однако, активирует постороннюю липолитическую активность (см. выше) и оказывает еще не совсем понятное стимулирующее действие на саму панкреатическую липазу [212, 251]. Для эмульгирования применяют также полимеры — поливиниловый спирт, гуммиарабик и др. [213, 464]. Тем не менее все эти средства могут оказаться недостаточными для перевода твердых S₃-глицеридов, содержащих более 12 атомов углерода в каждой ацильной группе, в состояние эмульсии. В таких случаях глицериды приходится до эмульгирования смешивать с жидкими носителями липидной природы, которые не влияют на позиционную специфичность фермента к насыщенным субстратам [350, 369]. Использование смесей S₃ с триолеином (1 : 1 или 4 : 1) приводило к загрязнению реакционной смеси продуктами его гидролиза, поэтому сейчас носителями чаще служат метиловые эфиры — метилолеат, метилпентадеканоат и др. [85, 733, 907]. <\br> При гидролизе в макромасштабе, когда молярное соотношение жира (0,2—2 г) и буфера составляет около 1,5, рН среды по мере гидролиза быстро падает ниже оптимума (см. выше) [146, 251, 464, 656, 907]. Во избежание инактивации липазы необходимо поддерживать оптимум рН среды, добавляя концентрированный аммиак или 0,5—1 н. раствор NaOН по индикатору, либо с помощью самопишущего рН-стата. Последний позволяет непрерывно следить за ходом гидролиза и улавливать точку максимального содержания моноглицеридов в среде (рис. 12) [213, 251, 667, 740, 907]. При гидролизе в микромасштабе (1—50 мг жира) оптимум рН, как правило, обеспечивается имеющимся количеством буферного раствора, и добавление щелочи извне оказывается излишним [264, 656]. Ионы Са²⁺ (см. выше) не влияют на сам механизм реакции, но, связывая свободные жирные кислоты, значительно ускоряют ее и доводят гидролиз до получения моноглицеридов; в отсутствие Са²⁺ или в присутствии связывающего Са²⁺ фосфатного буфера образуются лишь диглицериды и в среде накапливаются свободные кислоты, что ведет к инактивации фермента [240, 243, 733]. Если от прибавления липазы до первого помутнения смеси, вызываемого выпадением нерастворимых солей кальция, прошло время t, то момент 2t соответствует максимуму концентрации моноглицеридов [212, 606]. Реакцию останавливают избытком НСІ (см. выше) и сумму липидов экстрагируют соответствующими растворителями [207, 464, 846, 964].

В табл. 1 (стр. 16) были приведены комбинированные методы анализа продуктов липазного гидролиза, применяемые для определения позиционных индивидуальных категорий триглицеридного состава (стр. 14, № 15, 17, 19 и 21). Эти продукты — нерасщепленные триглицериды, диглицериды, моноглицериды, свободные жирные кислоты и глицерин — обычно выделяют препаративной адсорбционной хроматографией [172, 207, 559, 781, 819]. Если используется адсорбент, пропитанный борной кислотой, то ди- и моноглицериды разделяются, кроме того, на симметричные (1,3- и 2-) и несимметричные (1,2 (2,3)- и 1 (3)-позиционные изомеры соответственно [132, 264]. Каждый класс липидов учитывают количественно (см. табл. 1, сноска а) и его жирнокислотный состав определяют газо-жидкостной хроматографией [46, 317, 319, 323]. Зная этот состав для исходного жира [А] и для одного из положений триглицеридов, можно вычислить состав другого положения по уравнению 3 [А] = 2[A]₁,₃ + [А]₂, а также вычислить величину Н — процентное содержание кислоты А в 2-положении: H = 100 [A]₂/3[A] [137, 200, 202, 243, 957, 995]. Сами продукты липазного гидролиза можно разделить газовой хроматографией в виде ТМС-производных (стр. 96) [924]. Иногда для оценки влияния ацильной миграции (стр. 117) моноглицеридную фракцию окисляют периодатом для разрушения 1-изомеров, а 2-моноглицериды выделяют повторной хроматографией [242, 638, 955, 1007]. Для точного определения строения выделенных ди- и моноглицеридов их мож- <\br> но этерифицировать ацилхлоридами жирных кислот, не свойственных данному жиру, снова обработать липазой полученные искусственные триглицериды, а затем идентифицировать продукты этого вторичного гидролиза [265, 698].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОСТОВЕРНОСТИ ДАННЫХ ФЕРМЕНТАТИВНОГО АНАЛИЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Для оценки достоверности сведений о строении природного жира, полученных по данным жирнокислотного состава продуктов его липазного гидролиза, необходимо, во-первых, выяснить, одинакова ли скорость отщепления разных видов кислот, проходит ли оно по статистическому механизму, и, во-вторых, знать, в какой степени соблюдается позиционная специфичность гидролиза и как на нее влияет возможная ацильная миграция [240, 317, 447, 698, 964]. При различной длительности гидролиза значительные изменения в жирнокислотном составе каждого из классов липидов (см. стр. 116), возникающих при липазном расщеплении триглицеридов обычных жиров и масел с [S]₂ < 10% и m насыщенных и ненасыщенных кислот = 12—18, отсутствуют. В то же время оставшиеся нерасщепленными триглицериды и объединенная фракция СЖК и 2-моноглицеридов, с одной стороны, и исходный жир — с другой (при условии низкого содержания диглицеридов в реакционной смеси) близки между собой по жирнокислотному составу. Таким образом, жирнокислотная специфичность реакции в общем выражена слабо, а сам липазный гидролиз крайних ацилов носит статистический характер [207—209, 243, 316, 369, 846].

Кислоты с длинной цепью 20 : 5 и 22 : 6 из жиров морских животных (см. стр. 200), вследствие пространственной близости их карбоксила к первой двойной связи и концевой СН₃-группе (из-за изгиба цепи), по скорости отщепления уступают обычным кислотам в 5—10 раз и потому накапливаются в ди- и триглицеридах реакционной смеси; ацилы кислоты 22 : 5, не обладающие этими особенностями пространственной структуры, гидролизуются нормально. Сейчас для частичного расщепления «морских» жиров с целью определения их строения вместо липазы используют реактив Гриньяра — метилмагнийбромид [117, 137, 1011].

Наоборот, ацилы коротких жирных кислот (m < 12), благодаря чрезвычайной легкости их миграции из среднего в крайнее положение 2-моно- и 1,2 (2,3)-диглицеридов, гидролизуются в три раза быстрее обычных кислот, что приводит к накоплению последних в моноглицеридах [592, 597, 599, 884]. Поэтому данные о составе богатых короткими ацилами жиров, например молочного жира (стр. 215), жира Cuphea llavia, масла Irvingia gabonensis (стр. 181) и других, полученные методом липазного гидролиза, нельзя считать надежными [104, 119, 120, 201, 288, 425, 445, 638]. Интенсивность миграции лауриновой кислоты, занимающей про- <\br> межуточное положение между летучими и нелетучими кислотами, еще окончательно не определена [99, 202].

Появление разветвления в цепи насыщенных ацилов тормозит их отщепление, а введение гидроксила не сказывается на скорости реакции [212]. Остатки азелаиновой кислоты в триглицеридах (стр. 45) гидролизуются, как и обычные ацилы. При гидролизе свиного жира ([S]₂ ≈ 75%, стр. 208) преимущественно отщеплялись ненасыщенные ацилы, что вызывало рост насыщенности в остаточных ди- и триглицеридах. Жирнокислотный состав 2-моноглицеридов ([S]₂) все время оставался постоянным, поэтому использование хорошо воспроизводимых величин [А]₂ и [А] для вычисления [А]₁,₃ (стр. 116), ПТС и ПВС триглицеридов более правильно,

Рис. 13. Газо-жидкостные хроматограммы жирных кислот 1,3-дистеаро-2-олеина (СОС) (а) и кислот 2-моноглицеридов, полученных липазным гидролизом СОС (б)

чем применявшийся ранее расчет значений [А]₁ из менее достоверных данных состава СЖК [212, 251, 265, 289, 656]. О влиянии цис, транс-изомерии ненасыщенных ацилов на скорость гидролиза мнения разных авторов расходятся [606, 655].

Гидролиз синтетических и природных триглицеридов в микромасштабе in vitro в течение 1—2 мин. (см. выше), а также в кишечнике полностью соответствует уравнению реакции [209, 213, 242, 846]. Однако при более длительном ферментативном омылении даже тщательно очищенных триглицеридов симметричная структура моноглицеридов редко сохраняется полностью (рис. 13). Во фракции последних обычно содержится 10—30% и более 1 (3)-изомеров, возникающих путем ацильной миграции в водной среде при рН 8 и легко образующих свободный глицерин (до 30—40% в конце гидролиза) [201, 203, 369]. Изомеризацию можно частично устранить добавлением свободных жирных кислот или применением микробных липаз с кислым оптимумом рН (см. стр. 120) [212, 241, 848]. Поскольку миграция ацилов термодинамически направлена в сторону 1,3-положения и по скорости уступает их отщеплению, можно считать, что 2-моноглицериды свободны от ацилов, исходно содержащихся в крайних положениях триглицеридов, и по жирнокислотному составу достоверно отвечают 2-положению последних.

Позиционная специфичность липазы сама по себе практически абсолютна [243, 655, 733]. Так, при гидролизе продуктов ацилирования 1 (3)- и 2-моноглицеридов (стр. 117) исходная кислота отщеплялась на 98% и 2—10% соответственно, а жирнокислотный <\br> Таблица 9 Гидролиз 1,3-дипальмитата 2-(9,10-Н³)-олеата sn-глицерина панкреатической липазой (в мол. %) [264]

| Время гидролиза, мин. | СЖК в продуктах гидролиза | Распределение Н³ (%), в | 1,3-ПО, моли на 100 молей 1,2-ПО | Все 1-МГ | 1-МО | 1-МП | | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | | | | ТГ | ДГ | МГ | СЖК | | моли на 100 молей 2-МГ | | 19 | 31 | 26 | 34 | 37 | 3 | 2 | 23 | 20 | 3 | | 22 | 50 | 17 | 27 | 52 | 4 | 3 | 23 | 20 | 3 | | 30 | 60 | 6 | 15 | 74 | 5 | 4 | 38 | 35 | 3 | | 45 | 60 | 11 | 15 | 66 | 8 | 6 | 43 | 38 | 5 |

состав продуктов ферментативного омыления соответствующих производных 1,2 (2,3) и 1,3-диглицеридов отличался от теоретического не более чем на 5%. Аналогичные результаты дали опыты гидролиза 2-олео-1,3-бензилиденглицерина и 2-олео-1,3-гексадецилового эфира глицерина, в которых была исключена миграция остатка олеиновой кислоты из 2-положения, а неспецифическая липаза тормозилась (стр. 115) [698, 704]. Для количественной оценки ацильной миграции 1,3-дипальмитат 2-(9,10-Н³)-олеат sn-глицерина (ПОТП) расщепляли при постоянном рН8 (табл. 9). Возможные превращения ПОТП при изомеризации и неспецифическом гидролизе показаны на рис. 14. Единственной причиной нарушений жирнокислотного состава продуктов реакции по сравнению с теоретическим является изомеризация 1,2 (2,3)-диглицеридов и особенно 2-моноглицеридов, которая усиливается по мере инкубации. Уровень 1-монопальмитина и свободной олеиновой кислоты не превышает 3—5%. Радиоактивность три-, ди- и моноглицеридов (в имп/мин/мкмоль), полученных из ПОТП с липазой плесени Rhizopus arrhizus, составляет 60, 59,9 и 55,5 соответственно, что указывает на слабую миграцию О* из 2-положения [264].

Рис. 14. Возможные превращения ПОП при липазном гидролизе I — нормальный гидролиз 1,3-ацилов; II — ненормальный гидролиз 2-ацилов; III — спонтанная ацильная миграция <\br> Вначале панкреатическую липазу применяли для гидролиза или синтетических триглицеридов или нефракционированных природных жиров со сложным многокомпонентным составом триглицеридов [207, 213, 243, 849]. Результаты таких анализов выражали в виде процентного состава жирных кислот в среднем и крайних положениях, а также использовали для расчета величины Н (стр. 116), фактора обогащения и фактора селективности (стр. 176) отдельных видов кислот и для вычисления ПТС, ПВС и других категорий триглицеридного состава по уравнениям позиционно-статистического распределения (стр. 168) [99, 655, 698, 1007]. Если для данной кислоты Н ≈ 33%, то налицо чисто статистическое распределение ее ацилов (стр. 150) [202, 369, 884]. Однако такое распределение встречается редко [907]. Строение большинства животных (стр. 198) и растительных триглицеридов (стр. 179) значительно отклоняется от статистического [240, 242, 258]. Различия в составе между 1,3- и 2-положениями глицеридов послужили основой гипотезы о двух ферментах их биосинтеза, имеющих разную жирнокислотную и разную позиционную специфичность [368, 848, 964]. Сейчас показано, что значительно более точных результатов можно достичь сочетанием липазного гидролиза в микромасштабе с предварительным фракционированием природных жиров современными комбинированными методами (см. табл. 1) [208, 212, 606, 638, 656, 667].

Как уже отмечалось, гидролиз панкреатической липазой представляет собой наиболее удобный и разработанный метод определения позиционных категорий состава триглицеридов [201, 208, 213, 656, 686]. К недостаткам этого метода следует отнести не всегда удовлетворительную воспроизводимость действия разных препаратов фермента, содержащих те или иные примеси, возможность миграции ацилов и реэтерификации свободных жирных кислот под влиянием ацилтрансферазной активности липазы при длительной инкубации без Са²⁺ и, наконец, отсутствие стереоспецифичности гидролиза [212, 477, 478, 482, 606].

ПРИМЕНЕНИЕ ДРУГИХ ЛИПАЗ ДЛЯ АНАЛИЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Кроме панкреатической липазы свиньи в позиционном анализе триглицеридов иногда применяются соответствующие ферменты других млекопитающих, а также трески, ската и омара, имеющие ту же позиционную специфичность [132, 138, 145, 201, 240]. Липазы молока и культуральной жидкости гриба Pseudomonas fragi также специфичны к 1,3-положениям; благодаря их «кислому» оптимуму рН 5—6 миграция ацилов при гидролизе выражена слабее, чем у панкреатических липаз [208, 243, 287, 445]. Липаза семян Vernonia anthelmintica атакует 2-положение, давая 1,3-диглицериды, а фермент гриба Geotrichum candidum специфичен (правда, не абсолютно) к цис-9-ненасыщенным ацилам, особенно <\br> к остатку олеиновой кислоты, независимо от их положения (стр. 135); элаидиновая кислота почти не отщепляется этой липазой, что указывает на высокую стереоизбирательность образования фермент-субстратного комплекса [58, 314, 447]. Липазы клещевины и Streptococcus aureus не обладают ни позиционной, ни жирнокислотной специфичностью и потому не используются в глицеридном анализе [606, 655]. Прежние гипотезы о «синтетической» роли растительных липаз в образовании триглицеридов (стр. 226) теперь не имеют значения [212].

ПОЗИЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

К неферментативным методам качественного позиционного анализа глицеридов, пригодным пока лишь для отдельных видов триглицеридов, а не сложных природных смесей, относятся ранний метод определения полиморфных форм (стр. 136) — длительный и требующий много материала, и примененный недавно масс-спектрометрический метод (рис. 15). При введении синтетического 1-миристата 2-стеарата 3-пальмитата sn-глицерина (I) в ионизационную камеру масс-спектрометра MS-9 путем прямого испарения при 170—200° наиболее характерными были следующие пики: 1) молекулярный пик І (Р); а) пики 523, 551 и 579 за счет отрыва от (I) ацилокси-(RCOO-) групп стеарата, пальмитата и миристата соответственно; 3) пики ионов этих ацилов (RCO) 267, 239 и 211; 4) пики 509, 537 и 565 (на 14 единиц меньше, чем пики 523, 551 и 579) за счет отрыва СН₂-групп остатка глицерина вместе с RCOO-группой соответствующих ацилов. Для стеарата, расположенного в 2-положении (I), интенсивность пика 509 втрое ниже, чем для пальмитата и миристата. Синтетические 2-ОСС и 1-ОСС дали разные масс-спектры. При помощи этого метода определили строение оптически активного триглицерида из масла S. sebiferum

Рис. 15. Массовый спектр 1-миристо-2-стеаро-3-пальмитина <\br> (стр. 192). Масс-спектрометрия применима для анализа ПВС видов триглицеридов нормального строения вплоть до молекулярного веса 1058, причем скорость и чувствительность определения здесь выше, чем при гидролизе липазой [83, 212].

Глава 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ КОНФИГУРАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ СТЕРЕОИЗОМЕРИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Абсолютная конфигурация большинства асимметрических природных соединений давно установлена. Показано, что аминокислоты, углеводы, терпены, алкалоиды и т. д., как правило, представляют собой энантиомеры, а рацемические смеси встречаются крайне редко [368, 856]. Изучение строения триглицеридов до последнего времени ограничивалось суммарным определением жирнокислотного состава в крайних положениях, поскольку панкреатическая липаза не различает эти ацилы при гидролизе [144]. Стереоспецифичность триглицеридов, в отличие от их ПВС, исследована еще мало из-за трудности препаративного выделения их отдельных видов, из-за того, что методы синтеза стереоизомерных триглицеридов, необходимых для изучения этой проблемы, разработаны сравнительно недавно, а также потому, что в стереоизомерах триглицеридов современными методами обычно не удается обнаружить оптическую активность [856].

Оптическую активность можно ожидать у асимметрических триглицеридов позиционного вида АВС при А ≠ В и А = В [212]. Исследованиями последних лет в природных жирах открыто много глицеридов асимметрического строения [368, 738]. Если такие глицериды являются рацемической смесью равных концентраций энантиоморфов, то они не будут обладать оптической активностью. Если же один из антиподов этой смеси полностью или частично отсутствует, то обнаружение асимметрического атома углерода в 2-положении тем или иным химическим или физическим методом в принципе возможно [642]. Решение проблемы эквивалентности или неэквивалентности ацильного состава в положениях 1 и 3 асимметрических триглицеридов имеет важное значение для полной характеристики состава, строения и абсолютной конфигурации природного жира. В частности, оно важно для оценки современных теорий распределения ацилов в триглицеридах, поскольку большинство этих теорий, основанных на данных липазного гидролиза, исходит из предположения о статистическом распределении ацилов в крайних положениях (стр. 167). В то же время эта проблема представляет большой интерес и сама по себе [131, 642, 739, 856].

ОБОЗНАЧЕНИЕ СТЕРЕОИЗОМЕРОВ ПРОИЗВОДНЫХ ГЛИЦЕРИНА В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ НОМЕНКЛАТУРЫ АБСОЛЮТНОЙ КОНФИГУРАЦИИ

Поскольку молекула глицерина, не обладающая оптической активностью, обычно рассматривается как симметричная, возникает вопрос о том, как различить между собой первый и третий атомы углерода этого соединения, которые могут дифференцироваться в ходе реакций липидного обмена. При рассмотрении Фишеровской проекционной формулы глицерина (Iа) можно заметить, что эта молекула имеет плоскость симметрии, рассекающую центральный атом С по линии ОН — Н, причем образующиеся половины не идентичны друг другу, так как они не могут быть наложены друг на друга. Следовательно, глицерин имеет мезостроение, а его центральный атом С можно обозначить как мезоатом. Обладая мезостроением, глицерин должен быть лишен вращательной симметрии: действительно, вращая молекулу (Iа) на 180° вокруг оси, перпендикулярной к плоскости листа, мы получаем формулу (Iб), которую нельзя совместить с (Iа). Вращательная асимметрия глицерина показана ниже: Iа — L-глицерин, Iб — D-глицерин. Темными треугольниками обозначены связи, направленные к читателю, пунктиром — связи, направленные от читателя).

  CH₂OH
  |
HO-C-H
  |
  CH₂OH

Iа

  CH₂OH
  |
H-C-OH
  |
  CH₂OH

Iб

Наличие мезостроения и отсутствие вращательной симметрии позволяют предположить, что в ходе обменных реакций с асимметрическими реагентами (все биологические реакции относятся именно к таким реакциям) судьба каждой карбинольной группы СН₂ОН будет разной и что эти группы можно будет различить между собой. Действительно, биосинтетическое замещение той или иной первичной ОН-группы фосфатом, спиртовым радикалом, ацильной группой и другими дает глицерофосфат, батиловый спирт, 1-моноглицерид и т. д., обладающие оптической активностью. Поэтому точная номенклатура атомов С глицерина имеет важное значение для исследования строения и биосинтеза жиров. Сейчас существуют четыре главные системы такой номенклатуры [52].

До последнего времени для обозначения абсолютной конфигурации оптически активных производных глицерина пользовались системой Бера и Фишера [768]. В этой системе принадлежность данного производного к D- или L-ряду определяется тем, в какой из двух стереоизомеров глицеринового альдегида (D- или L-) его <\br> можно превратить при помощи наименьшего числа реакций. В частности, для несимметричных моно- и диглицеридов одной из стадий такого превращения служит окисление свободной первичной карбинольной группы до альдегидной группы без изменения положения заместителей. Неацилированная, замещенная фосфатом, содержащая радиоактивную метку и т. д. карбинольная группа всегда обозначается греческой буквой α, а вторичная HCOR₂-группа — буквой β. Для структурных и биохимических целей эта система неудобна, поскольку остается неясным, обозначает ли α 1- или 3-положение. Номенклатура Бера и Фишера была видоизменена в так называемой «общепринятой D/L системе» («conventional D/L system» [52]). В этой системе также используются приставки D и L; однако, в отличие от предыдущей, положение заместителей обозначается цифрами 1, 2 и 3, причем номером 1 обозначают ацилированную карбинольную группу. Данная система также не лишена недостатков. Например, продукт фосфорилирования L-1,2-диацилглицерина (фосфатидную кислоту) по этой номенклатуре можно назвать или L-1,2-диацилглицеро-3-фосфатом, или D-2,3-диацилглицеро-1-фосфатом. Поэтому сейчас эта система заменяется другими [52, 129, 377].

Более совершенная (R)/(S) система номенклатуры абсолютной конфигурации, основанная на последовательности расположения функциональных групп определенного ранга вокруг центра асимметрии, была предложена Каном, Ингольдом и Прелогом [464а]. Ранг данной группы по отношению к другим определяется ее положением в условной иерархии, например, ОН > СООН > кетон > альдегид > карбинол > CH₃ > Н [377, 464а]. Согласно (R)/(S) номенклатуре, в триглицеридах ацилы с более длинной цепью выше по рангу, чем ацилы с короткой цепью, ненасыщенные имеют приоритет перед насыщенными, разветвленные — перед нормальными, цис- — перед транс- и т. д. В молекуле триглицерида последовательность всегда начинается с группы OR₁, при мезоатоме С, которая содержит кислород и имеет наивысший ранг, и заканчивается атомом водорода при том же атоме С как заместителем наименьшего ранга. Если заместители в порядке убывания их ранга расположены в плоскости над асимметрическим атомом С, который рассматривается со стороны, противоположной заместителю наименьшего ранга (в случае триглицеридов — среднему атому Н) по часовой стрелке, то данный триглицерид принадлежит к правой или (R) конфигурации, а если против часовой стрелки — то к левой или (S) конфигурации.

Наглядной моделью мезоатома углерода с четырьмя разными заместителями, помогающей установить стереоконфигурацию данного асимметрического триглицерида согласно (R)/(S) номенклатуре, может служить схематическое изображение рулевого управления автомобиля (рис. 16). В нижней части рис. 16 помещены Фишеровские проекционные формулы двух взятых для примера асимметрических триглицеридов — оптических антиподов α-лау- <\br> родипальмитина (І и ІІ); направление связей между мезоатомом С и заместителями изображено так же, как указано выше. Рассматривая последовательность расположения содержащих ацильные группы заместителей вокруг центра асимметрии (см. верхнюю часть рис. 16), можно заметить, что для (I) заместители в порядке убывания их ранга размещаются против, а для (ІІ) — по часовой стрелке. Следовательно, (I) имеет (S), а (II) — (R) конфигурацию. Согласно (R)/(S) системе,

Рис. 16. Абсолютная конфигурация стереоизомерных α-лауродипальмитинов по (R)/(S)-номенклатуре I — (S)-1-лауродипальмитин; II — (R)-1-лауродипальмитин

та из карбинольных групп триглицерида, атом водорода которой замещен ацилом более низкого ранга (в данном случае — остатком лауриновой кислоты), обозначается номером 1. Поэтому (I) в (R)/(S) системе следует обозначить как (S)-1-лауродипальмитин, а (ІІ) — как (R)-1-лауродипальмитин [464а, 856].

Преимуществами (R)/(S) системы являются ее универсальность и отсутствие какой-либо двусмысленности при обозначении. Однако в применении к производным глицерина она имеет то неудобство, что большинство их реакций, состоящих в образовании или расщеплении сложноэфирных связей и не затрагивающих ни одной из четырех связей С-2 атома глицерина, приводят в (R)/(S) системе к частым переменам обозначающих конфигурацию префиксов (R) и (S). Например, продукт фосфорилирования (S)-1,2-диацилглицерина обозначается в (R)/(S) системе как (R) фосфатидная кислота [52].

Дальнейшим развитием (R)/(S) системы в применении к пространственной конфигурации глицерина и его производных явилась предложенная Хиршманом система стереоспецифической нумерации с фиксированным положением заместителей (sn-система), которая пользуется сейчас наибольшим распространением для обозначения стереоспецифичности триглицеридов и других глицеролипидов [377]. Было условлено, что атомы углерода в проекционной формуле глицерина (Iа), в которой заместитель высшего ранга (гидроксил мезоатома углерода) всегда обращен влево, а атом водорода — вправо, нумеруются так же, как атомы углерода в L-глицериновом альдегиде, т. е. сверху вниз: 2 — 1 — 3. Таким образом, каждая первичная карбинольная группа глицерина получает в sn-системе определенный номер, и ей не может присваиваться то <\br> номер 1, то 3. Триглицерид обозначается здесь как 1,2,3-триацил-sn-глицерин, а D- и L-α,β-диглицериды по Беру и Фишеру — как 1,2-диацил- и 2,3-диацил-sn-глицерины соответственно [52, 377]. Если имеется равновесная смесь обоих антиподов, то в sn-системе она обозначается приставкой rac-, например, rac-1-олеодипальмитоглицерин, а если конфигурация неизвестна — то приставкой Х, например, Х-1-пальмитодиолеоглицерин. В настоящее время sn-система рекомендована ко всеобщему применению Комиссией по биохимической номенклатуре Международного союза по теоретической и прикладной химии для обозначения абсолютной конфигурации липидов [52].

СТЕРЕОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Вследствие трудности выделения энантиоморфных триглицеридов из природных жиров были разработаны методы стереоспецифического синтеза триглицеридов, с тем чтобы синтетические антиподы можно было сравнивать с природными [689, 738]. Ранние методы синтеза были основаны на разделении рацемических промежуточных продуктов на оптические антиподы, которые затем превращали в триглицериды без рацемизации. В современных исследованиях синтез начинают с оптически активного природного соединения. В работах по первому принципу стереоспецифическими разделяющими агентами служили D-винная кислота, сахарная кислота или стрихнин [689]. Сейчас для получения антиподов исходят из D- или L-маннита.

  CH₂OH
  |
  HO-C-H
  |
  HO-C-H
  |
  H-C-OH
  |
  H-C-OH
  |
  CH₂OH

ацетон / ZnCl₂ →

  CH₂
  |   \
  O-CH
  |   /
  O-C-H
  |
  H-C-OH
  |
  H-C-O
  |     \
  H-C-O
  |     /
  CH₂

C(CH₃)₂ C(CH₃)₂ Pb(OAC)₄ → I II

  HC=O
  |
  HC-O
  |    \
  HC-O
  |    /
  CH₂

C(CH₃)₂ Ni / H₂ →

  H₂C-OH
  |
  HC-O
  |    \
  HC-O
  |    /
  CH₂

C(CH₃)₂ RCOCl / пиридин → III IV

  H₂C-OOCR
  |
  HC-O
  |    \
  HC-O
  |    /
  CH₂

C(CH₃)₂ кислый гидролиз →

  CH₂OH
  |
  HO-CH
  |
  H₂C-OOCR

V VI

По методу Фишера и Бера 1,2,5,6-диизопропилиден-D-маннит (II), полученный из D-маннита (I) обработкой ацетоном в присутствии хлористого цинка, окислительным расщеплением тетраацетатом свинца по 3,4-гидроксильным группам превращают в две молекулы изопропилиден-D-глицеринового альдегида (ІІІ), восстанавливают (III) до D-(+)-изопропилиденглицерина (IV), этерифицируют (IV) в 1-положение хлористым ацилом и, удалив остаток ацетона в (V) кислотным гидролизом, получают 3-ацил-sn-глицерин (VI). Аналогично из L-маннита синтезируют 1-ацил-sn-глицерин [689]. Стереоизомерные моноглицериды превращают в триглицериды (стр. 112).

Для примера показан ход синтеза 1-лауро-2,3-дипальмито-sn-глицерина (или (—)-(S)-1-лауродипальмитина, I) и 1,2-дипальмито-3-лауро-sn-глицерина (или (+)-(R)-1-лауродипальмитина, II).

  H₂C-OH
  |
  HC-O
  |    \
  H₂C-O
  |    /

C(CH₃)₂ (+)-Изопропилиденглицерин

  H₂C-O-Ла
  |
  HC-O
  |    \
  H₂C-O
  |    /

C(CH₃)₂ →

  H₂C-O-Ла
  |
  HC-OH
  |
  H₂C-OH

→

  H₂C-O-Ла
  |
  HC-O-П
  |
  H₂C-O-П

I

  H₂C-O-П
  |
  HC-O
  |    \
  H₂C-O
  |    /

C(CH₃)₂ →

  H₂C-O-П
  |
  HC-OH
  |
  H₂C-OH

→

  H₂C-O-П
  |
  HC-O-П
  |
  H₂C-O-Ла

II <\br> В дальнейшем физическими методами было доказано, что полученные триглицериды действительно являются оптическими антиподами [856]. При стереоспецифическом синтезе sn-1,2-дипальмито-3-сорбина свободную ОН-группу в (IV) защищали бензильным радикалом, снимали изопропилиденовую защиту, ацилировали свободные ОН-группы пальмитилхлоридом, удаляли бензильную группу и вводили остаток сорбиновой кислоты в положение 3. Полученный триглицерид сравнивали с природными глицеридами из масла Sapium sebiferum [738]. Для хроматографического разделения и измерения оптического вращения в условиях, исключающих ацильную миграцию, sn-1,2- и -2,3-диглицериды, выделенные липазным гидролизом асимметрических триглицеридов, ацилировали сорбилхлоридом или превращали в ТМС-производные; параллельно получали соответствующие синтетические аналоги [738, 739]. Вместо синтетических энантиоморфных моноглицеридов для синтеза триглицеридов можно использовать 1,2-диацил-sn-глицерины, полученные из природного лецитина действием фосфолипазы С [129, 926].

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АБСОЛЮТНОЙ КОНФИГУРАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Первым физическим методом, использованным для анализа абсолютной конфигурации триглицеридов, была поляриметрия, поскольку многие природные и синтетические производные глицерина — глицерофосфат, батиловый спирт, тритилдиглицериды, моно- и диглицериды — обладают заметным оптическим вращением [368, 689, 739, 856]. Однако у природных и синтетических энантиоморфных триглицеридов алифатических кислот в подавляющем большинстве случаев пока не удалось обнаружить оптическую активность [738, 739, 856]. Исключение составляют те асимметрические глицериды, у которых один или два гидроксила замещены остатками ароматической кислоты или жирной кислоты с короткой цепью, причем (S)-формы этих триглицеридов являются лево-, а (R)-формы — правовращающими [856]. Оптическая активность, вызванная асимметрией в остатке глицерина, обнаружена в sn-1,2-диацил-3-ацетинах — главных компонентах масел семян Euonymus verrucosus, Impatiens edgeworthii и других растений из сем. Celastraceae, Rosaceae, Balsaminaceae, Lardizabalaceae и Ranunculaceae. В продуктах гидрирования глицеридов идентифицировали sn-1,2-пальмитостеаро-3-ацетин и sn-1,2-дистеаро-3-ацетин; [α]²⁵₃₅₀ их смеси равен —1,9°, а в ИК-спектре имеется интенсивная полоса поглощения при 8,1 мк, характерная для ацетоксигруппы. Кроме ацетата триглицериды содержат обычные кислоты, причем в 2-положениях, как всегда, преобладают U-ацилы [77, 579, 580]. Оптическая активность стереоизомерных глицеридов не исчезает при гидрировании, хранении в течение шести-семи лет в нормальных условиях и нагревании до 170° при исключении ацильной мигра- <\br> Рис. 17. Рентгенограммы 2-олеопальмитостеарина I—IV — см. стр. 130

ции и окисления. Однако оптическая активность теряется после рандомизации, что доказывает расположение центра асимметрии в остатке глицерина этих триглицеридов [352, 368, 689, 856].

Обычно же оптическая активность, вызванная асимметрическим положением алифатических ацилов с длинной цепью, которые мало отличаются друг от друга по величине и строению молекулы, недостаточно велика, чтобы ее можно было обнаружить поляриметрией в видимом или УФ-свете [642, 689, 856]. Так, ацилирование остатком высшей жирной кислоты в 3-положение энантиоморфного, обнаруживающего оптическую активность 1,2-диглицерида, например D-(+)-1,2-диолеина с [α]²⁵_D = 1,73°, сразу же снимает эту активность [352, 368, 689]. Величина дисперсии оптического вращения в диапазоне 300—600 нм у синтетического sn-1,2-дипальмито-3-лаурина была в 25 раз ниже, чем у sn-1-монопальмитина, и имела обратный знак вращения [856]. Высокие величины оптического вращения, обнаруженные в дельфиньем жире (стр. 204) и в маслах двух растений из сем. Euphorbiaceae — S. sebiferum и Sebastiana lingustrina (стр. 192), оказались связанными с асимметрией ацилов жирных кислот, а не остатка глицерина [676, 738, 856, 890]. Энантиомерные триглицериды, непосредственно не обнаруживающие оптической активности даже в УФ-свете, получили название «криптоактивных» [856].

Использование физических методов для различения антиподов и рацематов и для определения абсолютной конфигурации криптоактивных триглицеридов требует предварительного препаративного выделения и тщательной очистки отдельных видов глицеридов; кроме того, последние в момент испытания должны быть в кристаллическом состоянии. Исследование пьезоэлектрической возбудимости кристаллов трех синтетических триглицеридов между электродами, вибрирующими с частотой переменного тока, показало, что пьезоэффект наблюдается только для антиподов, а в случае рацемата отсутствует. Различия между точками плавления рацемата и стереоизомеров слишком малы для надежной идентификации последних, поэтому необходимо определять фазовые диа- <\br> граммы смесей природного триглицерида неизвестной стереоконфигурации с каждым из двух соответствующих синтетических антиподов: если стандарт является энантиомером по отношению к природному глицериду, то могут возникнуть эвтектики [352, 856].

Сравнительно более удобным физическим методом определения стереоконфигурации триглицеридов оказался рентгеноструктурный анализ. Поскольку противоположные стереоизомеры (рис. 17, І и ІІ) дают одну и ту же картину дифракции, отличающуюся от картины, даваемой их смесью или синтетическим рацематом (ІІІ), для определения конфигурации 2-ОПС из масла какао (рис. 17, IV) сравнивали рентгенограммы III и IV; совпадение этих картин (рис. 17) доказывает, что природный 2-ОПС является рацематом. Если бы это совпадение не обнаружилось, то необходимо было бы получить дифракционную картину смеси природного глицерида с одним из синтетических стереоизомеров, например II; если картина меняется, то стереоизомер IV идентичен II, в противном случае стереоизомер IV идентичен І [856].

КАЧЕСТВЕННОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ ОПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

Химические методы анализа стереовидового состава триглицеридов делятся на качественные и количественные. Например, для качественного обнаружения оптической активности в растительных SUU-триглицеридах их можно путем липазного гидролиза превратить в смесь 1,2- и 2,3-диглицеридов; полученные ацетилированием последних ацетотриглицериды можно окислением по двойным связям раствором КМnО₄-КЈО₄ перевести в смесь VAzS и УAz₂-триглицеридов (У — ацетат). Наличие оптического вращения в этой смеси должно свидетельствовать о неэквивалентности жирнокислотного состава в положениях 1 и 3 исходных SUU-глицеридов [212].

Сходный метод анализа предложил Моррис. Поскольку синтетический 1,2-дипальмито-3-сорбо-sn-глицерин дал заметную оптическую активность ([α]²⁵_D = +3,7°), предположили, что, получив соответствующее активное производное sn-1,2- и 2,3-диглицеридов — продуктов липазного гидролиза жира, можно поляриметрией этих производных установить присутствие в жире стереоизомеров [212, 738]. ТМС-производные синтетических диглицеридов по величине [α] превосходили как эфиры сорбиновой кислоты, так и сами диглицериды, кроме того, они исключали миграцию ацилов; поэтому такие производные использовали для поляриметрического анализа. Стандартом был синтетический 1,2-дипальмито-3-ТМС-sn-глицерин, [α]²⁵_D = +4,7°. Асимметрические SSO- и SOO-триглицериды расщепляли панкреатической липазой и возникшие sn-1,2- и sn-2,3-диглицериды превращали в соответствующие ТМС-производные. <\br>

  CH₂OCOR₁
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OCOR₃

Липазный гидролиз →

  CH₂OH
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OCOR₃

  CH₂OCOR₁
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OH

Триметилсилилирование / Разделение →

  CH₂OTMC
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OCOR₃

(+)

  CH₂OCOR₁
  |
R₂COO-C-H
  |
  CH₂OTMC

(—)

Поскольку образовавшиеся в каждом случае диглицериды (SS и SO, SO и ОО соответственно) отличались друг от друга числом двойных связей, их можно было разделить хроматографией на силикагеле, пропитанном AgNO₃.

Таблица 10 Абсолютная конфигурация SSO- и OOS-триглицеридов некоторых природных жиров

Как видно из табл. 10, фракции (+)-sn-1,2- и (—)-sn-2,3-диглицеридов оптически активны. По абсолютной величине [α] ни одна из фракций не достигала синтетического стандарта. Эти данные позволили предварительно установить абсолютную конфигурацию триглицерида или состав преобладающих стереоизомеров [739].

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРЕОВИДОВОГО СОСТАВА ПРИРОДНОЙ СМЕСИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФОСФОЛИПАЗЫ А

Количественный метод Брокерхофа [129] основан на позиционной специфичности и стереоспецифичности липолитических ферментов: свободные ОН-группы рацемической смеси 1,2(2,3)-диглицеридов, полученной липазным гидролизом, фосфорилируют фенилдихлорфосфатом с образованием смеси стереоизомерных фенилфосфатидных кислот; 1,2-диацил-3-фенилфосфат-L-глицерины гидролизуют затем в 2-положении стереоспецифической фосфолипазой А змеиного яда (КФ.3.1.1.4), получая смесь 1-ацил-3-фенилфосфат-L-глицерина, свободных жирных кислот и не затронутого гидролизом 1-фенилфосфат-2,3-диацил-L-глицерина (D-антипода по Беру и Фишеру). По жирнокислотному составу исходных, промежуточных и конечных продуктов реакции можно независимо вычислить состав ацилов в 1-, 2- и 3-положениях триглицеридов.

Стереоспецифический анализ триглицеридов по Брокерхофу

  1
  |
  2-
  |
  3

a → I

  1
  |
1+3+2-
  |
  3

б → II

  1
  |
+2-
  |
  3

III

  1
  |
+2-
  |
  3

IV

  1
  |
+2-
  |
  3

V

  1
  |
  2
  |
  P-Ph

в → VI

  1
  |
  2
  |
  P-Ph

  1
  |
  2
  |
  P-Ph

  1
  |
  2
  |
  P-Ph

VII VIII IX

где: 1—3 — ацилы жирных кислот; P — Ph— остаток фосфорилфенола; I, V — триглицерид; II, VIII — жирные кислоты; III — sn-1,2- и sn-2,3-диглицериды; IV — 2-моноглицерид; VI — L- и D-фосфатидилфенолы; VII — L-лизофосфатидилфенол; IX — D-фосфатидилфенол. Реакции: а — липазный гидролиз; б — реакция диглицеридов с фенилдихлорфосфатом; в — гидролиз фосфолипазой А.

Успешный анализ возможен лишь при отсутствии ацильной миграции и жирнокислотной специфичности гидролиза; в против- <\br> ном случае кислотный состав в крайних положениях диглицеридов не будет идентичен таковому исходных триглицеридов [212]. Расщепление D-, L- и DL-дипальмитоолеина липазой показало, что гидролиз обоих крайних ацилов происходит одновременно и с равной скоростью, а полученные диглицериды оптически не активны. Величина [П]/[О] в СЖК и диглицеридах реакционной смеси отвечает теоретическому — 1 : 1 и 3 : 1 соответственно [927]. При гидролизе по Маттсону остаток стеариновой кислоты отщеплялся медленнее, чем другие ацилы [698], поэтому для обеспечения строго статистического гидролиза в обычную среду (стр. 115) добавляли гексан, который ослабляет силы Ван-дер-Ваальса, селективно удерживающие ацилы над поверхностью жировой мицеллы [129, 130].

Отщепление полиненасыщенных кислот с m = 20—22 отставало даже в присутствии гексана, что приводило к накоплению этих кислот в диглицеридах. Поэтому для «морских» жиров (стр. 200), а также для свиного жира и кукурузного масла применяли гидролиз реактивом Гриньяра (0,06—0,12 М метилмагнийбромида в эфире). При деацилировании симметричные моно- и диглицериды значительно изменялись по жирнокислотному составу из-за ацильной миграции, однако 1,2(2,3)-диглицериды отвечали по составу исходным триглицеридам и могли использоваться для стереоспецифического анализа [59, 130, 134, 140, 212, 1011].

Для оценки соответствия хода гидролиза статистическому правилу найденный жирнокислотный состав 1,2(2,3)-диглицеридов сравнивали с составом, вычисленным по уравнению [A]₁,₂(₂,₃) = 0,25 (3[A] + [А]₂). Оказалось, что состав диглицеридов, полученных гидролизом по Брокерхофу или по Лэндсу [129, 617], значительно отличался от теоретического из-за повышенного содержания насыщенных ацилов. Наилучшие результаты в этом отношении дал микрометод гидролиза [59, 656]. Возможно, что статистический гидролиз можно обеспечить снижением уровня Са²⁺ и увеличением содержания фермента в реакционной смеси [212].

По Брокерхофу, продукты липазного гидролиза разделяли на колонке с силикагелем; диглицериды (выход 20—30%) разделяли на 1,2(2,3)- и 1,3-изомеры на кремнекислоте, пропитанной Н₃ВО₃. Несимметричные диглицериды превращали в фосфатидные кислоты в присутствии фенилдихлорфосфата, эфира и пиридина при 0°. Триэтиламмониевые соли этих кислот гидролизовали фосфолипазой А в эфире, рН 7,5, в присутствии СаСl₂ и продукты реакции разделяли хроматографией с Н₃ВО₃ [129, 130, 134, 140]. Жирнокислотный состав каждой фракции определяли газохроматографически. Достоверные результаты состава 1-, 2- и 3-положения можно получить лишь при совпадении данных следующих анализов: I = V, III = VI и IV = VIII (см. выше). Совпадение этих величин показывает, что липазный и фосфолипазный гидролиз прошел статистически и не сопровождался изомеризацией. Непосредственно определялся состав 1- (VII) и 2-положений (IV и VIII); <\br> состав 3-положений вычисляли двумя методами: с одной стороны, содержание кислоты в 3-положениях равно 3 × I — IV — VII, а с другой, 2 × IX — IV. В этих расчетах допустимо абсолютное расхождение в 4% при содержании данной кислоты в жире [А] ≥ 40% и выше, не более 3% при [А] = 10—35% и не более 2% для минорных компонентов; обычно при анализе состава 3-положений ошибка не превышает ±2% и лишь для трудногидролизуемых насыщенных жиров возрастает до 8% [129, 130, 140, 144, 146]. Если результаты хорошо воспроизводятся, то можно ограничиться определением фракций I, IV, VII и IX [130]. Метод Брокерхофа проверен с синтетическими и полусинтетическими триглицеридами [129].

Для непосредственного определения состава 3-положений из продуктов деацилирования триглицеридов по Гриньяру (стр. 133) выделяли 1,3-диглицериды, превращали их в L-2-фосфатидилфенолы и гидролизовали последние фосфолипазой А в положении 1; возникающие лизофосфатидилфенолы по жирнокислотному составу соответствуют 3-положениям исходных триглицеридов [134].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ КОНФИГУРАЦИИ ОТДЕЛЬНЫХ ВИДОВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Все изученные жиры обнаружили различия в составе 1- и 3-положений. Это косвенно указывает на содержание оптически активных триглицеридов, но еще не говорит об их природе [739]. Однако даже одинаковый состав крайних положений не обязательно доказывает, что все глицериды данного жира являются рацематами. Так, для эквимолярной смеси (R) ПОС, (S) ППС, (R) ПОС, (S) ПОС, (R) ППС и (S) ППС соотношение [П] и [С] в положениях 1 и 3 равно единице, хотя эта смесь содержит 1/3 рацемата 2-ОПС, 1/3 рацемата 2-ППС, 1/6 антипода (R) ПОС и 1/6 антипода (S) ППС. Поэтому количественные выводы об абсолютной конфигурации можно делать только по данным анализа или отдельных видов глицеридов, или их простейших смесей, в которых, как, например, в (S) ПОС + СОС, определенная кислота, в данном случае пальмитиновая, имеется лишь в одном из крайних положений [856].

Высокая эффективность современных методов фракционирования делает проблему анализа конфигурации смесей и отдельных видов двукислотных триглицеридов, по крайней мере в принципе, разрешимой, поскольку эти методы обеспечивают разделение метамеров (стр. 11) с одинаковой величиной m и е, но с разным числом S-ацилов (например, ССЛ и СОО). Соотношение стереоизомеров двухкислотного триглицерида легко установить по содержанию кислоты В в положениях 1, 2 и 3 смеси ААВ + ABA + BAA. Более сложно определение конфигурации трехкислотных триглицеридов, которое сводится к определению соотношения концентраций шести возможных стереоизомеров: АBC, ACB, ВАС, ВСА, <\br> САВ и СВА. Знание жирнокислотного состава 1-, 2- и 3-положений позволяет определить соотношения произвольных пар изомеров, например пар по содержанию кислоты А [131]:

(I)

AA BC BC
BC AA CB
CB CB AA

(II)

AB AC BC
BA CA CB
PP PP PP

x y z

Для расчета содержания каждого стереоизомера смеси (I) необходим еще один независимый параметр, который можно получить хроматографическим разделением промежуточных продуктов анализа по жирнокислотному составу. Для определения состава смеси (I) глицерид (АВС) гидролизуют липазой, выделяют 1,2(2,3)-диглицериды, 1,2-изомеры селективно превращают в фосфатидные кислоты стереоспецифической диглицеридкиназой (стр. 257) и определяют жирнокислотный состав каждого из положений методом, аналогичным методу Брокерхофа, но с тем отличием, что фосфатидные кислоты предварительно разделяют на пары стереоизомеров согласно составу кислот (II). Соотношение пар х, у и z равно соотношению содержания кислот С, В и А соответственно в положениях 3. Соотношение изомеров внутри пары можно определить при помощи фосфолипазы А [618].

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДРУГИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА СТЕРЕОВИДОВОГО СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Если в (АВС)-глицериде содержится олеат, то дополнительный аналитический параметр для определения изомерного состава можно получить при помощи липазы микроорганизма Geotrichum candidum, селективно отщепляющей эту кислоту из любого положения глицерида (стр. 120). Гидролиз этой липазой можно провести одновременно с анализом по Брокерхофу, а затем выделить 1,2(2,3)-диглицериды, полученные отщеплением олеата в 1(3)-положениях, перевести их в фосфатидилфенолы, определить соотношение изомеров внутри выделенной стереоизомерной пары с фосфолипазой А и вычислить из полученного соотношения и данных анализа по Брокерхофу содержание в смеси остальных антиподов [446].

Помимо фосфолипазы А, для анализа стереовидового состава пригодны и другие стереоспецифические ферменты липидного обмена. Рацемическую смесь полученных по Брокерхофу фенилфосфатидных кислот можно, например, разделить гидролизом фосфолипазой С, специфичной лишь к L-изомеру [130]. Анализ триглицеридов печени крысы (стр. 214) провели при помощи диглицеридкиназы из Escherichia coli, которая превращает 1,2-изомер диглицеридов, полученных липазным гидролизом, в фосфатидные кислоты (ФК) в 25 раз быстрее, чем 2,3-изомер [617, 882, 883]. Распре- <\br> деление молярной концентрации каждой жирной кислоты суммы триглицеридов между положениями 1, 2 и 3 вычисляли после анализа продуктов ферментативных реакций по уравнениям: [A]₁ = = (2[А]ФК — [А]МГ) : 3; [A]₂ = ([А]МГ) : 3; [А]₃ = [А]ТГ — (2[А]ФК) : 3. Равенство правой и левой частей в этих уравнениях достигается лишь в том случае, если жирнокислотный состав полученных при липазном гидролизе 1,2(2,3)-диглицеридов отвечает рассчитанному (стр. 133). При этом условии подстановка величин [A]₁,₂(₂,₃) вместо величин [А]ФК в уравнения должна дать одинаковый жирнокислотный состав в 1- и 3-положениях; обнаруживаемые различия указывают на величину ошибки метода. Проведенные вычисления свидетельствуют о значительных различиях между положениями, указывающих на жирнокислотную селективность липазного гидролиза. Для достоверного анализа стереовидового состава необходимо в каждом опыте получить совпадение найденного жирнокислотного состава с теоретическим [59].

Глава 8. ПОЛИМОРФИЗМ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

СТРУКТУРА КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ РЕШЕТКИ И ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Явление полиморфизма, открытое Митчерлихом в 1821 г., заключается в существовании для данного химического соединения нескольких кристаллических модификаций, называемых полиморфными формами. Эти формы существенно различаются по структуре и параметрам кристаллической решетки, по температуре плавления, плотности и другим физическим свойствам, но, в отличие от позиционных изомеров, дают идентичную жидкую или газообразную фазу. Способность к полиморфным превращениям весьма свойственна соединениям жирного ряда с длинной цепью и в их числе триглицеридам природных жиров. До начала 30-х годов ХХ в. существование тройных точек плавления, обнаруженное для тристеарина еще в середине ХІХ в., объясняли наличием в глицеридах нескольких изомеров положения. Позднее в работах Т. Малкина было установлено, что эта аномалия связана с различиями в кристаллической решетке. Как показал рентгеноструктурный анализ, при медленном нагревании застывшего расплава (α-полиморфной формы) простого S₃-триглицерида он плавится, а затем снова затвердевает с выделением тепла, образуя более устойчивую β- или промежуточную β'-форму; к возникновению последней приводит выдерживание жидкого расплава при температуре на 1—2° выше точки плавления α-формы. Эти превращения, которые могут и не сопровождаться плавлением, идут в направлении от менее устойчивых форм, образование которых требует минимального изменения свободной энергии решетки, к термодинамически более <\br> устойчивым полиморфным модификациям. Триглицериды различного состава и строения образуют сходные по физическим свойствам главные α-, β- и β'-формы, поскольку решающую роль в полиморфных превращениях играют углеводородные цепи. Тем не менее при исследовании природных жиров постоянно обнаруживаются новые добавочные полиморфные формы, и потому классификация и номенклатура последних окончательно еще не установлены. Направление полиморфных превращений и образование тех или иных форм зависят от чистоты препарата, наличия и природы затравки для кристаллизации, растворителя, давления, температуры, скорости ее изменения и т. д. Следовательно, о кристаллических, термических и

Рис. 18. Элементарная ячейка кристалла β-полиморфной формы стеариновой кислоты а, b — короткие межплоскостные расстояния; с sinβₓ — длинное межплоскостное расстояние

других физических свойствах отдельного триглицерида в определенных условиях среды можно говорить только после определения полиморфной формы, в которой находится в данный момент это соединение. Полиморфизму триглицеридов посвящено несколько обзоров [178, 180, 244, 315, 423, 689, 729, 840].

По данным рентгеноструктурного анализа, алифатические цепи представляют собой зигзагообразные структуры с прямолинейными осями, где угол между С—С-связями равен 109°28′, а величина (а) приращения длины жирнокислотного остатка при увеличении последнего на одну СН₂-группу составляет ~1,28 Å [689]. При недостаточно низкой температуре подход цепей друг к другу на малое расстояние затруднен, и потому триглицериды остаются в жидком состоянии, где отсутствует упорядоченная структура. Возрастающее сближение ацилов при охлаждении приводит к возникновению притяжения между атомами углерода соседних цепей за счет сил Ван-дер-Ваальса и тем самым к кристаллизации триглицеридов [313, 315].

В кристаллах однородных алифатических молекул, концы которых различаются по полярности, цепи располагаются в основном параллельно, в виде своеобразного «частокола», и за счет водородных связей полярных групп обычно образуют двойной кристаллический слой. Наглядную модель этого слоя можно представить себе в виде двух связок очень большого числа спичек, где головка обозначает метильный радикал, а свободный конец — полярную <\br> Рис. 19. Элементарная кристаллическая ячейка триглицеридов а — поперечный разрез; б — поперечный разрез с двумя молекулами (или двойными молекулами), принадлежащими к ячейке; в — поперечный разрез через кристалл

Рис. 20. Возможные конфигурации молекул в кристаллах триглицеридов Конфигурации: 1 — вилки; 2 — кресла; 3 — стержня. Длинный интервал, кратный: а — 2m; б — 3m; в — 4m

группу; одна из связок поставлена головками на некоторую плоскость, а другая — свободными концами на первую связку. Таким образом, двойные молекулярные слои ограничены неполярными «метильными» плоскостями, расстояние между которыми (L) в Å называется длинным интервалом («long spacing»). Найденная по рентгеноструктурным данным величина L позволяет определить число цепей, составляющих один длинный интервал [689].

Если двойные цепи расположены под углом 90° к плоскостям СН₃-групп, то L = 2m (в этой формуле и формулах, приведенных ниже, величина m выражает не число атомов, как обычно, а длину алифатической цепи в Å); в кристаллах смешанных глицеридов встречаются слои с L, кратным трем или четырем длинам цепей. Однако чаще всего m < L < 2m, и направления алифатических цепей и плоскостей, расположены под углом βₓ < 90°. Величины βₓ являются характеристиками кристаллических модификаций, причем уменьшение угла βₓ приводит к усилению контакта между их более полярными сложноэфирными группами и, следовательно, к повышению устойчивости полиморфных форм [178, 313, 423].

Величина L данной формы для триглицеридов разного жирнокислотного состава различна. Недавнее предположение о том, что снижение L вызвано не наклоном цепей, а их вторичными изгибами меандровой формы, экспериментально еще не доказано [423].

Расположенные параллельно друг другу алифатические цепи триглицеридов образуют элементарную кристаллическую ячейку. Она представляет собой вертикальную или наклонную призму, ширина которой, называемая коротким интервалом S («short spacing»), определяется тем или иным способом упаковки полиметиленовых цепей в кристаллической решетке, который является другим главным источником разнообразия полиморфных форм природных глицеридов. В отличие от L, значение S для данной формы <\br> практически постоянно и не зависит от величины m [178, 315, 840]. На рис. 18 представлена модель состоящей из двух пар цепей ячейки стеариновой кислоты [689]. Несколько сложнее построена содержащая две молекулы ячейка триглицеридов: поскольку направление одного из ацилов молекулы составляет угол в 180° с направлением остальных двух ацилов (рис. 19), каждая цепь в решетке совпадает по положению с длинной осью четырехгранной призмы, образованной четырьмя другими цепями (рис. 19) [423]. На рис. 20 приведены возможные конфигурации молекул в кристаллах триглицеридов.

Сначала считали, что эти молекулы имеют конфигурацию вилки, а затем предположили, что более плотная упаковка соответствует конфигурации кресла. Проведенный недавно рентгеноструктурный анализ единичного кристалла β-полиморфной формы трилаурина (рис. 21) позволил установить, что наиболее экономичная упаковка молекул с наименьшей по-

Рис. 21. Рентгенограмма β₂-полиморфной формы трилаурина, показывающая размещение триглицерида в кристаллической решетке а, с — то же, что на рис. 18

тенциальной энергией, не противоречащая принципам симметрии, достигается в форме стержня [178, 180]. Можно видеть, что кристалл состоит из 2m-слоев стержнеобразных молекул в триклинной упаковке; два ацила находятся на одной прямой, а третий (еще не известно, какой именно, средний или один из крайних) <\br> Таблица 11 Физические свойства главных полиморфных форм простых насыщенных триглицеридов * [178, 313]

• В скобках приведены соответствующие данные для тристеарина. ** Чередование точек плавления «четных» и «нечетных» гомологов триглицеридов. *** S — короткое межплоскостное расстояние. **** с — константа для вычисления длинных межплоскостных расстояний L по уравнению Ганстоуна при четных значениях m; 1 — при L, кратном 2m (в уравнении

расположен рядом параллельно им. Значения угла βₓ, найденные из рентгенограммы (62°7′) и вычисленные по величине L (61°39′), хорошо совпадали между собой. Стержневидная форма обеспечивает также образование 3m- и 4m-слоев в кристалле (см. выше) [178, 423]. Форма молекул в других главных кристаллических модификациях α и β' остается еще не выясненной [619].

В гетерогенных системах фазовые переходы могут быть энантиотропными, т. е. осуществляться обратимо в обоих направлениях без расплавления при повышении или понижении температуры системы, или монотропными, которые необратимы, протекают с потерей свободной энергии в направлении более устойчивой формы и для обратного получения нестабильной полиморфной формы требуют промежуточного расплавления. Для триглицеридов характерны главным образом монотропные фазовые переходы [178]. Для получения четких полиморфных переходов и образования форм с определенными свойствами необходимо располагать чистыми препаратами триглицеридов, не содержащими глицеридных гомологов близкого состава или строения. Так, в однородных образцах Ла₃ и С₃, судя по спектрам ЯМР низкого разрешения, жидкая фаза ниже температуры плавления отсутствовала, а в за- <\br> | Упаковка цепей | Дилатометрические данные V_s (-38°), мл/г | Теплота плавления, кал/г | Главные полосы поглощения V С=О-группы,***** см⁻¹ | Главный способ получения | | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | | Гексагональная | (1,014) | 38,9 | 720 | Застывание расплава при 0° | | Орторомбическая | (1,017) | | 727 и 719, дублет | Застывание расплава при t° + 2° | | Триклинная | (1,043) | 54,5 | 717 | Кристаллизация из полярных растворителей; медленное нагревание кристаллов α-формы выше t° |

Ганстоуна m_A = 0; 2 — при L, кратном 3m; а — при m_A = m_B = m_C, m_A = m_C < m_B, m_A < m_B < m_C, m_A ≠ m_B ≠ m_C (m_A < m_C); б — m_A < m_B < m_C, m_A = m_C > m_B. ***** См. стр. 144. ****** t — точка плавления α_L-формы триглицерида.

грязненных кристаллах β-форм ОПП, ПОП, ПОО и СОС жидкая фаза появлялась задолго до плавления [205, 746]. Обычно в переохлажденных расплавах непосредственно ниже точки плавления β-формы наблюдается перелом кривых зависимости lg η (η — вязкость) от обратной температуры Т⁻¹, указывающий на усиление агрегации глицеридных молекул в параллельной упаковке. Сразу же после расплавления триглицерида его кристаллическая структура частично сохраняется, поскольку быстрое охлаждение такого расплава приводит к немедленной рекристаллизации. После разрушения частично упорядоченной структуры жидкой фазы путем получасового выдерживания при температуре, на 20° превышающей температуру плавления, кристаллы образуются медленно [182, 783, 929]. При кристаллизации трипальмитина свойства образующихся кристаллов β-формы определяются природой растворителя: кристаллы наибольшего размера получаются из ацетона, а кристаллы, осажденные из гексана, толуола, бензола и хлороформа, резко отличаются от них по форме и величине [57].

Условия получения главных полиморфных форм простых S₃ указаны в табл. 11 [178, 313]. В этой же таблице приведены неко- <\br> Рис. 22. Дилатометрические (1) и температурные (2) кривые метастабильной α- и стабильной β-полиморфной формы трилаурина (а, б), трипальмитина (в, г) и тристеарина (д, е) а, в, д — α-формы; б, г, е — β-формы

торые из методов исследования полиморфизма триглицеридов. К наиболее ранним методам относятся определение точек плавления в капилляре и дифференциальный термический анализ, который заключается в непрерывной регистрации выделения тепла при затвердевании или поглощения при плавлении по кривым разности температур между окружающей средой и пробой триглицерида при его охлаждении или нагревании соответственно [181, 689, 729, 805].

Рис. 23. Схема рентгенограмм трех полиморфных форм тристеарина а — α; б — β'; в — β

Дилатометрия регистрирует увеличение удельного объема (V_s в мл/г) триглицерида в одной из точек фазового перехода — точке плавления, а также равное по абсолютной величине сжатие в точке затвердевания; оба эти процесса регистрируются как функции температуры [27, 379]. Приведем величины «скачка» V_s в мл × 10⁻² г при плавлении некоторых глицеридов: ООО — 6,65, COO — 9,05, CCC — 9,25, ОПП — 9,65, ПСС — 14,06, СПП — 14,60, CCC — 15,16, ППП — 16,21 [126]. При нагревании α- и β'-форм Ла₃, П₃ и С₃ в микродилатометре со скоростью 6,4° в 1 мин. (рис. 22) было обнаружено, что различия между исходной и конечной величиной V_s при плавлении β-формы связаны с образованием при застывании расплава промежуточной β'-формы для П₃ и метастабильной α-формы для всех триглицеридов, устойчивость которой возрастает с увеличением m и нагревание которой приводит к образованию β-формы [27]. <\br> Рис. 24. Инфракрасные спектры полиморфных форм тристеарина

Периодическое определение числа и величины L и S, свойственных той или иной полиморфной форме данного глицерида, по картине дифракции рентгеновых лучей кристаллическим порошком (рис. 23) или крупным единичным кристаллом (см. рис. 21) также позволяет обнаружить полиморфные превращения, вызванные изменением температуры [176, 840, 990].

Изменения в упаковке цепей при переходе от неустойчивой к устойчивой полиморфной форме можно определить методом ИК спектроскопии (рис. 24) по характерным для данной формы скелетным колебаниям в диапазоне 2—15 мк (5000—600 см⁻¹) [5, 176, 315, 423, 610]. Наконец, спектроскопия ЯМР низкого разрешения позволяет оценить вращательную подвижность ацилов триглицеридов в кристаллической решетке, уловить термический переход тристеарина α → β и количественно определить малые концентрации жидкой фазы в кристаллах триглицеридов с точностью ±2%. Этот метод более эффективен, чем дилатометрия, которая дает лишь относительное содержание твердой фазы [205, 929].

ПОЛИМОРФНЫЕ ФОРМЫ ТРИНАСЫЩЕННЫХ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

В табл. 11 были приведены некоторые свойства главных полиморфных форм наиболее изученных простых S₃-триглицеридов [178, 313]; более полные данные на этот счет содержатся в монографии Маркли [689]. Единой номенклатуры форм еще не имеется (табл. 11). Более ранняя номенклатура Малкина (М), различающая для данного триглицерида четыре формы — стекловидную, α-, β'- и β- в порядке роста температуры плавления, имеет тот недостаток, что у разных форм со сходной структурой кристаллов эти температуры могут быть очень близки или даже совпадать [244, 423, 729]. Согласно Луттону (L), лишенная кристаллической структуры стекловидная форма в действительности не существует, <\br> а имеются только три главные полиморфные формы — α-, β'- и β-, характеризуемые величиной S (табл. 11) [315, 662, 840, 990]. Во избежание путаницы, принадлежность данной формы к той или иной номенклатуре обозначают индексом автора М или L (α_M, α_L, β'_M и т. д.), а число цепей в длинном интервале — цифрой после индекса (β'_L-2, β_L-3 и т. д.) [176, 180, 313, 619].

Установление числа и свойств отдельных полиморфных форм триглицеридов стало возможным благодаря использованию спектроскопических методов. Краткая характеристика ИК-спектров расплавов или растворов простых S₃-глицеридов приведена в табл. 12 [5, 176, 177, 181]. Для твердых триглицеридов характерны интенсивность и число полос колебаний V группы причем обнаружены три типа ИК-спектров по набору таких полос, соответствующих главным полиморфным формам в системе Луттона (табл. 11).

В образующейся из расплава α_L-форме, свойства которой были приведены в табл. 11, цепи отдалены друг от друга на расстояние около 5 Å и свободно вращаются вокруг своей вертикальной оси. Наличие в спектре многочисленных полос α_L-формы в области 1250 см⁻¹ доказывает, что эта форма является кристаллической, а не стекловидной, как считал Малкин. У глицеридов от Ла₃ и выше, обладающих сравнительно устойчивой α_L-формой, число этих полос равно m/2, что позволяет устанавливать длину ацилов в глицеридах по ИК-спектру [178].

Свойства β'_L-формы (табл. 11) указывают на обычную орторомбическую упаковку двух типов наклонных алифатических цепей, плоскости которых ориентированы под прямыми углами друг к другу. Наблюдалось образование β'_L-формы С₃ при кристаллизации из парафинового масла [178, 746].

Наконец, β_L-форма (табл. 11) соответствует триклинной системе, где все плоскости зигзагообразных жирных цепей параллельны друг другу, а сами цепи значительно более устойчивы и упако-

Таблица 12 Главные полосы поглощения простых тринасыщенных триглицеридов в инфракрасном спектре

Номенклатуры Малкина и Луттона не позволяют сравнивать триглицериды по свойствам их полиморфных форм с другими алифатическими соединениями. В номенклатуре Ганстоуна [313] полиморфные формы всех насыщенных соединений с длинной цепью подразделяются по величине угла βₓ на пять групп, причем триглицериды входят в три первых группы V, U и Т (табл. 11). Величину L в кристаллах одно-, двух- и трехкислотных S₃-триглицеридов вида АВС (ацил В всегда в 2-положении), являющуюся линейной функцией длины цепи m, можно вычислить по уравнению L = 1,28 × sin βₓ (m_A + m_B + m_C) + с, где m_A, m_B, m_C — число атомов углерода в ацилах А, В и С, а с — постоянное приращение L в Å, отражающее длину остатка глицерина и величину зоны контакта сложноэфирных групп; величины с для 2m- и 3m-слоев простых и смешанных триглицеридов с разной длиной ацилов А, В и С приведены в табл. 11. Для двойного (2m) слоя значение m_A в уравнении Ганстоуна считают равным нулю. Вычисленные и найденные рентгеноструктурным методом величины L хорошо совпадали между собой [313]. Номенклатура Ганстоуна впервые показала, что каждая полиморфная форма характеризуется определенной величиной угла наклона; однако эта номенклатура непригодна для вычисления L ненасыщенных глицеридов и не учитывает добавочные полиморфные формы простых S₃-глицеридов, совпадающие с основными по величине βₓ [619].

К таким добавочным формам относится, например, sub-α_L-форма, которая получается без плавления из α_L-формы С₃ при —50°, обратимо превращается в α_L-форму и по всем изученным показателям, кроме величины угла βₓ = 90°, совпадает с β'-формой. Иногда при кристаллизации из растворителя или при нагревании α-формы возникают несколько устойчивых β_L-форм, идентичных по картине дифракции, но различающихся по величине βₓ. В отличие от «четных» триглицеридов, триглицериды «нечетных» кислот наиболее устойчивы не в β_L, а в β'_L-форме [176, 178, 746].

Возникновение добавочных форм пытались учесть номенклатуры Хора и Ларсона. По Хору, имеются четыре полиморфных формы — α, β', промежуточная и β, в порядке повышения температуры плавления. Обозначенная «промежуточной» модификация, которая возникает при нагреве α-формы, как было показано позднее, оказалась смесью равных количеств орторомбической и триклинной форм [313, 379].

По Ларсону: 1) формы с одним S = 4,15 Å обозначаются α; 2) формы с двумя S = 4,2 и 3,8 Å и дублетом при 720 см⁻¹ обозначаются β', а все формы, не удовлетворяющие критериям 1 и 2, обозначаются β; если у данного глицерида есть несколько <\br> β-форм, то они обозначаются β₁, β₂ и т. д., в порядке снижения температуры плавления. У β-форм по Ларсону все плоскости зигзагообразных цепей параллельны, у β'-форм — перпендикулярны, а у α-форм в размещении плоскостей нет определенной закономерности [619].

Несмотря на свои недостатки, наиболее приемлемой в настоящее время является номенклатура Луттона, включающая три главные полиморфные формы простых S₃-триглицеридов — неустойчивую α, промежуточную β' и устойчивую β. Эти главные формы следует рассматривать как совокупности близких по свойствам, но не идентичных кристаллических модификаций. Для разработки более полной классификации необходимы дальнейшие исследования [178].

Как показывает табл. 13, полиморфизм двух- и трехкислотных S₃-триглицеридов обнаруживает значительную индивидуальность в зависимости от величины Δm в 2-положении, от симметрии строения и от наличия ацила летучей кислоты в 2-положении.

Таблица 13 Полиморфные формы некоторых насыщенных двух- и трехкислотных триглицеридов

• β'_L- и β_L-Формы одинаково устойчивы. ** β_L-Форма наиболее устойчива. *** β'_L-Форма наиболее устойчива; β_L-форма трудно уловима. **** β'_L- и β_L-Формы близки по величине L. ***** α_L-Форма наиболее устойчива. ****** Добавочные формы устойчивы. <\br> В гомологических рядах триглицеридов, характеризуемых определенным значением + Δm или — Δm, наблюдается аналогичный набор полиморфных форм, а симметричные и несимметричные триглицериды одного состава обнаруживают одинаковую величину L двойных и тройных слоев, которая хорошо совпадает с вычисленной по Ганстоуну (см. табл. 11). У разных триглицеридов наибольшей устойчивостью отличаются β_L, β'_L- или α_L-формы; например, у глицеридов бегеновой кислоты устойчивы не β_L- а β'_L-формы. Трудноуловимые формы можно получить только в присутствии кристаллов янтарной кислоты. Смешанные глицериды, содержащие два ацила какой-либо кислоты, почти идентичны простым глицеридам той же кислоты по числу полос ИК-спектра α_L-формы в области 1250 см⁻¹ [176—179, 662].

С увеличением абсолютной величины Δm сложность полиморфного состава возрастает (табл. 13). У смешанных глицеридов, включающих ацилы летучих кислот, большую роль в полиморфизме играет С=О-группа этих ацилов, вызывающая появление уникальных полиморфных форм; среди них super-α-форма превышает по температуре плавления α-форму на 10° и имеет единственный S = 4,2 Å. В ИК-спектре β'_L-формы 1-ПУУ наблюдались сильные полосы поглощения СН₃- и СН₂-групп ацетата при 1379 и 717 см⁻¹ соответственно, указывающие на триклинную упаковку. Для идентификации позиционных видов, содержащих летучие ацилы, например МаМаП и МаПМа, использовали спектры ЯМР высокого разрешения их полиморфных форм [179, 840]. У трехкислотных глицеридов α_L-формы отсутствуют (табл. 13); величину L для этих глицеридов можно рассчитать по Ганстоуну (см. табл. 11) [313, 689].

ПОЛИМОРФНЫЕ ФОРМЫ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ДРУГИХ ТИПОВ

Менее изученные простые U₃-триглицериды по набору и свойствам полиморфных форм в общем сходны друг с другом и с соответствующими S₃-глицеридами; иногда встречаются добавочные формы, например, β'_L-3 у цис-ненасыщенных триглицеридов. Для последних характерны полосы поглощения ножничных колебаний атомов Н в цис-связи при 690 и 1660 см⁻¹. Триолеин сходен с тристеарином по главным полосам поглощения полиморфных форм при 723 (α_L), 729 (β'_L) и 722 (β_L) см⁻¹. У соответствующих транс-изомеров ненасыщенных триглицеридов появляется характерная для всех форм полоса при 963 см⁻¹, а сходство с S₃-глицеридами той же длины по полиморфному составу еще более возрастает. Число полос U₃ при 1250 см⁻¹ равно m/2, как в случае S₃ (стр. 144) [177, 180]. Таким образом, в простых триглицеридах ненасыщенность мало влияет на полиморфизм [689].

Более широкий набор полиморфных форм имеют триглицериды типа SUS, составляющие около 80% важного в хозяйственном отношении масла бобов какао (стр. 181). Полиморфизм этого масла хорошо изучен, поскольку он служил главным методом опреде- <\br> ления ПВС глицеридов до появления липазного гидролиза [660, 714]. Кристаллические фракции природного масла совпадают со смесью синтетических ПОС, СОС, и ПОП, а выделенный из масла ПОС — с синтетическим ПОС по данным температуры плавления, кривых нагревания, дилатометрии, дифракционных картин и ИК-спектров их отдельных полиморфных форм до и после гидрирования [177, 181]. Ниже приведены свойства этих форм для масла какао, ПОС и СОС. Наблюдалось легкое превращение форм sub-α-3 → α_L-2 при 0° и V → VI при 35°, а также медленный переход α_L-2 → β_L-3 при нагревании [990]. Полиморфные формы отдельных стереоизомеров триглицеридов масла какао (стр. 131) еще не исследованы. Смесь СОС и ПОС дает три полиморфные формы и отличается от каждого из исходных глицеридов по скорости превращения неустойчивых форм, а смесь СОС и ССО (1 : 3) может образовывать новую кристаллическую модификацию, отсутствующую у каждого из компонентов [610, 611]. Сопоставление полиморфизма СОС и ССО показало, что параллелизм с соответствующими насыщенными изомерами (см. ниже) отсутствует: у обоих изомеров наиболее легкоплавкой была sub-α_L-3-форма,

переходящая в α_L-форму (стр. 145), а из расплава образовывалась α_L-3-форма; в то же время устойчивой формой у СОС служит β_L-3-, а у ССО β_L-3-форма с температурой плавления 43°, появляющаяся при нагревании α_L-3-формы [652]. В гомологических рядах ППО по характеру полиморфизма аналогичен ССО, а ПОП аналогичен СОС; у несимметричных SU₂-глицеридов СОО и ПОО, так же как у ССО и ППО, устойчивой была β_L-3-форма [661]. По данным ЯМР спектроскопии, цепи олеата в ССО упакованы менее плотно и вращаются вокруг длинной оси свободнее, чем насыщенные ацилы [178, 180, 689, 729].

Кроме ССО наиболее изучены по полиморфизму SSU-глицериды свиного жира (стр. 207) [819], главный триглицерид которого по всем свойствам полиморфных форм совпадает с ОПС [181]; его наиболее легкоплавкой формой является sub-α_L-2, а возникающей из расплава формой α_L-2(25°), которую можно перевести нагреванием в более устойчивую sub-β'_L-3-форму (37°) с L = 69 Å и S = 4,08 и 3,75 Å. Наиболее стойкую β_L-3-форму (40°) получают кристаллизацией из растворителя или нагреванием sub-β_L-3-формы [611], крупнозернистые кристаллы которой возникают при хранении свиного жира при 27°, что ухудшает внешний вид пищевых <\br> продуктов [930]; это явление устраняют переэтерификацией (стр. 107) [805]. В отличие от ОПС, ССО и ПОО, симметричные глицериды свиного жира ОСО и ОПО дают формы α_L, β'_L-2 и β_L-3, из которых последняя является устойчивой [661].

У нативного, гидрированного и переэтерифицированного говяжьего и бараньего жира и у S₃ этих жиров наиболее устойчива β_L-форма [729, 805], а у гидрированного хлопкового масла из-за преобладания в нем ПСП (см. выше) — β'_L-форма, которую можно получить кристаллизацией из гексана в присутствии янтарной кислоты [930]. Полному переходу к устойчивому полиморфному составу способствует смешивание жиров, богатых SSU, с жирами, содержащими много SUS [611, 652], а также длительное выдерживание при постоянной температуре — темперирование [840]. Так, у некоторых гидрированных растительных жиров при зимнем хранении появляется зернистая текстура, что связано с непосредственным переходом α_L-формы S₃-глицеридов в β_L-форму [661, 689].

Изучение полиморфизма природных жиров достигло больших успехов и, в частности, показало, что строение жиров не является статистическим. Дальнейшие исследования должны создать более полную картину полиморфных форм триглицеридов, особенно ненасыщенных, которые составляют большую часть мирового производства жиров, но изучены еще слабо [313]. Определение совокупности свойств всех кристаллических модификаций соответствующих синтетических и природных триглицеридов имеет большое теоретическое значение для идентификации последних по их составу и строению [729]. Не менее важно и практическое значение полиморфных форм жира для его технологической оценки [929] по консистенции, пластичности, зернистости и другим физическим свойствам [177, 178].

II. Состав триглицеридов растительных и животных жиров

Во второй части монографии рассматриваются теории строения природных триглицеридов, а также имеющиеся к настоящему времени сведения о триглицеридном составе жиров растений и животных. При описании этого состава приводится лишь минимально необходимое число цифровых данных конкретных анализов отдельных жиров; в подавляющем большинстве случаев состав жиров и масел определенных таксономических групп охарактеризован лишь диапазоном содержания тех или иных компонентов на основе результатов, полученных в разных лабораториях. Найденные экспериментальным путем данные о составе триглицеридов сопоставляются с величинами, вычисленными согласно различным теориям распределения ацилов.

ТЕОРИИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АЦИЛЬНЫХ ОСТАТКОВ В ТРИГЛИЦЕРИДАХ ПРИРОДНЫХ ЖИРОВ

Существующие теории строения природных триглицеридов изложены здесь в хронологическом порядке. Разные стороны вопроса о закономерностях строения жиров и масел освещены также в ряде обзоров и монографий [178, 180, 208, 212, 240, 258, 312, 368, 377, 423, 478, 558, 606, 646, 655, 667, 689, 769, 950, 955, 957].

Глава 9. НЕПОЗИЦИОННЫЕ ТЕОРИИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ

ТЕОРИЯ СТАТИСТИЧЕСКОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЙЛИ

В 20—30-х годах ХХ в. широкое распространение получила предложенная Бейли теория статистического распределения ацилов в триглицеридах, согласно которой вероятность образования индивидуального триглицерида определяется, с одной стороны, <\br> молярной концентрацией составляющих его жирных кислот в данном жире, а с другой — количественным содержанием этих кислот в данном триглицериде. При расчете статистического распределения исходят из того, что все кислоты, независимо от их природы, этерифицируют каждую из ОН-групп глицерина с одинаковой скоростью [922].

Еще Хилдитч в 1927 г. показал, что эта теория не отражает состава природных триглицеридов, поскольку найденные величины содержания тринасыщенных триглицеридов S₃ в изученных им жирах были много ниже вычисленных согласно статистическому распределению [364]. Также окончились неудачей попытки

Рис. 25. Зависимость типового состава триглицеридов от содержания насыщенных кислот в жире 1 — вычисление согласно равномерному распределению; 2 — вычисление согласно статистическому распределению

использовать статистическое распределение для описания глицеридного состава животных жиров и попытки применить видоизмененную форму этой теории — так называемое «частично-статистическое распределение» — для характеристики состава кукурузного масла [249, 646, 826].

Сейчас теория статистического распределения непосредственно служит лишь для расчета качественного состава продуктов переэтерификации (стр. 105). Тем не менее эту теорию необходимо рассмотреть подробнее, поскольку те или иные ее элементы входят в современные теории строения триглицеридов и поскольку на примере статистического распределения можно показать сложность глицеридного состава, даже если общее число жирных кислот в жире (n) невелико. При дальнейшем изложении термин «статистическое содержание триглицерида в жире» обозначает содержание этого триглицерида в мол%, вычисленное по уравнениям теории статистического распределения.

В любом жире, содержащем насыщенные (S) и ненасыщенные (U) кислоты, сумма их концентраций [S] + [U] = 100%. По правилам теории вероятностей [82] статистические концентрации триглицеридов типового состава S₃, S₂U, SU₂ и U₃ в таком жире выражаются соответствующими членами разложения бинома 10⁻⁴ × ([S]+[U])³ = 100%: [S]³ × 10⁻⁴ + 3[S]²[U] × 10⁻⁴ + 3[S][U]² × 10⁻⁴ + [U]³ × 10⁻⁴ = 100%. Для ряда жиров с различным [S] и со статистическим распределением ацилов отложение величин [S₃] в <\br> системе координат против соответствующих значений [S] дает график функции [S₃] = k × [S]³ (рис. 25); максимальные значения [S₂U] и [SU₂] при статистическом распределении в среднем не превышают 44,5% [517].

Общее число возможных триглицеридов (N) и число возможных одно-(N₁), двух-(N₂) и трехкислотных триглицеридов (N₃) стереовидового (с), позиционно-видового (п) и видового (в) состава (стр. 12), согласно теории статистического распределения (RD), составляет: (N)c = (N₁)c + (N₂)c + (N₃)c = n + 3n (n—1) + n(n—1) (n—2) = n³; (N)п = (N₁)п + (N₂)п + (N₃)п = n + 2n (n—1) + [n(n—1) (n—2)]/2 = [n² (n+1)]/2; (N)в = (N₁)в + (N₂)в + (N₃)в = n + n(n—1) + [n(n—1) (n—2)]/6 = [n(n² + 3n + 2)]/6. Эти уравнения справедливы для всех целых положительных значений n, кроме n = 1. Величины N, вычисленные для n = 2—7, приведены в табл. 14.

Таблица 14 Число возможных триглицеридов при статистическом распределении ацильных остатков

Уравнения для расчета статистического содержания триглицеридов упомянутых выше категорий (с, п, в; стр. 12) аналогичны уравнениям для типового состава. Рассмотрим жир, содержащий кислоты А, В, С, ... концентрации которых в жире составляют [A], [B], [C], ... Для всех категорий [AAA]RD = [A]³ × 10⁻⁴; концентрации двухкислотных триглицеридов для видового состава равны [A₂B]RD,в = 3 [A]²[B] × 10⁻⁴, а для позиционно-видового состава (ПВС) — ([AAB] + [BAA])RD,п = 2 [A]²[B] × 10⁻⁴ ([AAB]RD,п = [BAA]RD,п) и [ABA]RD,п = [A]²[B] × 10⁻⁴; концентрации трехкислотных триглицеридов для видового состава равны [ABC]RD,в = 6 [A][B][C] × 10⁻⁴, а для ПВС ([ABC] + [CBA])RD,п = 2 [А] × [B][C] × 10⁻⁴ ([ABC]RD,п = [CBA]RD,п). Коэффициенты 3 и 6 включены в уравнения видового состава для [A₂B] и [ABC] соответственно, поскольку для А, А и В возможны три, а для А, В и С — шесть различных перестановок. Если ([A]³ + [B]³ + ...) × 10⁻⁴ = v, а ([A]² + [B]² + ...) × 10⁻² = ω, то сумма концентраций однокислотных триглицеридов видового состава равна Σ (N₁)в = <\br> v, двухкислотных Σ (N₂)в = 3 (ω — v) и трехкислотных Σ (N₃)в = 100 — 3ω + 2v. Концентрация в жире двух- или трехкислотного триглицерида стереовидового состава равна произведению концентраций каждой из составляющих этот глицерид жирных кислот, умноженному на 10⁻⁴. Другие индивидуальные категории глицеридного состава (стр. 13) вычисляются аналогично.

ОСОБЕННОСТИ ТЕОРИИ РАВНОМЕРНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ХИЛДИТЧА

Многолетние работы Хилдитча впервые сделали возможным количественный анализ типового и видового состава природных триглицеридов и дали на этот счет много фактического материала, на основе которого возникла теория равномерного распределения ацилов в триглицеридах (1929 г.) [244, 364, 646].

Для анализа по Хилдитчу образец жира (100 г и более) окисляли несколько часов перманганатом в кипящем ацетоне. Окислительный разрыв двойных связей, не сопровождающийся разрывом сложноэфирных групп, приводил к тому, что S₂U-, SU₂- и U₃-глицериды превращались (при условии, что последняя двойная связь их ненасыщенных ацилов находится у девятого атома углерода) в кислые триглицериды, содержащие один, два или три остатка азелаиновой кислоты (S₂Az, SAz₂ и Az₃) соответственно. Неизмененные S₃-глицериды отделяли от кислых продуктов экстракцией щелочным раствором или хроматографией на Al₂O₃ и взвешивали. Окислительный анализ по Хилдитчу нельзя считать строго количественным (стр. 157) [312, 314, 363, 848].

Другим экспериментальным методом Хилдитча была дробная кристаллизация триглицеридов при пониженных температурах, которая давала приемлемые результаты для твердых жиров, например для масла какао, но для жидких масел оказалась менее надежной (стр. 99) [558, 658, 824].

Основной обнаруженный Хилдитчем факт состоит в том, что количество S₃ в жире обычно много ниже статистического: при [S] < 60—65% и числе атомов углерода (m) насыщенных кислот ≥ 16—18 в жире содержатся лишь следы S₃ [315, 363]. Согласно теории равномерного распределения, причина такого несоответствия заключается в ограничении синтеза простых (тринасыщенных) глицеридов до минимально возможной величины (см. ниже) и преимущественном образовании смешанно-кислотных триглицеридов; конкретной схемы биосинтеза эта теория не предлагает [312, 517]. Как видно, теория Хилдитча противоположна оставленной ныне однокислотной теории (стр. 10). В отличие от теории статистического распределения, охватывающей все возможные глицериды, теория Хилдитча рассматривает сравнительно небольшое число триглицеридов данного жира [258, 360, 667]; она обычно описывает лишь типовой состав глицеридов, не касаясь видо- <\br> вого состава. Известная непоследовательность состоит в том, что все S₃ считаются простыми глицеридами, хотя в любом жире содержится несколько видов насыщенных кислот [257, 558, 759].

Согласно теории равномерного распределения (рис. 25): 1) если [А] < 1/3 ([A] + [X]), то А образует только глицериды АХ₂ (X — другие жирные кислоты жира, кроме данной кислоты А) и встречается не в каждом глицериде жира; 2) если [А] ≈ 35%, то все глицериды жира принадлежат к виду АХ₂ (при А = Х и А ≠ Х); 3) если 65% > [А] > 35%, то многие или почти все глицериды жира принадлежат к виду А₂Х; 4) если [А] > 70%, то избыток А образует глицериды А₃, а остальные глицериды жира относятся к А₂Х [208, 368, 922].

Для приближенного расчета типового состава согласно равномерному распределению (Н) из [S] вычитают то количество насыщенных кислот, которое содержится в S₃. Из полученной величины вычисляют сумму [S₂U]H + [SU₂]H, принимая для этих концентраций максимально допустимые значения. Концентрацию U₃ определяют по разности [208, 646]. В гипотетическом двухкислотном жире, содержащем S и U (1 : 1), «равномерный» типовой состав равен: [S₃]H = 0, [S₂U]H = 50%, [SU₂]H = 50%, [U₃]H = 0 [258].

Приведем расчет видового состава жира растения Madhuca latifolia (стр. 184), содержащего три кислоты, в котором [S₃] = 0, [П] = 24,1%, [C] = 19,3%, [«О»] = [О] + [Л] = 56,6%. На первом этапе вычисления, исходя из предположения, что жир содержит только S₂U- и SU₂-триглицериды, определяют «первоначальные» концентрации П₂«О», П«О»₂, С₂«О» и С«О»₂. Очевидно, что [П₂«О»] + [П«О»₂] = [П] + {([«О»] × [П]) : ([П] + [C])} = 55,5%. Аналогично [С₂«О»] + [С«О»₂] = 44,5%. В то же время, из данных жирнокислотного состава [П] = [П«О»₂]/3 + 2[П₂«О»]/3) и [П«О»₂] + 2[П₂«О»] = 3 × [П] = 72,3%. Следовательно, [П₂«О»] = 72,3 — 55,5 = 16,8% и [П«О»₂] = 38,8%. Аналогично [С«О»₂] = 31,1% и [С₂«О»] = 13,4%.

Условия равномерного распределения (см. выше) не допускают существования в жире больших количеств П₂«О» и С₂«О», поскольку [«О»] > [П] + [С]. В то же время эти условия требуют образования максимально возможного количества трехкислотного глицерида П«О»С. Поэтому на втором этапе расчета ацилы, содержащиеся в П₂«О» и С₂«О», «перераспределяют» так, чтобы обеспечить максимальную концентрацию П«О»С в жире. При этом глицерид «С₂«О», «первоначальная» концентрация которого меньше, чем у П₂«О», целиком «расходуется» на образование П«О»С: [П«О»С]н = (2[C₂«О»]/3) × 3 = 2 [C₂«О»] = 26,8%. Остаток после «перераспределения» приходится на долю [П₂«О»]н = ([П₂«О»] + [С₂«О»]) — [П«О»С]н = (16,8 + 13,4) — 26,8 = 3,4%. Вычисленный и найденный кристаллизацией видовой состав триглицеридов M. latifolia (в вес. %) приведен ниже: <\br> | Триглицериды | П₂С | П₂«О» | П«О»С | С₂«О» | П«О»₂ | С«О»₂ | | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | | Вычислено | 1 | 3,4 | 26,8 | | 38,7 | 31,1 | | Найдено | 1 | | 27 | | 41 | 30 |

Аналогичный расчет был выполнен для содержащего три кислоты масла какао (стр. 181) [366, 824]. Для жиров с четырьмя видами кислот, например хлопкового и соевого масел, возможно только приближенное вычисление по Хилдитчу, поскольку число неизвестных больше числа независимых уравнений, и для расчета приходится вводить произвольное допущение [257, 860]. Для пятикислотных жиров (масло льна) нужно уже два допущения, а для более сложных жиров расчет по Хилдитчу вообще невозможен [312].

ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ ХИЛДИТЧА К ПРИРОДНЫМ ТРИГЛИЦЕРИДАМ

При оценке соответствия вычисленных данных найденным надо исходить из того, что приведенная выше схема равномерного распределения представляет собой не стехиометрическое правило, а лишь качественную закономерность строения природных жиров. По мнению Хилдитча, это строение из-за его сложности нельзя выразить строго математически (стр. 18) [759]. Практическое правило, использованное для описанного выше расчета, по предложению Ганстоуна получило название «широчайшего распределения» [312, 314]. Кроме того, при [S] или [U] > 70% вычисление состава триглицеридов согласно равномерному, статистическому или ограниченно-статистическому распределению иногда дает довольно близкие результаты [208].

Хилдитч считал, что природные жиры, содержащие в основном насыщенные и ненасыщенные кислоты с m = 16—18, независимо от [S] соответствуют (за небольшими исключениями) равномерному распределению, как это имеет место в упомянутом выше жире M. latifolia и в других твердых растительных жирах, анализ которых по методу Хилдитча проводился несколькими исследователями [315, 368, 646, 848].

На рис. 25 и 26 представлена зависимость содержания U₃, SU₂, S₂U и S₃ в природных жирах с различным [S] от концентрации насыщенных кислот в жире. Можно видеть, что график зависимости для типового состава 44 жиров, найденного методом кристаллизации (рис. 26), сходен с соответствующим графиком состава, вычисленного по Хилдитчу (см. рис. 25). В то же время найденные максимумы [S₂U]н и [SU₂]н (рис. 26) составляют только 80—90%, не достигая теоретической величины 100% (рис. 25) [368, 824, 860].

Применение окисления по Картха (стр. 157), а также современных хроматографических методов показало, что случаи соответствия природных жиров теории Хилдитча редки (стр. 184) [258, 819, 950]. Несовпадение глицеридного состава молочного <\br> Рис. 26. Содержание моно- (I), ди-(II) и тринасыщенных (III) триглицеридов в растительных жирах в зависимости от содержания насыщенных кислот 1—44 — номера жиров ([368], стр. 378)

жира (стр. 218) и жировых тканей жвачных (стр. 199) с данными своей теории Хилдитч пытался объяснить вторичными превращениями ацилов после их включения в триглицериды [244, 342, 805]. По наблюдениям Хилдитча, в S₃-глицеридах тех жиров, где [S₃] мало, преимущественно накапливаются кислоты с минимальным m; при [S] > 60% величина [S]/[U] для [S₂U] + [SU₂] + [U₃] равна 1,2—1,4, а в глицеридах вида А₂В (при [В] < [А] в суммарном жире) кислота В содержится главным образом в 2-положении [257, 360, 517].

Хилдитч впервые ввел в науку понятие о типах триглицеридов, обнаружил ограничение [S₃] и преобладающую роль смешанных глицеридов в жирах и показал, что биосинтез триглицеридов представляет собой направленный, а не статистический процесс [363, 368]. Все эти положения сохранили значение и в наши дни [606]. Однако при создании теории равномерного распределения состав жиров, особенно животных, был еще недостаточно изучен. Кроме того, о различиях между отдельными положениями глицеридов по жирно- <\br> кислотному составу ничего не было известно [558, 805]. Поэтому сейчас эта теория, оказавшая в прошлом значительное влияние на создание других теорий распределения, представляет главным образом исторический интерес [487]. Появление новых данных побудило Хилдитча представить новую схему биосинтеза триглицеридов (стр. 173), которая стала исходной точкой теории Ганстоуна [363].

МЕТОДИЧЕСКАЯ ОСНОВА ТЕОРИИ ОГРАНИЧЕННО-СТАТИСТИЧЕСКОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КАРТХА

К концу 40-х годов стало очевидным, что теории Хилдитча присущи крупные недостатки: несовершенство применявшихся при ее разработке методов окисления и кристаллизации (стр. 99), отсутствие биосинтетической схемы в ее основе и несоответствие вычисленных данных найденным [83, 360, 658]. В частности, при окислении по Хилдитчу, благодаря возникновению щелочи из КМnО₄, происходит значительный гидролиз остатков азелаиновой кислоты в азелаоглицеридах (стр. 45) и образуются моно- и диглицериды насыщенных кислот [110, 187, 608], что делает невозможным экспериментальное определение [S₂U], [SU₂] и [U₃] [342, 759, 950—955] и сильно завышает найденное значение [S₃] [470—478, 558].

Не ставя задачу полного установления видового состава и более сложных категорий, Картха в основном ограничился исследованием типового состава природных триглицеридов [23, 470—478], предложив трехступенчатую схему их анализа [606, 1007]: 1) [S₃] определяют как кристаллизацией, так и по температуре плавления (стр. 102) [658]; 2) триглицериды окисляют с образованием смеси S₃ и азелаоглицеридов (стр. 16) путем кипячения в 10 частях ацетона с избытком КМnО₄ при поддержании в растворе 3—6%-ной концентрации уксусной кислоты, которая подавляет гидролиз азелаоглицеридов (прибавление кислоты можно заменить пропусканием СО₂ через раствор) [95, 187]; 3) кислые азелаоглицериды, выделенные путем экстракции водной щелочью из эфирного раствора, фракционируют кристаллизацией их Mg-солей из водного раствора (при разделении продуктов окисления глицеридов лауриновой и миристиновой кислот для более полного осаждения применяют насыщенный раствор NH₄Cl) [258, 558]. Осадок содержит S₃, S₂Az, часть SAz₂ и непрореагировавшие S₂U, а фильтрат — большую часть SAz₂ и Az₃ [488].

Эта методика впервые позволила экспериментально установить типовой состав триглицеридов [824, 950—955]: [S₂U] и [SU₂] рассчитывали по соотношению [S₂Az] и [SAz₂] в осадке и по [S] в фильтрате, [S₃] было известно заранее, а [U₃] вычисляли по разности; расхождение между параллельными определениями, по утверждению Картха, не превышает 0,5% [266, 360—362, 470]. В модификации, предложенной Якубовым, [U₃] определяли периодатным окислением глицерина, полученного омылением Az₃ <\br> горячей водой, S₃ удаляли кристаллизацией, летучие продукты окисления отгоняли с водяным паром, а затем по числу нейтрализации устанавливали величину [S₂Az]/[SAz₂] [42].

Заметное влияние на достоверность всех окислительных методов оказывает число атомов углерода между последней двойной связью и карбоксилом в U-ацилах окисляемых триглицеридов. Когда это число не равно 9 (стр. 153), в вычисление надо вносить соответствующие поправки, основанные на среднем молекулярном весе дикарбоновых ацилов в «азелао»-глицеридах [485, 608]. Метод Картха был стандартизован только с очищенными кристаллизацией S₂U-глицеридами [487].

Независимая проверка метода Картха с синтетическими триглицеридами и метилолеатом, а также с чистыми препаратами S₂U и SU₂ показала, что наиболее надежна найденная величина [S₃]; значения [S₂U] и [U₃] обычно завышены, а для [SU₂], особенно при их высоком содержании, — несколько занижены по сравнению с истинными [226, 361, 362, 606]. Общая концентрация сложноэфирных групп после окисления заметно меняется. Это происходит, с одной стороны, за счет нейтральных производных азелаоглицеридов, которые образуются при ацилировании уксусной кислотой ОН-групп продуктов неполного окисления двойных связей и при этерификации свободных карбоксилов азелаоглицеридов и которые определяются вместе с S₃. С другой стороны, это вызывается частичным гидролизом SAz₂ и Az₃, который происходит при окислении (несмотря на присутствие уксусной кислоты) и при экстракции азелаоглицеридов водным раствором щелочи и приводит к заниженным найденным величинам [SU₂] [187, 494, 608, 609]. Таким образом, жесткое окисление и фракционирование по Картха, в отличие от метода Янгса (стр. 169), из-за многочисленных побочных реакций нельзя считать стехиометрическим, а сам метод является длительным и трудоемким [368, 480, 658, 824, 1007]. Однако метод Картха представляет собой определенный шаг вперед по сравнению с методом Хилдитча [342, 471, 478, 950—955].

БИОСИНТЕТИЧЕСКАЯ СХЕМА И РАСЧЕТ СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПО ТЕОРИИ КАРТХА

По гипотезе Картха, ограничение [S₃] (стр. 153) вызвано необходимостью сохранить запасной жир жидким при температуре тела теплокровных животных или, для других организмов, при температуре среды их обитания, без чего невозможна мобилизация жира под действием липазы (стр. 115) [342, 471, 658, 817]. Легкость поддержания S₃ в жидком состоянии пропорциональна их растворимости в ненасыщенной части жира, диспергирующему действию содержащихся в последнем поверхностно-активных веществ (фосфолипидов и др.) и находится в обратной зависимости от температуры плавления S₃ и величины m их ацилов. При m ≥ 16 [S₃] < <\br> [S₃]RD, а при m < 14 [S₃] не ограничивается и приближается к [S₃]RD [517, 558, 606]. Таким образом, [S₃]RD > [S₃] > 0 [474, 497]. Основываясь на факте невозможности гидролиза липазой твердых глицеридов и на гипотезе о возникновении природных триглицеридов из глицерина и жирных кислот благодаря постулированному им синтетическому действию липазы, Картха предположил, что прекращение синтеза S₃ задолго до достижения статистического (RD) содержания S₃ в жире связано с тем, что S₃ могут образовываться только до тех пор, пока фермент-субстратный комплекс находится в жидкой жировой фазе; отражением этого предела и является найденная величина [S₃] [259, 475, 819]. «Перераспределение» не использованных для синтеза S₃ насыщенных кислот ([S₃]RD — [S₃]) между SU₂ и U₃ на основе динамического равновесия ацилов вызывается двусторонним действием «синтезирующих липаз» и не обладает жирнокислотной или позиционной специфичностью [258, 478, 922]. Схема Картха полностью противоречит современным представлениям о биосинтезе триглицеридов [23, 368, 824, 950—956].

Согласно предложенной Картха теории ограниченного статистического распределения (1951 г.) [471], природный жир с характерным типовым составом триглицеридов возникает в результате статистического распределения насыщенных кислот, содержащихся в 1/3 ([S₃]RD — [S₃]), между ненасыщенными триглицеридами жира. Это распределение происходит таким образом, что новые S₃-триглицериды не образуются [368, 474, 922]. Вычисление типового состава по найденным кристаллизацией данным [S] и [S₃] проводится по уравнениям: [S₂U]к = [S₂U]RD + [S₃]RD — [S₃] + 3а; [SU₂]к = [SU₂]RD — 3а (а + b); [U₃]к = [U₃]RD — 3b, где а = 2 [SU₂]RD × ([S₃]RD — [S₃]) : (2 [SU₂]RD + [U₃]RD) и b = [U₃]RD × ([S₃]RD — [S₃]) : (2 [SU₂]RD + [U₃]RD); а и b представляют собой доли S, замещаемые ненасыщенными ацилами, в типах SU₂ и U₃ [477—479]. Например, в гипотетическом жире с [S]/[U] = 1 и [S₃] = 0 (стр. 154) 1/3 [S₃]RD распределяется между этими типами в отношении 2 : 1, давая типовой состав [S₂U]к = 58,4%, [SU₂]к = 33,3%, [U₃]к = 8,3% [258], а в масле какао с [S] = 62% и [S₃] = 2,5% (стр. 181) избыток [S₃]RD = 23,8 — 2,5 = 21,3% обменивается с [SU₂]RD и [U₃]RD пропорционально содержанию в них U, т. е. (26,8 × 2) : (5,5 × 3) или 16,3% : 5,0%. Обмен 16,3% [S₃]RD с [SU₂]RD дает 2 × 16,3 = 32,6% SU₂, а обмен 5% [S₃]RD с [U₃]RD дает 5% [S₂U] и 5% [SU₂]. Окончательный типовой состав масла какао, вычисленный по Картха, составляет: [S₃]к = 23,8 — 16,3 — 5,0 = 2,5%; [S₂U]к = 43,8 + 32,6 + 5,0 = 81,4%; [SU₂]к = 26,8 — 16,3 — 5,0 = 15,5%; [U₃]к = 5,5 — 5,0 = 0,5%; вычисленный состав близок к найденному (стр. 182) [824, 860, 950—955]. Формулы Картха применяли для вычисления типового состава триглицеридов на ЭВМ (стр. 174) [782]. Вычисленный по уравнениям Картха в интегральной форме суммарный типовой состав двух образцов бараньего жира, различающихся по [S] и <\br> Таблица 15 Типовой состав триглицеридов, вычисленный по теории ограниченного статистического распределения и найденный трехступенчатым методом Картха (в мол%)

• Обозначены латинскими названиями. ** Обозначены только русскими названиями; с — следы.

[S₃], совпал с составом, рассчитанным обычным способом для смеси (7 : 3) этих жиров (стр. 169) [488, 643].

По мнению Маркмана, избыток [S₃]RD обменивается с [SU₂]RD и [U₃]RD пропорционально концентрации последних, а не концентрации в них U. Поэтому вместо членов 3а, 3(а + b) и 3b в приведенных выше уравнениях Картха следует применять выражения ([S₃]RD — [S₃]) × [SU₂]RD : {([S₃]RD — [S₃]) + [U₃]RD}; ([S₃]RD — [S₃]) × ([SU₂]RD — [U₃]RD) : ([SU₂]RD + [U₃]RD) и [U₃]RD × ([S₃]RD — [S₃]) : ([SU₂]RD + [U₃]RD) соответственно [23, 42].

Хэммонд, основываясь на величине константы равновесия реакции обмена насыщенных ацилов, предложил для вычисления ограниченного статистического распределения следующие уравнения: [S₃]к + [S₂U]к + [SU₂]к + [U₃]к = 1; [S₂U]к = 3 ([S]/2 — [S₃]); [SU₂]к = 3 [S₃]; [U₃]к = 1 — [S₃] — (3 [S]/2), которые позволяют избежать получения отрицательных величин для [U₃]к, иногда появляющихся при расчете по уравнениям Картха [340, 341]. Ограниченно-статистический видовой состав триглицеридов вычисляется из рассчитанного или найденного типового состава и из концентраций в них отдельных видов насыщенных (¹S, ²S, ³S...) и ненасыщенных ацилов (¹U, ²U, ³U...):

[¹S₃]к = [S₃]к ([¹S] / [S])³; [¹S²S]к = [S₃]к 3 ([¹S] / [S])² ([²S] / [S]); [¹S²S³S]к = [S₃]к 6 ([¹S] / [S]) ([²S] / [S]) ([³S] / [S]); [S₂¹U]к = [S₂U]к ([S] / [S])² ([¹U] / [U]); [¹S²S¹U]к = [S₂U]к × 2 ([¹S] / [S]) ([²S] / [S]) × ([¹U] / [U]).

Аналогично вычисляют типовой состав в типах SU₂ и U₃ [950—955]. Для расчета видового состава триглицеридов по Хэммонду статистическое содержание данного вида триглицеридов умножают на статистическую концентрацию того типа глицеридов, в который входит данный вид, и полученное произведение делят на ограниченно-статистическую концентрацию того же типа триглицеридов [340, 957].

ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ КАРТХА К ТИПОВОМУ СОСТАВУ ПРИРОДНЫХ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Вычисленный по Картха типовой состав 27 жиров удовлетворительно соответствует найденному при помощи трехступенчатого метода Картха (табл. 15) [361, 471]. Совпадение с данными анализа других 46 жиров, полученных кристаллизацией по Хилдитчу, было хуже, возможно из-за недостатков этой методики. Совпадение значительно улучшается для жиров с малым [U₃], таких, как масло какао [208, 362, 368, 471]. Проверка показала, что состав растительных жиров (стр. 179) лучше описывается теорией Картха, чем состав животных жиров (стр. 198) [42, 110, 658, 773]. Если разные растительные жиры близки друг к другу по [S], но различаются между собой по средней длине цепи (m) содержащихся в них насыщенных ацилов, то типовой состав таких жи- <\br> ров различен. В непрерывном ряду глицеридных смесей, имеющем диапазон [S] = 1,4—85%, содержание насыщенных кислот с m = 16—18 при увеличении [S₃] снижается с 96% до 0, а содержание насыщенных кислот с m = 12—14, наоборот, возрастает с 0 до 90%. Для жиров, богатых кислотами с m = 12—14 ([S] > 80%, [S₃] ≈ [S₃]RD), и жиров, содержащих только кислоты с m = 16—18 ([S] < 25—30%, [S₃] ≈ 0) (стр. 186), результаты рас-

<\br> чета по Картха более или менее приближаются к статистическим. Уровень [U₃] в жирах с [S] = 25—50% также, по мнению Картха, мало отличается от статистического [478, 819, 922]. При [S₃] ≈ 0 и [S] < 30% вычисление типового состава по Картха, по Ганстоуну и по Вандер Валю дает близкие результаты; для твердых растительных жиров расчет по Картха лучше соответствует найденному, чем расчет по Ганстоуну (стр. 175), а для жидких жиров — наоборот [312, 471—476].

Если [S₃] ограничено (стр. 153), то и концентрации всех остальных типов, естественно, отличаются от статистических; ацилы избытка ([S₃]RD — [S₃]) «обмениваются» с SU₂, давая S₂U, и с U₃ с образованием SU₂ и небольшого количества S₂U, которое при расчете не учитывается [471, 950—957]. В результате обмена [S₂U]к > [S₂U]RD, [SU₂]к < [SU₂]RD и [U₃]к < [U₃]RD. В отличие от данных Хилдитча (стр. 155), допустимый максимум [S₂U]к = 80% наступает при [S] = 60%, а максимум [SU₂]к = 45% при [S] = 22—23% [368, 458, 558, 805]. Иногда при высоком содержании в жире насыщенных кислот с m = 16—18 ограничены не только [S₃], но и [S₂U] [258]. Косвенное подтверждение обмена ацилами Картха видит в одинаковом видовом составе S в S₂U- и SU₂-глицеридах при не слишком большом ограничении [S₃]; при [S₃]RD/[S₃] ≥ 10 высокоплавкие кислоты селективно исключаются из [S₃] [340, 472, 474—478].

Обнаруженные недавно закономерные отклонения найденного типового состава некоторых растительных жиров с [S] = 14—60% и [S₃] = 0 от вычисленного по уравнениям Картха связаны, по его мнению, с гетерогенностью состава триглицеридов, которая выражается в том, что в различных участках запасающей ткани семени отдельные ферментные системы образуют глицеридные смеси разного жирнокислотного состава [487—496]. В пользу такого предположения свидетельствует установленное несовпадение с теорией Картха смеси двух жиров с различным [S], каждый из которых соответствует этой теории. Обычно рассчитанные значения [S₂U]к и [U₃]к занижены по сравнению с найденными. Степень гетерогенности жира можно выразить «индексом гетерогенности» ИГ = [S₂U] — [S₂U]к. Использование [S₂U], а не [U₃], при расчете ИГ объясняется тем, что определение S₂U по Картха несколько точнее, чем определение [U₃].

В пределах одного семейства (например, Sapindaceae, Leguminosae), рода (Cassia), вида (Sesamum indicum) и даже одного и того же сортового биологического материала значение ИГ может изменяться. Величины индекса гетерогенности типового состава некоторых растительных жиров (в мол %) представлены ниже. В то же время при незначительной гетерогенности жира, например, у Myristica malabarica (ИГ = 1,8—2,6 ± 0,5 мол%), величины ИГ для одного сорта мало меняются даже при больших изменениях [S] и [S₂U] в разных географических зонах. Понятие гетерогенности, заставляющее с большей осторожностью распрост- <\br> ранять отдельные данные типового состава на все жиры данной таксономической группы, может сыграть важную роль в оценке реального значения современных теорий строения триглицеридов [487—496].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЗИЦИОННО-ТИПОВОГО СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПО ТЕОРИИ КАРТХА

В теории Картха ПТС в типах S₂U и SU₂ характеризуется «соотношением конфигурационных типов» (Configuration Type Ratio, CTR = [AAB]/[ABA]) [477, 957]. Вначале принималось, что в условиях динамического равновесия, возникающего при обмене ацилами, CTR может равняться 2, т. е. соответствовать статистическому, или же отклоняться от него [258, 477]. В дальнейшем представление о статистическом ПТС триглицеридов было опровергнуто данными липазного гидролиза, по которым у большинства триглицеридов в 2-положении преобладают U, а у свиного жира S (стр. 165) [312, 478, 695, 805, 952—955].

Не считая липазный метод достаточно надежным, Картха предложил собственную методику определения ПТС, состоящую в отщеплении Az-остатков в S₂Az и SAz₂ ацетоновым раствором К₂СО₃ и последующем окислении первичных ОН-групп образовавшихся ди- и моноглицеридов насыщенных кислот в течение 200 час. (!). Эта методика не была проверена на чистых препаратах и не испытывалась другими авторами [361, 362, 478, 482]. Кроме того, Картха оценивал возможный ПТС природных триглицеридов сравнением их с синтетическими по точке плавления и полиморфизму (стр. 136) [493]. Картха высказал предположение, что с увеличением числа различных видов S и U в S₂U- и SU₂-глицеридах соответственно величина CTR возрастает от 1 до 2; на этой основе был вычислен гипотетический ПВС для триглицеридов с [C] : [O] : [Л] = 1 : 2 : 1 или 2 : 1 : 1 и рассмотрены возможные значения CTR для девяти групп жиров различного состава [478, 606, 1006]. Согласно еще одной гипотезе Картха, отклонение ПТС от статистического вызвано участием в биосинтезе жира не одной, как в первоначальном варианте теории (стр. 158), а двух липаз: α-липазы, осуществляющей обратимое статистическое ацилирование 1,3-положений в основном насы- <\br> щенными кислотами, и β-липазы, которая необратимо связывает преимущественно U-кислоты; в результате [SUS]к и [SUU]к превышают статистический уровень. Эта биосинтетическая гипотеза, сходная с гипотезами многих других авторов (стр. 172) и названная «правилом В», объясняет ограничение [S₃] в триглицеридах и лучше отвечает экспериментальным данным Картха, чем более раннее «правило А», по которому α- и β-липазы лишены жирнокислотной специфичности [478, 482]. По «правилу В» содержание SUS в S₂U не может превышать 59—69%. Это противоречит теории Ганстоуна ([S₂U]G ≈ [SUS]G и [SU₂]G ≈ [SUU]G при [S] < 66%, стр. 171) и результатам изучения ПТС и ПВС природных жиров методом липазного гидролиза [312, 805, 819, 860].

На основе «правила В» Картха сформулировал «правило специфического ограниченно-статистического распределения»: в рассчитанные по Вандер Валю (VW) величины ПТС (стр. 168) вносится поправка, заключающаяся в статистическом распределении разности [S₃]vw — [S₃] между [SUU]vw и [UUU]vw с образованием SSU и USU соответственно. Вычисленный таким путем типовой состав глицеридов масла какао, пальмового масла и говяжьего жира был ближе к найденному, чем исходный расчет по Вандер Валю [458, 482, 483, 491, 922].

Таким образом, теория Картха, несмотря на то, что она базировалась на недостаточно разработанных методах эксперимента, довольно точно отразила типовой состав многих жиров, особенно твердых жиров растений, сформулировала ряд закономерностей, не утративших значения и сейчас, и послужила одним из источников современных позиционно-статистических теорий строения триглицеридов.

Глава 10. ТЕОРИЯ ПОЗИЦИОННО-СТАТИСТИЧЕСКОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ВАНДЕР ВАЛЯ

РАЗНОВИДНОСТИ СТАТИСТИЧЕСКОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АЦИЛОВ В ТРИГЛИЦЕРИДАХ

Обнаружение различий между отдельными положениями триглицеридов по жирнокислотному составу этих положений (позиционной специфичности триглицеридов) методом липазного гидролиза (стр. 120) заставило уточнить само понятие о статистическом распределении ацилов в отдельных положениях. Обычное статистическое распределение ([A]₁ = [A₂] = [A₃], стр. 151) можно также назвать 1,2,3-статистическим, поскольку один «пул» жирных кислот распределяется во всех трех положениях. Если имеются два пула жирных кислот разного состава, один из которых распределяется статистически в 1,3- (крайних), а другой — в 2-положениях ([A]₁ = [A₃] ≠ [A]₂), то распределение является 1,3-статистиче- <\br> ским, 2-статистическим. Наиболее общий случай представляет собой 1-статистическое, 2-статистическое, 3-статистическое распределение ([A]₁ ≠ [A]₂ ≠ [A]₃, [A]₁ ≠ [A]₃): в каждом положении, 1, 2 и 3-м, распределяется свой пул кислот, отличающийся по составу от двух других пулов [558, 641, 655, 956].

ТЕОРИЯ ВИДОИЗМЕНЕННОГО ОГРАНИЧЕННО-СТАТИСТИЧЕСКОГО ПОЗИЦИОННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЯНГСА

Установление специфичности состава отдельных положений триглицеридов способствовало пересмотру прежних данных, полученных окислением и кристаллизацией (стр. 99), согласно которым типовой состав большинства природных глицеридов более или менее близок к статистическому. На смену прежним теориям Хилдитча и Картха потребовалось создать теорию, объясняющую позиционную специфичность [208]. Первой попыткой в этом направлении была теория видоизмененного ограниченно-статистического позиционного распределения Янгса (Y) [1006].

По его мнению, последовательное статистическое ацилирование 1, 2 и 3-й ОН-групп глицерина приводит сначала к образованию смеси 1,2-диглицеридов, в которых S и U распределены статистически. Содержание SS-диглицеридов в этой смеси ограничено так, чтобы при дальнейшем ацилировании в 3-положении величина [S₃] (как и в механизме Картха, стр. 159) не превысила найденную. Позиционная специфичность будущих триглицеридов определяется уже на стадии диглицеридов. Она вызывается интрамолекулярной ацильной миграцией в SU- и US-1,2-диглицеридах, сходной с наблюдаемой при переэтерификации in vitro (стр. 105). Миграция направлена в сторону образования изомера, наиболее пригодного для биосинтеза данного жира. Таким изомером для первой группы жиров, включающей все растительные и животные жиры, кроме свиного, служит SU-диглицерид, а для второй группы, включающей только свиной жир (стр. 207), — US-изомер [67]. В результате миграции, при которой устраняется менее пригодный изомер диглицеридов, и статистического ацилирования третьей ОН-группы эквивалентной смесью S и U в первой группе [SUS]Y/[SSU]Y = 2 и [SU₂]Y = [SUU]Y, а в свином жире [S₂U]Y = [SSU]Y и [USU]Y/[SUU]Y = 2.

Следовательно, при миграции в триглицеридах, с одной стороны, сохраняется исходный статистический или ограниченно-статистический типовой состав, а с другой — возникает специфический ПТС. Путей образования специфического ПВС теория Янгса не указывает. Ее схема биосинтеза не основана на каком-либо из известных ферментативных механизмов.

Приведем расчет ПТС по Янгсу на примере пальмового масла ([S] = 50%, [S₃] = 8,5%). При статистическом образовании диглицеридов [SS]RD = (50%)² = 25%; [SU]RD = 2 (50%) <\br> Схема биосинтеза триглицеридов в жирах первой группы по Янгсу где: I — глицерин; II — моноглицериды; III — диглицериды; IV — триглицериды.

(50%) = 50%; [UU]RD = 25%. Ограниченно-статистическая величина [SS]Y = 17%, а остальное количество SS (8%) «обменивается ацилами» с 8% UU, давая [SU]Y = 2(8%) + 50% = 66%; остаток [UU]Y = 17%. ПТС триглицеридов пальмового масла (в вес %), «возникших» при ацилировании указанных количеств 1,2-диглицеридов (см. выше), был следующим.

Для пальмового масла, а также для свиного жира вычисление ПТС по Янгсу совпадает с расчетом по Вандер Валю (стр. 168) и с ПТС, найденным окислительным методом Янгса (стр. 170) [258]. Поскольку, однако, жиры цыпленка, крысы, масла льна и какао лучше соответствовали теории Вандер Валя, Янгс признал, что его теория несовершенна и присоединился к теории Вандер Валя [1007]. С теорией Янгса сходна предложенная Цуда «теория упорядоченного распределения», согласно которой S распределяются в 1,3- и 2-положениях, а оставшиеся ОН-группы заполняются затем U-ацилами. По результатам расчета ПТС масел кукурузы и какао эта теория совпадает с теорией Вандер Валя [943].

БИОСИНТЕТИЧЕСКАЯ СХЕМА И РАСЧЕТ СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПО ТЕОРИИ ВАНДЕР ВАЛЯ

Вандер Валь и одновременно с ним Колман предположили, что причина позиционной специфичности всех природных жиров заключена в 1,3-статистическом, 2-статистическом механизме биосинтеза триглицеридов (стр. 164) и что, следовательно, их 1- и 3-положения эквивалентны по всем показателям [211—213, 953—957]. При биосинтезе жиров первой группы (стр. 165) пул кислот, ацилирующих 2-положение глицерина, содержит ненасыщенные кислоты с m = 18 и небольшое количество насыщенных кислот, а пул жирных кислот, ацилирующих затем крайние положения, обогащен насыщенными кислотами. В качестве альтернативного механизма Вандер Валь предлагает позиционно-специфичную ацильную миграцию в уже образовавшихся триглицеридах, сходную со схемой Янгса [258, 953—957]. Все эти предположения являются, конечно, чисто умозрительными, а эквивалентность состава 1- и 3-положений опровергается современными данными (стр. 178) [606, 655].

Гипотеза Вандер Валя сочетает в себе некоторые черты прежних теорий строения глицеридов [312, 368]: обнаруженная Хилдитчем тенденция равномерного распределения (стр. 153) отражает преимущественное сродство U-ацилов к 2-положению, приводящее к тому, что S₃ могут появиться в жире только при [S] > 66%; в то же время приближение найденного типового состава многих жиров к статистическому отражает статистическое распределение ацилов в 2- и 1,3-положениях [259, 269]. Возможно, что преимущественное содержание U-ацилов в 2-положении служит биологической защитой против их химического окисления, которое обычно ускоряется при нарушении исходного строения жира в результате переэтерификации (стр. 105). Интересно, что это ускорение выражено сильнее для масла какао, нормально почти не содержащего U в 1,3-положениях, чем для жидких масел, где в этих положениях много ненасыщенных ацилов [808].

Теория Вандер Валя противоречит современным представлениям о биосинтезе триглицеридов через L-глицеро-3-фосфат с промежуточным образованием 1,2-диглицеридов; однако расчет на основе предположения о 1,2-статистическом, 3-статистическом механизме биосинтеза хуже согласуется с найденными данными, чем вычисление по Вандер Валю. Возможность превращения 1,2-диглицеридов в 1,3-изомеры перед замещением последней ОН-группы еще не исследована [558, 781, 839].

Для расчета ПТС и ПВС по Вандер Валю (VW) использовали величины [А]₁,₃ и [А]₂, найденные по данным липазного гидролиза триглицеридов (стр. 116) [84, 207—213, 953—957]. Надежность расчета определяется как точностью самого метода (стр. 117), так и достоверностью исходных постулатов теории [368, 462, 907]. В отличие от Ганстоуна (стр. 175), Вандер Валь учитывал при вы- <\br> числении небольшие величины [S]₂, найденные при липазном гидролизе [312, 606, 931].

Расчет числа статистически возможных триглицеридов был рассмотрен ранее (стр. 152). В табл. 16 приведены формулы для расчета числа триглицеридов позиционно-видового состава при распределении по Вандер Валю N_p (β — число видов ацилов жирных кислот, содержащихся только в 1,3-положениях триглицеридов данного жира) [46, 312, 355]. Можно видеть, что число возможных при 1,3-статистическом, 2-статистическом распределении триглицеридов меньше, чем при 1,2,3-статистическом [558, 559].

Для расчета содержания каждого триглицерида в жире было предложено несколько способов. Первоначальный способ вычисления ПТС из [S]₁₃ и [S]₂ [953] здесь подробно не излагается; он оказался довольно сложным и вскоре был заменен более простым методом расчета, который можно продемонстрировать на примере того же пальмового масла (стр. 165) с [S]₂ = 20% и [S]₁,₃ = 65% (табл. 17) [207, 208, 953—957]. Полученный ПТС близок к данным Янгса (см. выше). Те же данные ПТС, а также данные ПВС можно получить при помощи простых уравнений:

[ABA]vw = [A]₁,₃²[В]₂ × 10⁻⁴ для А = В и А ≠ В, (1) [AAB]vw = 2 [A]₁,₃[A]₂[B]₁,₃ × 10⁻⁴, (2) [ABC]vw = 2 [A]₁,₃[B]₂[C]₁,₃ × 10⁻⁴. (3)

Для гипотетического жира ([S]/[U] = 1 и [S]₂ = 0) рассчитанный по Вандер Валю типовой состав ([S₂U]vw = 56,25%, [SU₂]vw = 37,5%, [U₃]vw = 6,25%) близок к вычисленному по Картха (стр. 159) [258]. Третий способ расчета по Вандер Валю позволяет определить ПТС из [S] и [S₃] без помощи липазы, так как в подавляющем большинстве жиров при отклонении от 1,2,3-статистического правила [S]₂ уменьшается на [X], [U]₂ увеличивается на [X] и состав в 1,3-положениях изменяется соответственно (Х — разность между статистическим значением ([S]₂)RD и найденной величиной [S]₂). Поскольку обычно [S]₁₃ — [X] < [S]₂, то для всех жиров,

Таблица 16 Формулы для вычисления числа возможных триглицеридов по теории Вандер Валя

кроме свиного (стр. 165) [67], [S]₁,₃ = [S] + [X] / 2, [S]₂ = [S]₂ — [X], [U]₁,₃ = [U] — [X] / 2, [U]₂ = [U] + [X]. Для вычисления ПТС достаточно подставить эти значения [S]₁,₃, [S]₂, [U]₁,₃ и [U]₂ в приведенные выше уравнения (1) и (2); величину [X] предварительно определяют из кубического уравнения для [SSS], которое лучше решать графически [953—957].

Вычисление ПТС масла льна и жира цыпленка всеми тремя способами на ЭВМ дало одинаковые результаты [781, 782]. Уравнения Вандер Валя пригодны для расчета ПВС триглицеридов и в тех тканях, которые в разных участках имеют различный качественный и количественный состав жирных кислот [172]. Так, вычисления ПВС жира плодовой оболочки Myrica carolinensis, имеющего плавный градиент [А]₁,₃ и [А]₂ в направлении поверхности (положительный для пальмитата и отрицательный для миристата), и ПВС смеси равных количеств двух пальмовых масел, одинаковых по набору, но разных по концентрации отдельных кислот, проведенные по второму способу в интегральной форме, показали, что практически аналогичные результаты можно получить и обычным вычислением по Вандер Валю для суммарной пробы всей ткани или смеси двух жиров [350, 643].

ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ ВАНДЕР ВАЛЯ К ПРИРОДНЫМ ТРИГЛИЦЕРИДАМ

Для оценки достоверности рассчитанных по Вандер Валю ПТС и ПВС и для уверенной идентификации в жире триглицеридов, вычисленные концентрации которых составляют <1%, расчет обычно проверяют независимыми методами анализа [84, 672, 781, 955, 995]. Достоверность ПТС устанавливали окислительным методом Янгса: жир окисляли смесью КМnO₄-KJO₄ <\br> по Рудлоффу с образованием смеси S₃ и азелаоглицеридов по той же схеме, что и в методиках Хилдитча и Картха (стр. 153). Продукты окисления разделяли хроматографией на фракции S₃ + S₂Az и SAz₂ + Az₃, молярные доли которых обозначали х и 1 — х соответственно. Эти фракции подвергали липазному гидролизу с последующим газохроматографическим анализом возникших при гидролизе моно- и дикарбоновых кислот (для расчета типового состава проведение гидролиза излишне) [913, 957, 1007]. В дальнейшем распределительную хроматографию Az-глицеридов (стр. 45) заменили их противоточным распределением, а затем газо-жидкостной хроматографией их метиловых эфиров (стр. 95), причем оба хроматографических метода совпали в пределах 1% [208, 332, 913]. Недостатки метода Янгса — это возможность гидролиза глицеридов при окислении и расчет состава 1,3-положений по данным состава кислот, отщепляемых липазой, а не по данным жирнокислотного состава 2-моноглицеридов (стр. 118). Однако этот метод дал хорошие результаты при проверке на синтетической смеси ОПП + ООП и вообще по надежности оказался несравненно выше прежних методов Хилдитча и Картха [558, 606, 839, 907].

Приведем для примера результаты анализа свиного жира по Янгсу [67]. Величины [S]₁₃ и [S]₂ (в мол %) в ПТС, рассчитанном по Вандер Валю, и во фракциях (S₃ + S₂Az) и (SAz₂ + Az₃) составляли соответственно 43 и 29,2; 73,1 и 60; 27,6 и 12,8. Соотношение фракций вычисляли по уравнению 73,1x + 27,6 (1 — x) = 43,4, откуда х = 0,347. Типовой состав и ПТС рассчитывали соответственно по величинам [S]₁₃ и [S]₂ во фракциях, используя найденное значение х. Из найденного ПТС [S]₂ = 43,7 и [S]₁,₃ = 29,0, что хорошо совпадает с [S]₂ и [S]₁,₃ в ПТС, вычисленном по Вандер Валю [954, 1006, 1007].

Для полуколичественной проверки рассчитанного по Вандер Валю типового состава полученные по Янгсу азелаоглицериды превращали реакцией их Ag-солей с 3-йодпропаном в аллиловые эфиры S₂Az, SAz₂ и Az₃, содержащие соответственно одну, две и три двойные связи; эти производные разделяли на пластинках с Ag⁺ (стр. 38) и содержание отдельных типов определяли по площади пятна [958].

Наиболее распространенным способом проверки ПВС и других индивидуальных категорий состава, вычисленных по Вандер Валю, служит сейчас препаративная тонкослойная хроматография с ионами Ag⁺ (стр. 47) [88, 319, 464, 837] в сочетании с газо-жидкостной хроматографией триглицеридов (стр. 89) [462, 635, 914] или метиловых эфиров жирных кислот во фракциях с определенным е и с липазным гидролизом этих фракций [107, 318, 463]. Абсолютная ошибка перечисленных комбинированных методов (см. табл. 1) может составлять не более 0,7% [105, 560].

Проверка независимыми методами обнаружила ряд заметных отклонений от теории Вандер Валя, вызванных, возможно, отсутствием статистического распределения ацилов в пределах одного <\br> положения (стр. 176) [558], неэквивалентностью жирнокислотного состава в положениях 1 и 3 (стр. 178) [617] или нарушением позиционной специфичности липазного гидролиза для жиров с необычным составом кислот (стр. 117) [318, 915]. Однако в той мере, в какой вообще можно математически описать сложный процесс биосинтеза триглицеридов, теория Вандер Валя пока превосходит другие теории распределения по степени соответствия вычисленных результатов состава обычных триглицеридов C₁₆—₁₈-жирных кислот из животных и растительных тканей, найденным [208, 782]; липазный гидролиз в сочетании с хроматографией является простым, быстрым, достаточно точным и не требующим сложного оборудования способом определения этого состава [207, 957]. Путем расчета по теории Вандер Валя установлено, что ПТС и ПВС исследованных до сих пор глицеридов, как правило, не соответствуют статистической теории [211—213, 953]. В дальнейшем теория Вандер Валя послужила одним из элементов более «догматического» варианта позиционного распределения, выдвинутого Ганстоуном [312, 955].

Глава 11. ТЕОРИИ ПОЗИЦИОННО-СТАТИСТИЧЕСКОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГАНСТОУНА И БРОКЕРХОФА

СХЕМА БИОСИНТЕЗА И РАСЧЕТ СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПО ТЕОРИИ ГАНСТОУНА

Теория Ганстоуна (1962 г.) описывает типовой и видовой состав только растительных триглицеридов [312]. Она принадлежит к позиционным теориям, как и теория Вандер Валя, но представляет собой более общий случай 1,3-статистического, 2-статистического распределения, не требуя проведения липазного гидролиза данного исследуемого жира, а ограничиваясь для расчета лишь сведениями о типовом или видовом жирнокислотном составе последнего [208, 368, 782].

Это упрощение стало возможным после обнаружения резкой позиционной специфичности триглицеридов растений (стр. 179) [702]: кислоты первой категории (АI), включающие большинство насыщенных кислот, а также ненасыщенные кислоты с m > 18 (например, 20 : 1, 22 : 1) сосредоточены почти полностью в 1,3-положениях, а 2-положения даже при [U] = 37—38% на 95—100% заняты ненасыщенными кислотами с m < 18 — олеиновой, линолевой, линоленовой и другими, образующими вторую категорию (АII), для которой, следовательно, величина Н (стр. 116) обычно гораздо выше, чем для кислот первой категории [317, 318, 957]. В 49 маслах близкое к статистическому распределение АII <\br> Рис. 27. Теоретическая (1) и найденная (2) зависимости между содержанием олеиновой (а), линолевой (б) и линоленовой кислоты (в) в жирных кислотах II категории, этерифицированных во втором положении, и содержанием каждой из этих кислот в сумме жирных кислот II категории всего жира для 40 различных растительных масел

в положениях, не заполненных АI, показали графически, откладывая для каждой АII-кислоты (О, Л, Ле и др.) «теоретические» величины (например, 100[Л]/Σ[AII]) против значений, найденных при гидролизе масел (например, 100 [Л]₂/Σ[AII]₂; здесь Σ[AII] и Σ[AII]₂ обозначают содержание суммы кислот второй категории в жире и в 2-положении триглицеридов соответственно) (рис. 27). Можно видеть, что «теоретическая» кривая удовлетворительно соответствует найденной, хотя полного совпадения и не наблюдается (стр. 176) [105, 322, 702].

Теория Ганстоуна базируется на умозрительной гипотезе Савари и Денюэлля о двух позиционно-специфичных ферментах биосинтеза (стр. 164) [848], согласно основному варианту которой

Таблица 18 Формулы для расчета типового состава триглицеридов по Ганстоуну (в вес %)

Рис. 28. Зависимость типового состава триглицеридов от содержания насыщенных кислот в жире 1 — вычислено по «теории 2 и 3» Ганстоуна; 2 — вычислено по «теории 1» Ганстоуна

ются только при [S] > 66% [211, 368]. Другие два варианта теории Ганстоуна сейчас оставлены; согласно «теориям 2 и 3», сначала одна из крайних ОН-групп замещается соответственно кислотами второй или первой категории, а затем 1,2(2,3)-положения этерифицируются всеми оставшимися в каждом случае кислотами [208, 606, 957].

Для расчета типового состава триглицеридов по [S] имеются формулы, приведенные в табл. 18 [208, 312, 317]. Эти уравнения

Таблица 19 Формулы для расчета видового состава триглицеридов по Ганстоуну

Рис. 30. Зависимость позиционно-типового состава триглицеридов растительных жиров от содержания насыщенных кислот в жире 1 — вычислено по видоизмененным уравнениям Вандер Валя (стр. 168); 2 — вычислено для восьми жиров по данным липазного гидролиза

использовались для вычисления глицеридного состава на ЭВМ при помощи машинного языка FORTRAN [782]. График типового состава в зависимости от [S], вычисленный по «теории 1» Ганстоуна (G), приведен на рис. 28. Вычисление ПТС в «теории 1» исключается, поскольку при [S] < 66% [S₂U]G = [SUS]G, а [SU₂]G = [SUU]G. Для вычисления видового глицеридного состава жиров, содержащих различные виды насыщенных (¹S, ²S, ³S...) и ненасыщенных кислот (¹U, ²U, ³U...), служат уравнения, приведенные в табл. 19 {x = (3[S]/20)² при [S] < 66%; x = 3[U]² при [S] > 66%} [312].

Согласно «теории 1», при [S] < 66% величина [S]₂ = 0. Однако в возникающих при липазном гидролизе 2-моноглицеридах всегда содержится небольшое (5—10%) количество S, которое нельзя считать артефактом. Для 48 растительных жиров [S]₂ ≈ 0,1 [S] (рис. 29) и, следовательно, [U]₂ = 100 — 0,1 [S], [S]₁,₃ = 1,45 [S] и [U]₁,₃ = 100 — 1,45 [S]. Эти значения [S]₂, [U]₂, [S]₁,₃ и [U]₁,₃ можно использовать для вычисления ПТС по уравнениям Вандер Валя (стр. 168). Вычисленные данные (рис. 30) удовлетворительно совпадают с результатами липазного гидролиза восьми жиров тропических растений с [S] = 27—90% [211].

ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ ГАНСТОУНА К ПРИРОДНЫМ ТРИГЛИЦЕРИДАМ

Результаты расчета типового и видового состава глицеридов по Ганстоуну сравнивали с данными, полученными при помощи старых методов кристаллизации и окисления и новых методов про- <\br> тивоточного распределения (стр. 47), кристаллизации из раствора AgNO₃ в метаноле (стр. 103), липазного гидролиза и др. (см. табл. 1) [317—319, 702]. Старые аналитические данные удовлетворительно совпадали для жиров с [S] = 20—45% и [S] = 55—80%; для жидких масел из-за несовершенства старых методов совпадение было хуже [312, 321—323]. Современные методы, как и в случае теории Вандер Валя, обычно дают более или менее близкое соответствие для большинства растительных жиров (стр. 179) [105, 782].

Наблюдаемые отклонения вызываются, помимо гетерогенности материала (стр. 162), также тем, что в расчет не приняты величины [S]₂ > 0 (стр. 174) и влияние m насыщенных кислот на [S₃] и [S₂U] [211, 740]. Так, в ряде жиров с [S] = 20—50%, в которых длина цепи большинства S < 16, [SU₂]G превышает теоретически допустимый предел, равный 50% (см. рис. 28) и достигает 68%. Для 23 жиров с [S] = 20—45% вычисленные величины [SU₂]G были в среднем на 12% ниже найденных с минимумом в 37%; заниженные значения [SU₂]G обнаруживались и при расчете жидких масел (стр. 190). В то же время для вычисленных величин [S₂U]G в жирах с [S] = 55—80% средние отклонения составляли +7% с максимумом +34% [208, 368]. Возможно также, что одной из причин этих отклонений является стереоизомерия (стр. 178) [105].

Несмотря на имеющиеся отклонения, можно считать, что теория Ганстоуна пригодна для описания растительных глицеридов и при вычислении состава без использования данных липазного гидролиза дает более достоверные результаты, чем другие теории [208, 318]. В применении к жирам растений эта теория в известной мере объединяет существующие теории строения — теорию Хилдитча и отдельные виды позиционного и статистического распределения [317]. Из-за ограничения [S₃] (стр. 154) расчет по «теории 1» при [S] > 66% и по «теориям 2 и 3» при любом [S] совпадает по результатам с расчетом по Хилдитчу. По результатам вычисления типового состава глицеридов с [S] = 33—66% теория Ганстоуна занимает промежуточное положение между теорий Хилдитча и статистическим распределением, а для жидких масел с высоким Σ[AII] — приближается к последнему [312, 368].

Ограничение [S₃] и отсутствие липазного гидролиза сближает теорию Ганстоуна с теорией Картха: для глицеридов с [S] = 55—80% обе теории близки по результатам расчета. Однако данные типового состава твердых растительных жиров, вычисленные по Картха, лучше соответствуют найденным, чем рассчитанные по Ганстоуну (стр. 162) [486]. При [S]₂ = 0 теории Ганстоуна и Вандер Валя совпадают по данным расчета, а при [S]₂ ≥ 0 несколько различаются между собой (стр. 167) [322]. В последнем случае найденным результатам лучше соответствует то теория Вандер Валя, то теория Ганстоуна; недостатком последней можно считать ее неприменимость к животным жирам [105, 782].

ОСОБЕННОСТИ ПОЗИЦИОННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ II КАТЕГОРИИ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТРИГЛИЦЕРИДАХ

Сначала считалось, что АII не различаются между собой по сродству к 2-положению. Однако уже данные рис. 27 показали, что «найденная» кривая для [Л]₂ лежит на 10% выше, а кривая для [О]₂ — на 10% ниже «теоретической». Величину сродства можно охарактеризовать так называемым «фактором обогащения» (enrichment factor, EF = [A]₂/[A]); при 0 > EF > 1 (пальмитиновая, стеариновая, эйкозеновая, докозеновая) кислота находится главным образом в 1,3-, а при EF = 1—3 (линолевая, олеиновая, линоленовая) — преимущественно в 2-положениях [317]. Между EF и введенной ранее величиной Н (стр. 116) имеется связь (EF = — 0,03H). В большинстве растительных жиров линолевая кислота превосходит олеиновую и линоленовую по EF. Интересно, что на общем фоне преобладания АII и особенно линолевой кислоты в 2-положениях S₂U-глицериды многих растительных масел, судя по значению EF, обогащены по сравнению с триглицеридами других типов стеариновой и олеиновой кислотами, SU₂-глицериды — пальмитатом и линолеатом, а U₃ — олеатом [208, 320].

По EF трудно сравнивать позиционную специфичность одних и тех же кислот в маслах с разным Σ[AII]; эти различия сильно сглаживаются при использовании «фактора селективности» SF = ([A]₂/[Α]) : (Σ[ΑII]₂/Σ[ΑII]), где А — отдельная кислота II категории. Как и для EF, при SF < 1 «найденные» [A]₂ лежат ниже, а при SF > 1 — выше «теоретической» кривой (см. рис. 27). В подавляющем большинстве из исследованных 49 полувысыхающих и 15 высыхающих масел обычного жирнокислотного состава линолевая кислота по величине SF стоит на первом месте, олеиновая — на втором, а линоленовая — на третьем [316, 319]. Исходя из понятия SF, можно без помощи липазного гидролиза вычислить ПВС масел сои, льна и сафлора, хорошо совпадающий с найденным. Для расчета сначала распределяли статистически в 1,3-положениях Σ[AII], затем таким же образом между всеми тремя положениями распределяли [О] + [Ле] и, наконец, остальные еще не занятые места заполняли линолевой кислотой [268].

Предположив, что позиционная специфичность липазы сохраняется независимо от числа атомов углерода и от числа, положения и конфигурации двойных связей, аналогичный расчет SF провели для жиров, содержащих необычные жирные кислоты. В «эруковых» маслах (стр. 184) олеиновая и линоленовая были равны по SF, но уступали в этом отношении линолевой кислоте. В глицеридах, богатых 16 : 1 кислотами, независимо от положения двойной связи в последних, SF 18 : 2 составлял 1,6—1,8, 18 : 1 — 1,0—1,1, а 16 : 1 — 0,4—0,8. Для масел зонтичных и масла Bombicopsis glabra характерны одинаково высокие значения SF линолевой, олеиновой, петрозелиновой и стеркулиновой кислот. Необыч- <\br> ным распределением отличаются 18 : 3 кислоты с сопряженными связями: 9-цис, 11-транс, 13-транс и 13-цис-изомеры и 8-транс, 10-транс, 12-цис-изомер из масла Calendula officinalis по SF равны олеиновой кислоте, причем первые два изомера уступают линолевой, а последний значительно превосходит ее; 9-транс, 11-транс, 13-цис-изомер распределяется как кислота І категории. Содержащаяся в масле Oenothera γ-линоленовая кислота по величине SF выше олеиновой, которая в свою очередь превосходит здесь по SF линолевую. Аналогичная закономерность найдена для γ-линоленовой кислоты и цис-6,9,12,15-октадекатетраеновой кислоты в маслах сем. Бурачниковых. Предварительные данные определения SF различных жирных кислот приведены ниже.

Из этих данных как-будто бы следует, что наибольшим сродством к 2-положению отличаются незаменимые жирные кислоты (линолевая, γ-линоленовая) или кислоты, близкие к ним по строению (8-транс, 10-транс, 12-цис-октадекатриеновая и цис-6, 9, 12, 15-октадекатетраеновая). Установление селективности включения отдельных АII кислот в 2-положение триглицеридов впервые позволило выйти за рамки 1,3-статистического, 2-статистического распределения, что следует расценить как крупную заслугу теории Ганстоуна [316].

ТЕОРИЯ ПОЗИЦИОННО-ОГРАНИЧЕННОГО 1-СТАТИСТИЧЕСКОГО, 2-СТАТИСТИЧЕСКОГО, 3-СТАТИСТИЧЕСКОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ БРОКЕРХОФА

Изучение стереовидового состава глицеридов химическими методами показало, что триглицериды всех исследованных растительных масел (стр. 179) и особенно животных жиров (стр. 198) являются асимметрическими [130, 140, 144, 617, 739]. Для объяснения асимметрии стереовидового состава Брокерхоф предложил теорию позиционно-ограниченного 1-статистического, 2-статистического, 3-статистического распределения ацилов (Br), согласно которой концентрация любого триглицерида [ABC]Br = [A]₁[B]₂[C]₃ × 10⁻⁴ при А = В = С или А ≠ В ≠ С и А ≠ С и при [А]₁, [В]₂ и [С]₃, равных любому числу >0 и <100 [146, 212, 642].

Как примирить экспериментально доказанную стереоспецифичность природных триглицеридов с теорией Вандер Валя, <\br> основанной на предположении [105, 642] об эквивалентности жирнокислотного состава 1- и 3-положений? Вандер Валь указывает, что совпадение вычисленных и найденных данных ПТС и ПВС вовсе не исключает наличия энантиоморфных форм в жире; даже заметное нарушение эквивалентности [S] и [U] в крайних положениях гипотетических глицеридных смесей (см. ниже) мало отражается на вычисленном ПТС (в вес %) [957].

То же самое было показано экспериментально: расчет ПТС триглицеридов подкожной жировой ткани человека (стр. 207) с применением уравнений Вандер Валя, сначала по данным стереоспецифического анализа, обнаружившего значительные различия между [А]₁ и [А]₃ для отдельных видов кислот, а затем с использованием величин ([A]₁ + [А]₃) : 2 для каждого вида кислоты дал почти идентичные результаты [212]. Таким образом, самый последний вариант позиционных теорий — теорию позиционно-ограниченного 1-статистического, 2-статистического, 3-статистического распределения, предложенную Брокерхофом, следует рассматривать не как отрицание теории Вандер Валя, а как ее дальнейшее развитие [146].

Обнаружение асимметрии природных жиров доказывает, что ацилирование положений 1 и 3 в триглицеридах находится под различным метаболитическим контролем. Можно предположить, что асимметрические триглицериды возникают на основе оптически активного L-глицеро-3-фосфата путем замещения его 3-положения из иного жирнокислотного пула, чем для остальных положений. В пользу такой гипотезы свидетельствует присутствие стереоизомерных триглицеридов в тех животных тканях, в которых активен только глицерофосфатный путь биосинтеза, например в печени крысы (стр. 213). В то же время триглицериды жировых тканей птиц и некоторых морских рыб и беспозвоночных, образованные путем нестереоспецифического ацилирования оптически не активных 2-моноглицеридов в слизистой кишечника и отражающие, следовательно, 2-моноглицеридную структуру жиров рациона (стр. 222), отличаются почти полной симметрией в положениях 1 и 3 [144, 617, 882].

СОСТАВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ

Глава 12. СОСТАВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ОБЫЧНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ИЗ ПЛОДОВ И СЕМЯН

ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА РАСТИТЕЛЬНЫХ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

По объему мирового производства и по степени изученности жирнокислотного и триглицеридного состава растительные жиры значительно превосходят жиры животного происхождения. Жиры большинства растений представляют собой жидкие масла, включающие главным образом ацилы линолевой, олеиновой и пальмитиновой кислот, к которым можно добавить еще стеарат и линоленат. Однако иодное число триглицеридов растительных масел более изменчиво, чем длина цепи составляющих эти глицериды жирных кислот.

Отдельные таксономические группы высших растений часто характеризуются присутствием в их маслах больших количеств той или иной жирной кислоты необычного строения, свойственной только данному роду или семейству. Так, в маслах крестоцветных в больших количествах содержится эруковая кислота, в маслах зонтичных — петрозелиновая, в маслах молочайных — рицинолевая и элеостеариновая и т. д. Другая особенность растительных масел заключается в резко выраженной позиционной специфичности распределения отдельных жирных кислот в триглицеридах — преимущественное содержание кислот І категории в 1,3-, а кислот ІІ категории — в 2-положениях (стр. 171). В типовом глицеридном составе растений преобладают U₃, SU₂ и отчасти S₂U, тогда как содержание S₃ обычно крайне невелико. Соответственно в ПТС большинства растительных триглицеридов преимущественное место занимают UUU, UUS и SUS. Видовой состав и ПВС глицеридов более ненасыщенных масел, как правило, в той или иной мере соответствуют теориям распределения Ганстоуна и Вандер Валя (стр. 167 и 171), в то время как к твердым жирам тропических растений в большей степени применима теория Картха (стр. 157). Несимметричное распределение жирных кислот в 1- и 3-положениях растительных триглицеридов (стр. 122) выражено не так сильно, как в животных жирах; однако в OOS-фракции масла какао обнаружено сильное, если не исключительное, преобладание одного из энантиомеров. В ходе эволюции растительного мира твердые и полужидкие глицеридные смеси, содержащиеся в плодах примитивных семейств покрытосемянных, сменились жидкими ненасыщенными маслами, свойственными, например, таким высокоорганизованным порядкам, как сложноцветные [16, 368]. Рассмотрим сначала свойства твердых растительных жиров.

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ТВЕРДЫХ ЖИРОВ, БОГАТЫХ C₈ — C₁₄-ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ

Семена растений сем. Palmae, Lauraceae, Lythraceae, Ulmaceae, Myristicaceae и Simarubaceae образуют твердые жиры, обычно содержащие главным образом насыщенные кислоты с m = 8—14, а также малые количества пальмитиновой, стеариновой, олеиновой и линолевой кислот. В глицеридах этих жиров в соответствии с биосинтетической теорией Картха (стр. 158) преобладают S ([S] > 66%) и S₃ (40—100%); U₃-триглицериды часто отсутствуют, а [SU₂] обычно весьма мало. По типовому составу эти триглицериды, как правило, более или менее близки к статистическому и равномерному распределению, но встречаются и значительные отклонения от этих правил [368, 655].

Из жиров плодов сем. Palmae лучше исследованы широко распространенные масла — пальмоядровое (Elaeis guineensis и Attalea funifera) и кокосовое (Cocos nucifera), которые сходны по жирнокислотному составу и содержат около 50% 12 : 0 и 20% 14 : 0 [369, 426]. Вследствие малой концентрации олеиновой и линолевой кислот в пальмовых жирах состав насыщенных кислот в S₃ и в сумме триглицеридов почти одинаков, и обычного преобладания более коротких кислот в S₃, как правило, не наблюдается [211, 368]. В типовом составе содержится 65—80% S₃, 20—35% S₂U и 1—2% SU₂; этот состав мало отличается от статистического и вычисленного по Вандер Валю. Углеродный состав кокосового масла также приближается к статистическому, но для фракций с m = 34, 52 и 54 несколько превышает последний [592]. По данным липазного гидролиза, это отклонение вызвано, возможно, тем, что лауриновая кислота преобладает в 2-положениях (80—85% всех ацилов) [207]. Содержание трилаурина в пальмовом жире много ниже статистического (3—4%), несмотря на высокий уровень лауриновой кислоты [598].

Еще выше, до 95% уровень лауриновой кислоты в жирах сем. Лавровых, где содержание миристиновой кислоты не бывает выше 3—4%. У отдельных видов Lauraceae от 1/2 до 3/4 обычного количества лауриновой кислоты в масле может заменяться каприновой или цис-4-додеценовой кислотой [655]. В углеродном составе жиров Lauraceae обнаружены триглицериды с m = 28—54, среди которых преобладают однокислотные триглицериды главных кислот данного масла [592]. Так, в отличие от пальмоядровых масел, в жире Laurus nobilis содержится 58% лауриновой кислоты и около 30% трилаурина, концентрация которого значительно превышает равномерный, статистический, ограниченно-статистический и позиционно-статистический уровни [641]. Это указывает на преимущественное образование простых триглицеридов в жирах Лавровых и близких к ним семейств [368, 606]. В маслах этих семейств (Lythraceae и Ulmaceae) преобладает каприновая кислота (65—92%, большей частью в 2-положениях), которая у отдельных видов <\br> на 3/4 заменяется каприловой и лауриновой кислотами [915]. Содержание трикаприна в маслах рода Cuphea (сем. Lythraceae) составляет около 70%, что много выше требуемого всеми видами статистического распределения [638].

Жиры сем. Myristicaceae, особенно рода Myristica, отличаются высоким содержанием (до 90%) миристиновой кислоты, которая у отдельных видов может в той или иной степени, но не более чем на 1/4, заменяться лауриновой (род Virola) или цис-9-тетрадеценовой кислотой (Pycnanthus combo) [233]. Типовой состав глицеридов Myristica (кроме вида М. malabarica) удовлетворительно совпадает с рассчитанным по уравнениям Картха, но обычно отличается от статистического, равномерного и вычисленного по теории Ганстоуна, учитывающей лишь содержание, но не длину цепи S-ацила (стр. 175) [211, 486]. Некоторым жирам Myristica свойствен высокий индекс гетерогенности (стр. 162) [749]. В углеродном составе жира V. surinamensis содержание глицеридов с m = 38 и 40 сильно отклоняется от статистического. Столь значительные отклонения можно было бы объяснить неодинаковым позиционным составом, но липазный гидролиз жира Myristica показал, что 1,3- и 2-положения триглицеридов этого жира сходны по составу кислот [916]. Наконец, жир Irvingia (сем. Simarubaceae) содержит приблизительно равные доли лауриновой и миристиновой кислот, причем последняя доминирует в 2-положениях глицеридов [655].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ МАСЛА БОБОВ КАКАО И БЛИЗКИХ К НЕМУ ЖИРОВ

Жиры, подобные маслу какао, образующиеся в семенах тропических растений, отличаются простым жирнокислотным составом. Они содержат стеариновую, пальмитиновую и олеиновую, немного линолевой (2—3%, редко около 10%) и следы арахиновой и миристиновой кислот [168]. Величина [S] обычно составляет 43—63% и не превышает 65%, а [S₃] почти никогда не превосходит 5%. В отличие от предыдущей, данная группа содержит больше пальмитиновой кислоты в S₃, чем в сумме насыщенных кислот [860].

Средние положения триглицеридов на 90—96% заняты ненасыщенными кислотами, а в ПТС преобладают SUS [487]. Концентрация SU₂ обычно понижена, причем в ненасыщенных ацилах SU₂-глицеридов часто содержится много линолеата. Состав глицеридов группы какао удовлетворительно описывается теориями Ганстоуна и Вандер Валя [211]. Однако наличие в каждом из этих жиров, где [S] < 66%, небольшого количества S₃ противоречит теории Ганстоуна [312]. Поэтому наилучшее совпадение получается при расчете по видоизмененным уравнениям Ганстоуна (стр. 174) [211]. Типовой состав этих жиров в общем отвечает теории Картха; для специфического ограниченно-статистического распределения Картха соответствие лучше, чем для расчета по Вандер Валю <\br> (VW), давшего завышенную величину [S₃]vw = 2—7% [486, 491].

Масло бобов какао (Theobroma cacao) играет важную роль в пищевой промышленности вследствие значительной твердости при обычных условиях и плавления в узком интервале температур, который лишь немного ниже температуры тела человека. Поэтому еще в начале ХХ в. из масла какао кристаллизацией выделили некоторые виды триглицеридов [208, 213]. Сравнение масла какао и бараньего жира (стр. 211), сделанное Хилдитчем в 1927 г., показало, что ценные свойства масла обусловлены строением его триглицеридов [364, 848]. В многочисленных исследованиях глицеридного состава масла какао использовались все старые и современные методы анализа триглицеридов (см. табл. 1) [368, 655].

Жирные кислоты этого масла (около 27% пальмитиновой, 35% стеариновой, 36% олеиновой и 3% линолевой) распределены в триглицеридах неравномерно: содержание перечисленных кислот в 2-положениях в среднем составляет 2, 2, 90 и 6% соответственно [207, 211, 695]. Преобладание U в 2-положениях отражается на ПТС глицеридов: 2% SSS, 78% SUS, 2,5% SSU, 0,2% USU, 16% UUS и 1,5% UUU [171, 697]. В SUS-триглицеридах преобладают СОП (около 37%), СОС (25%) и ПОС (14%); в SUU-триглицеридах СОО (8%) и ПОО (6%) [103, 462, 797]. Эти пять триглицеридов составляют около 90% масла [1007, 1010]. Из минорных компонентов найдены СЛП и СЛО (по 2%), СПП и ООО (по 1,5%) СПС (1%), ПЛП (0,5%), СЛС и ПЛО (по 0,3%) и, наконец, ССС и ППП (по 0,1%) [88, 458]. Приведенные ПТС и ПВС являются усредненными и могут меняться в зависимости от изменений жирнокислотного состава [639]. Преобладание SUS-триглицеридов в масле какао подтверждается данными по полиморфизму (стр. 148) [562, 714].

Противоточное распределение исходного масла какао (см. рис. 10), переэтерифицированного масла (см. рис. 11) и искусственной смеси SUS-триглицеридов, имитирующей масло какао (рис. 31), показало, что форма кривой распределения сильно изменяется после переэтерификации и что, следовательно, триглицеридный состав исходного масла не отвечает статистическому; этот состав также не соответствует теории равномерного распределения [860]. Сходство кривых для нативного масла и искусственной смеси триглицеридов позволило Даттону выдвинуть гипотезу 1,3-пальмитостеаро-2-олео-статистического распределения для описания ПВС масла, согласно которой 2-положения заняты исключительно олеиновой кислотой, а избыток этой кислоты и все другие кислоты распределяются статистически в 1,3-положениях [259, 298]. Гипотеза Даттона, которая сходна с теорией Вандер Валя и отличается от нее тем, что не принимает во внимание содержащиеся в 2-положении линолевую и другие кислоты, а также имеющиеся в масле S₃- и U₃-глицериды, в последнее время уступила место другим теориям позиционного распределения [258]. <\br> Рис. 31. Жирнокислотный состав фракций, полученных противоточным распределением синтетического масла какао М — вес суммы метиловых эфиров

Как и для многих других жиров с малым [U₃], найденный и вычисленный по уравнениям Вандер Валя типовой состав близок к типовому составу, вычисленному по теории Картха; однако найденный ПТС резко отличается от рассчитанного по уравнениям Картха [470, 915]. Теория Ганстоуна [312] хорошо отражает концентрацию S₂U- и SU₂-глицеридов масла какао, но, подобно гипотезе Даттона, не учитывает S₃-глицериды [105]. По данным большинства авторов, ПТС и ПВС триглицеридов масла какао довольно близко соответствуют вычисленным по Вандер Валю [517, 953—955]. Поэтому масло какао долго считалось «классическим примером» позиционного распределения ацилов в триглицеридах [212]. Однако в последнее время применение независимых методов исследования позволило установить, что значения [SU₂]vw завышены, а величины [S₂U]vw — занижены по сравнению с найденными, причем для отдельных триглицеридов эти расхождения достигают 2—5% [606]. Возможно, что расхождения вызваны обнаруженным недавно несимметричным распределением ацилов в 1- и 3-положениях глицеридов какао: [S]₁ и [U]₁ равны 86 и 14%, а [S]₃ и [U]₃ — 91,6 и 9,3% соответственно, что противоречит исходной гипотезе Вандер Валя [146].

Рассмотрим вкратце состав и строение триглицеридов других жиров из группы какао [368]. Масло Shorea stenoptera по типовому составу и ПТС очень сходно с маслом какао, но, поскольку по сравнению с последним около 1/2 остатков пальмитиновой кислоты заменено в нем стеариновой, S₂U-глицериды этого масла содержат в основном СОС [213, 697]. Распределение ацилов в масле не является статистическим и отвечает теории Вандер Валя [207, 655]. Жир Allanblackia содержит приблизительно равные количества стеариновой и олеиновой кислот, которые вместе составляют 97—98% от суммы кислот, поэтому концентрация СОС в триглицеридах достигает 76% [208]. В триглицеридах Garcinia indica, где равновесие также сдвинуто в сторону стеариновой кислоты, содержится 68% СОС. Обнаружен образец жира G. indica, состоящий почти исключительно из S₂U-глицеридов [487]. По типовому составу <\br> глицериды G. indica и близкий к ним жир Vateria indica соответствуют уравнениям Вандер Валя и Картха [88, 482]. В масле Butyrospermum parkii преобладают ненасыщенные кислоты, вследствие чего SUS и SUU почти равны по концентрации и имеется более 10% U₃; найденные величины отвечают вычисленным по Вандер Валю [702, 953]. В жирах многочисленных представителей рода Madhuca соотношения отдельных видов кислот весьма изменчивы [322], [S] < [U] и часто содержится много линолевой кислоты [366]; однако по общему плану строения эти жиры напоминают масло какао ([U]₂ > 92%), а по типовому составу согласуются с теориями Ганстоуна, Вандер Валя и Хилдитча [209, 312, 848, 955]. Еще выше содержание ненасыщенных кислот ([U]/[S] ≈ 2) в масле Simarouba glauca [695]. От общего плана строения триглицеридов группы какао несколько отклоняется жир Platonia insignis, который, благодаря высокой концентрации пальмитиновой кислоты (55%), содержит до 20% S₃ [486]. Типовой состав этого жира, вычисленный по Картха, больше соответствует найденному, чем рассчитанный по Ганстоуну [211, 368].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ МАСЕЛ, БОГАТЫХ ЭРУКОВОЙ КИСЛОТОЙ

Следующую группу масел образуют жиры сем. Cruciferae и Tropaeolaceae, богатые эруковой (13-докозеновой) и 11-эйкозеновой кислотами. Рапс (Brassica napus) и другие крестоцветные играют важную роль как масличные растения в странах умеренного пояса (Польша, Швеция, Канада и др.), поэтому жирнокислотному и триглицеридному составу их масел было посвящено много исследований. В последние годы путем газо-жидкостной хроматографии было показано, что состав жирных кислот этих масел весьма сложен: почти в каждой фракции углеродного состава с m = 16, 18, 20, 22 и 24 содержатся насыщенные, моно-, ди- и триеновые компоненты, многие из которых состоят, в свою очередь, из нескольких изомеров с разным положением двойных связей; общее число различных кислот может достигать 30. Содержание эруковой кислоты в маслах обычно равно 20—55%, концентрация эйкозеновой кислоты несколько ниже, а к минорным ненасыщенным кислотам принадлежат в основном олеиновая, линолевая и линоленовая. Последние кислоты, особенно линоленовая, вместе с эйкозеновой и бегеновой преобладают над эруковой кислотой в масле рыжика Camelina sativa [310]. В масле Lunaria annua наряду с 40% эруковой кислоты содержится 20% ее C₂₄-аналога — нервоновой (15-тетракозеновой) кислоты. Эруковая кислота преобладает и в некоторых видах Tropaeolaceae, а в масле Tropaeolum majus ее концентрация достигает 80% (в сумме с эйкозеновой — 96%) [368]. Распространение эйкозеновой кислоты не ограничивается упомянутыми двумя семействами — она встречается в нескольких таксономически не родственных между собой видах, <\br> например в масле Schleichera trijuga (сем. Sapindaceae) содержится 16,5% эйкозеновой кислоты [211].

Таким образом, жирнокислотный состав масел крестоцветных весьма сложен. Еще большей сложностью отличается их триглицеридный состав. Поэтому состав триглицеридов даже наиболее изученного масла рапса, не говоря уже о других маслах, еще не установлен, и здесь можно привести только немногие достоверные факты. К их числу относится ПВС триглицеридов: даже если Σ[AII] лишь немного выше 33%, величина [АI]₂ обычно составляет 93—96%, а мононенасыщенные кислоты с m > 18 (Е), которые по физическим свойствам ближе к высшим насыщенным кислотам, распределяются, подобно этим последним, почти исключительно в 1,3-положениях «эруковых» масел [211, 316, 697]. Была сделана попытка объяснить ограничение [Е]₂ ниже статистического уровня миграцией Е из положений 2 в положения 1 при биосинтезе триглицеридов по механизму Янгса [916]. В отношении конкретной величины [Е]₂ в этих маслах полученные данные колеблются от 1—2 до 20—25%. Лишь в глицеридах Т. majus с [E] > 96 и 40% Е₃ остатки Е содержатся в одинаковой степени как в крайнем, так и в среднем положении [368]. Интересны данные стереоспецифического анализа триглицеридов рапса, из которых следует, что для АI-кислот концентрация была выше в 3-, чем в 1-положении, а для АII-кислот — наоборот [146].

Результаты вычисления ПВС по Вандер Валю разноречивы. Из-за ограничения [Е]₂ рассчитанное по Вандер Валю число триглицеридов (около 120) много ниже вычисленного согласно статистическому распределению; из этого числа около 100 триглицеридов, содержащихся в масле рапса в количестве 0,1—14%, составляют в сумме 98,7% от общего количества. Около 87% всех глицеридов содержат эруковую кислоту [309]. Фракционный и олефиновый состав соответствует числу триглицеридов, вычисленных по Вандер Валю. Этот факт можно использовать для обнаружения примеси эруковых масел в других маслах [559]. Вычисленный ПВС рапса совпадает с найденным олефиновым составом, но отличается от найденного S-видового состава, поскольку вычисленная величина содержания Σ(АII)₃-триглицеридов оказалась завышенной, а значение концентрации Σ(АII)₂ — заниженным [463]. Отсутствие полного совпадения вычисленного и найденного типовых составов было отмечено и для масла S. trijuga [211]. При [Е] < 66% «эруковые» масла содержат не более 2% триэруцина; однако Е₃-триглицериды встречаются в маслах и при [Е] < 33%, что противоречит схеме равномерного распределения [312]. Недостаток триэруцина скорее напоминает ограничение [S₃] по схеме Картха [835].

Вывод об отсутствии триэруцина и о преобладании 2-АII-1,3-диэруцинов в масле рапса подтверждается данными углеродного состава [351]. Таким образом, вопрос о соответствии состава «эруковых» масел той или иной теории распределения из-за его сложности остается пока не решенным.

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ЖИДКИХ НЕВЫСЫХАЮЩИХ МАСЕЛ

Рассмотрим три группы жидких ненасыщенных масел более простого состава, содержащих в основном ацилы с m = 18 и в меньшей степени с m = 16 и различающихся главным образом по величине иодного числа. Первую из этих групп составляют масла хлопчатника, арахиса, миндаля, Blighia akina, тыквы, злаков, макадамии, Jatropha и других растений, не родственных в таксономическом отношении. По качественному составу жирных кислот эта группа сходна с группой масла какао, но величина [S] (главным образом пальмитиновой кислоты) не превышает 20—30%, а значение [S₃] ≤ 1%. Минорными жирными кислотами являются миристиновая, стеариновая, арахиновая, пальмитолеиновая и линоленовая, содержание которых редко превышает 5%. Условно эти масла называют «невысыхающими», хотя под влиянием климатических или генетических факторов ненасыщенность тех или иных жиров изменяется в широких пределах [368].

Изучение типового состава и ПТС глицеридов хлопчатника было начато еще в 30-е годы. Из-за несовершенства применявшихся методов был сделан ошибочный вывод о преобладании пальмитиновой кислоты в 2-положениях этих глицеридов [368]. Сейчас установлено, что содержание П, С, О и Л в 2-положении составляет 2, 1, 20 и 77%, а в сумме глицеридов 26, 2, 17 и 55% соответственно [462, 695, 696]. Типовой состав масел различного происхождения изменяется в следующих пределах: [S₃] < 1%, [S₂U] = 16—21%, [SU₂] = 45—50% и [U₃] = 28—35% [279, 658, 781]. Величина [S₂U] включает 1—5% SSU, а в [SU₂] содержится 0,7% USU [322]. В S-видовом составе найдено 27—30% SЛ₂, около 20% SОЛ, по 12—15% S₂Л, Л₂О и Л₃, по 4—6% S₂O, SO₂ и ЛО₂, а также около 1% триолеина [88, 107, 534, 1010]. О ПВС хлопчатника известно еще мало; имеются лишь данные о том, что это масло содержит равные количества ПОЛ и ПЛО [269, 839].

Очевидно, состав триглицеридов хлопчатника, содержащих много трилинолеина при [Л] ≈ 50% и много S₂U-глицеридов при [S] < 25—30%, лучше описывается схемой статистического, чем равномерного распределения [559, 560, 957]. Найденный типовой состав близок к вычисленному по теориям Картха, Янгса, Вандер Валя и Ганстоуна и в основном сохраняется при переэтерификации, несмотря на резкие изменения в ПТС [105, 702, 953, 1006]. Видовой состав масла в пределах 1% совпадает с рассчитанным по Вандер Валю и Ганстоуну [312, 915, 955].

Существование этого совпадения, а также корреляции между иодным числом масла, с одной стороны, и содержанием линолевой и олеиновой кислот с другой, позволило построить для ряда хлопковых масел график зависимости вычисленного по Ганстоуну видового состава от иодного числа (рис. 32) [12, 78]. Аналогичный график был получен для масла пекана. Установление постоянства величины ([Л]₂/[О]₂) : ([Л]/[О]), получившей название коэффициен- <\br> Рис. 32. Зависимость вычисленного по Ганстоуну видового состава триглицеридов масла хлопчатника от иодного числа масла

та селективности, дает возможность вычислить ПВС данного масла по иодному числу [78, 715]. При развитии этих работ можно будет установить, подчиняются ли все масла данного вида растения, независимо от сортовых и экологических особенностей, определенной схеме распределения, если такое соответствие найдено для какого-либо одного масла данного биологического вида [46, 208, 309].

В другом экономически важном масле этой группы — арахисовом — содержится около 80% олеиновой и линолевой кислот ([О]/[Л] ≈ 2) и имеются следы линоленовой; около 1/3 [S] приходится на долю насыщенных кислот с m ≥ 18 с преобладанием бегеновой кислоты [697]. Величина [S]₂ не превышает 1—2%, а значение [S₃] ≤ 0,1% [695]. Масла различного происхождения сходны между собой по типовому составу глицеридов: 9—11 S₂U, 40—42% SU₂ и 47—49% U₃; содержание SSU- и USU-позиционных изомеров исчисляется долями процента [322]. Наоборот, видовой состав очень изменчив в зависимости от иодного числа масла, и потому трудно привести даже ориентировочные данные. Можно считать, что глицериды с двумя — пятью двойными связями составляют в сумме около 90% всех триглицеридов, а остаток приходится на долю S₂O и Л₃ [462, 916].

ПВС масла арахиса совпадает с вычисленным по Вандер Валю в пределах 1% [207, 953], а расчет по Ганстоуну (G) приводит к завышенным значениям для [SU₂]G (47% вместо 40% найденных) [312, 916]. Возможно, что это расхождение отражает несимметричное распределение жирных кислот между 1- и 3-положениями триглицеридов: как и в масле рапса, в масле арахиса насыщенные кислоты, особенно кислоты с m > 18, преобладают в положениях 3, а олеиновая и линолевая — в положениях 1 триглицеридов [146, 463].

Из других масел рассматриваемой группы подробнее изучены масла миндаля, ряда видов Jatropha, тыквы, макадамии, кунжута, B. akina, зародыша пшеницы и Calophyllum wightianum [63, 317, 321, 322, 959]. Их ПВС в общем соответствует теориям Вандер Валя и Ганстоуна, исключая масло B. akina, в случае которого вычисление дает заниженные величины для [S₂U]vw и [SU₂]vw [105, 317, 702]. Из триглицеридов пшеницы выделили фракцию, богатую н-гептадекановой кислотой [750], а в триглицеридах макадамии обнаружено до 27% пальмитолеиновой кислоты [322].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ПОЛУВЫСЫХАЮЩИХ МАСЕЛ

Масла кукурузы, подсолнечника, сафлора и других условно называют «полувысыхающими». Уровень [S] в этих маслах редко превышает 10—12%, причем пальмитиновая кислота преобладает над стеариновой; отношение [Л]/[О] = 2—8, а концентрация линоленовой кислоты, если она присутствует, не достигает и нескольких процентов. Под действием внешних условий соотношение линолевой и олеиновой кислот может меняться в широких пределах, но сумма этих кислот и уровень [S] обычно остаются постоянными. Старые методы оказались непригодными для исследования этих масел, поэтому достоверные данные о составе их глицеридов получены лишь в последнее время [368].

В табл. 20 обобщены данные глицеридного состава главных представителей этой группы. Обычно в этих маслах [S]₂ ≤ 1,2%, [О]₂ = [О]₁ — 2 или [О]₃ — 3, а [Л]₂ = [Л]₁ + [S]₁ [207, 464]. Особняком стоят данные Кауфмана, по которым в 2-положениях глицеридов подсолнечника содержится более 8% насыщенных кислот с m = 6—14 [534, 559]. В ЛО₂- и Л₂О-глицеридах этого растения обнаружены оба позиционных изомера [269]. В среднем для кукурузного масла и масла подсолнечника [ОЛЛ]/[ЛОЛ] ≈ 3,4, однако в ЛО₂ в 2-положении преобладает олеиновая кислота: [ООЛ]/[ОЛО] = 1,5—2; в SОЛ-триглицеридах также [SЛО] > [SОЛ], а содержание SSU- и USU-изомеров в отдельных видах триглицеридов не превышает 1% [63, 107, 322, 463, 702]. Концентрация пальмитиновой кислоты в S₂U и SU₂ в 4—7 раз выше содержания стеариновой кислоты [88, 839]. Между положениями 1 и 3 глицеридов кукурузного масла отдельные виды кислот распределены почти симметрично [146]. В масле сафлора содержание Л₂О мало отличается от статистического, но величина [ЛОЛ]/[ЛЛО] отклоняется от статистического значения 1 : 2 и составляет 1 : 3, что совпадает с отношением, вычисленным по Вандер Валю, исходя из данных липазного гидролиза всего масла [269].

Таблица 20 Состав триглицеридов полувысыхающих масел (в мол %)

Все масла рассматриваемой группы не соответствуют теории Хилдитча, поскольку они содержат много U₃, в частности трилинолеина, тогда как содержание линолеата в этих маслах обычно ниже 60% [797, 862]. Видовой состав масел близок к статистическому, но ПТС и ПВС глицеридов резко отклоняются от него и удовлетворительно описываются теориями Вандер Валя и Ганстоуна [105, 312, 915, 955]. У подсолнечника совпадение наблюдается лишь для масла зрелых семян 55—90-дневного возраста, а триглицериды 38-дневных семян, содержащих лишь 0,9% жира, не соответствуют такому распределению. Эти глицериды отличаются от обычного масла еще и тем, что олеат в них по величине SF (стр. 176) превышает линолеат [320].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ВЫСЫХАЮЩИХ МАСЕЛ

Наибольшей ненасыщенностью среди жиров обычного жирнокислотного состава характеризуются масла, сходные с льняным, которые содержат иногда более 60% линоленовой кислоты и условно обозначаются как «высыхающие», хотя способностью к образованию прочных пленок на воздухе обладают и некоторые из масел предыдущей группы. Из высыхающих масел глицеридный состав был изучен у масел льна, сои, шиповника, Aleurites moluccana, эфедры и гевеи [208, 318, 322, 368, 635].

Масло льна содержит не более 10% S, из которых на долю стеариновой кислоты приходится 3—4%. Определение жирнокислотного состава в отдельных семенах льна показало, что концентрация S сохраняется на постоянном уровне, а содержание олеиновой и линоленовой кислот колеблется от 11 до 24% и от 54 до 68% соответственно, причем между их концентрациями имеется обратная пропорциональная зависимость. Содержание линолевой кислоты более постоянно и обычно составляет 13—15% [368].

В 2-положениях триглицеридов масла льна уровень S падает до 1—2%, уровень линоленовой не изменяется или становится несколько ниже, а концентрации олеиновой и линолевой кислот возрастают на 2—5 и 7—8% соответственно по сравнению с исходным маслом [207, 462, 463, 702]. 4-Положения триглицеридов богаче насыщенными, а 3-положения — ненасыщенными кислотами [146]. Высокая ненасыщенность льняного масла отражается и на его типовом составе: около 70—74% приходится на долю U₃ и 25—29% — на долю SU₂, а уровень S₂U, если они вообще содержатся в данном масле, по-видимому, не превышает 1—2% [318, 375].

Между найденными и вычисленными по Ганстоуну (G) типовыми составами масла льна и других высоконенасыщенных масел <\br> Рис. 33. Выход фракций с определенным иодным числом при противоточном распределении (в процентах) в зависимости от содержания этих фракций в исходном масле льна (иодное число 180) а — фракции с высоким иодным числом; б — фракции с низким иодным числом; 1 — равномерное распределение; 2 — статистическое распределение; 3 — найдено противоточным распределением

близко к статистическому, однако отношение [ЛеЛЛе]/[ЛеЛеЛ], которое, согласно статистическому распределению, составляет 1 : 2, в действительности равно 1 : 1 и соответствует вычисленному по Вандер Валю для нефракционированного масла [269]. Найденный ПВС отличается от рассчитанного по Вандер Валю не более чем на 1% [208, 655].

Из высыхающих масел наиболее подробно изучено соевое масло, имеющее большое хозяйственное значение [208]. Появление технологического процесса фракционирования триглицеридов соевого масла на техническое высыхающее масло, содержащее около 60% линолевой и 15% линоленовой кислоты, и пищевое масло, близкое по свойствам к оливковому, также стимулировало исследование глицеридного состава семян сои [258, 655, 816].

Обычно соевое масло содержит 11—13% пальмитиновой, 4—6% стеариновой и 7—9% линоленовой кислот, а остальная часть приходится на долю главных кислот — линолевой (около 50%) и олеиновой (23—26%) [318, 368]. В 2-положении уровень S снижается до 1—2%, содержание линоленовой кислоты почти не меняется, концентрация олеиновой кислоты снижается на 1—3%, а количество линолевой кислоты возрастает на 17—18% [207, 369, 700]. Различия в концентрациях отдельных кислот в 1- и 3-положениях не превышают ошибку опыта [146]. В среднем триглицериды сои содержат S₃ (следы), 4—7% S₂U, 31—38% SU₂ <\br> и 53—65% U₃, причем в составе SU₂ 2—3% приходятся на USU, а отношение [SUS]/[SSU] равно 3,3 [279, 1007]. Соотношение между пальмитиновой и стеариновой кислотами в S₂U равно 2,1, а в SU₂ — 3,1 [1010]. В олефиновом составе масла обнаружены фракции с одной — восемью двойными связями [318, 462, 534, 548].

Для оценки способности высоконенасыщенных масел, в том числе соевого, к образованию твердых высыхающих пленок Ганстоун предложил вычисление «показателя ненасыщенности» — Ре-индекса, равного сумме Ре₃ + Ре₂ (Ре₃ и Ре₂ — концентрации триглицеридов, содержащих соответственно два и три ацила жирных кислот с е ≥ 2). Для соевого масла, богатого линолевой кислотой и образующего твердые пленки при высыхании, Ре-индекс = 65—85 [319, 322].

Видовой состав масла не отвечает ни статистическому, ни равномерному распределению, но довольно близок к позиционно-статистическому распределению, причем из-за невысокого уровня [S] вычисление по теориям Вандер Валя и Ганстоуна дает почти идентичные результаты [312, 861, 953]. В ПВС обычно преобладают позиционные изомеры, содержащие линолевую кислоту в 2-положениях [462, 702]. Так, в Л₂Ле отношение [ЛЛеЛ]/[ЛЛЛе] равно не статистической величине 1 : 2, а 1 : 4. Исключение составляет лишь вид О₂Л, где ООЛ-изомер преобладает над ОЛО [269].

Усиленный синтез ненасыщенных кислот в конце созревания семян сои сопровождается преимущественным образованием XUX-изомеров (обозначение Х на стр. 154). Было обнаружено, что 1,3- и 1,2 (2,3)-положения триглицеридов созревающих семян, с одной стороны, и содержащиеся в семенах в свободном виде 1(3)-моно- и 1,2 (2,3)-диглицериды соответственно — с другой, сходны по жирнокислотному составу. Поэтому предположили, что моно- и диглицериды служат промежуточными продуктами при биосинтезе триглицеридов в семенах сои [370].

Масло семян бразильской гевеи ([S] = 20%, [Ле] = 21%) по строению триглицеридов соответствует теориям Вандер Валя и Ганстоуна [319].

Некоторые масла отличаются большой сложностью состава: так, масло Ephedra nevadensis содержит в видовом составе 30 отдельных компонентов [635]. Вообще масла, богатые линоленовой кислотой, по ПВС близки к позиционно-статистическому распределению. Однако по типовому составу это совпадение не столь удовлетворительно: у всех изученных масел величина [U₃]G завышена на 2—7%, а значение [SU₂]G — занижено на 3—5% по сравнению с найденными. Возможно, в строении этих масел имеется какая-то закономерность, еще не раскрытая современными теориями распределения [318].

Глава 13. СОСТАВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ НЕОБЫЧНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ТРИГЛИЦЕРИДОВ ИЗ МАСЕЛ ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК

ТРИГЛИЦЕРИДЫ МАСЕЛ СЕМ. МОЛОЧАЙНЫХ

Рассмотрим теперь триглицериды масел, содержащих необычные жирные кислоты (стр. 176). Как правило, каждая из этих кислот свойственна семенам растений определенных видов или семейств, причем одна и та же кислота может содержаться в растениях, далеких друг от друга в таксономическом отношении [368]. Приведем сначала данные состава нескольких масел из сем. Euphorbiaceae.

Китайское масло семян Sapium sebiferum кроме насыщенных кислот (8—10%), олеиновой (10%), линолевой (22—25%) и линоленовой (47—51%) содержит также 8% необычной 2,4-декадиеновой кислоты [318]. Это масло с помощью адсорбционной хроматографии было разделено на полярную (26—31%) и неполярную, напоминающую льняное масло, фракции. Полярная фракция представляет собой оптически активный триглицерид ([α]²⁵_D = 21,9°). Путем его обработки алюмогидридом лития и затем уксусным ангидридом с образованием триацетина и ацетатов жирных спиртов было показано, что этот глицерид содержит равное количество Л и Ле и, кроме того, 31,5% ацила карбоксилсопряженной 2,4-декадиеновой кислоты [676]. Оптическая активность глицерида исчезала после гидрирования, а этиловый эфир декадиеновой кислоты был неактивен. В первой работе, посвященной этому вопросу, предположили, что оптическая активность вызвана присутствием декадиеновой кислоты в 1- или 3-положениях глицерида вблизи от потенциального центра асимметрии — С-2-атома глицерида [642, 676]. Однако величина [α]²⁵_D синтетического аналога — 1,2-дипальмитата 3-(2,4-гексадиената) sn-глицерина составила всего —3,60° [738]. Позже, исследование глицерида S. sebiferum методами ИК и ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии позволило установить его действительное строение [890]:

СН₂О(Ле)—СНО(Л)—СН₂ОСО(CH₂)₃—CH=C=CHCH₂—O—CO—CH=CH—CH=CH—(CH₂)₄CH₃

Было доказано, что ОН-группа, к которой присоединен остаток декадиеновой кислоты, содержится не в остатке глицерина, а в ациле оптически активной C₈-оксиалленовой кислоты. Таким образом, центр асимметрии (С*) триглицерида находится не в остатке глицерина, а в алифатической цепи C₈-кислоты [856, 890]. Все глицериды полярной фракции содержат только по одному остатку декадиеновой кислоты [747]. Положение этого ацила в триглицеридах окончательно не установлено. Данные липазного гидролиза, согласно которым декадиеноат содержится в <\br> 1,3-положениях, не вполне достоверны, поскольку ацилы с короткой цепью легко мигрируют при гидролизе (стр. 117) [369]. В то же время результаты изучения полиморфизма гидрированного масла S. sebiferum свидетельствуют о том, что декадиеновая кислота находится в 2-положениях. Исследование ПВС триглицеридов этого масла на 37, 67 и 142-й день после цветения показало, что линоленовая кислота образуется из олеиновой и линолевой лишь к концу созревания; одновременно (после 52-го дня) возникает и декадиеновая кислота. Преобладание S в 1,3-положениях наблюдается уже с самого начала созревания [374].

К сем. Euphorbiaceae относится также клещевина, масло которой имеет важное хозяйственное значение. Касторовое масло содержит 90—91% D(+)-12-окси-цис-9-октадеценовой (рицинолевой) кислоты; к минорным компонентам принадлежат кислоты линолевая, олеиновая (по 3—4%), пальмитиновая, диоксистеариновая (по 1—1,5%), стеариновая, арахиновая и другие (доли %) [211, 368]. Ранее считали, что масло содержит лишь ди- и тририцинолеоглицериды в статистической концентрации. Однако сейчас установлено, что концентрации моно-, ди- и тририцинолео-триглицеридов соответствуют вычисленным по Вандер Валю; имеются также следы глицеридов, лишенных рицинолевой кислоты [46]. Рицинолевая кислота содержится преимущественно в 2-положениях [212, 781].

Отдельные виды того же семейства содержат в масле семян твердую 9-цис, 11-транс, 13-транс-октадекатриеновую (элеостеариновую) кислоту с сопряженными двойными связями и ее 9-оксипроизводное — камлоленовую кислоту. В масле тунга (Aleurites fordii и A. montana), одном из лучших высыхающих масел, концентрация элеостеариновой кислоты составляет 65—85%. Интересно, что главной кислотой многих других видов этого рода служит линоленовая кислота, которая, однако, никогда не встречается вместе с элеостеариновой кислотой. Из других кислот в образце тунгового масла, содержавшего 81,5% элеостеариновой кислоты, обнаружили олеиновую, линолевую (по 6—7%), стеариновую и пальмитиновую кислоты (по 2,5—3% каждая) [368].

По содержанию в 2-положении триглицеридов тунга элеостеариновая кислота уступает линолевой, но превосходит олеиновую. Видовой состав масла тунга близок к статистическому [924]. Так, упомянутое выше масло с 81,5% элеостеариновой кислоты состоит из 54% триэлеостеарина, 27% диэлеостеаро-линолеина + -олеина, 11% триглицеридов, содержащих два остатка элеостеариновой и один остаток насыщенной кислоты, и 8% триглицеридов, содержащих один остаток элеостеариновой кислоты [916]. Найденный глицеридный состав хорошо соответствует вычисленному по Вандер Валю [105].

Напротив, состав триглицеридов масла Momordica charantia, содержащего 56% элеостеариновой и 30% стеариновой кислоты, <\br> не соответствует теории Вандер Валя, поскольку обнаруженное количество стеародиэлеостеарина (более 80%) резко отличается от вычисленного (45%). Возможно, что столь значительное отклонение от схемы позиционно-статистического распределения, наблюдаемое среди жиров высших растений впервые, вызвано ограничением содержания твердого стеародиэлеостеарина в масле по механизму Картха (стр. 158), содержанием стеариновой кислоты только в одном из 1- или 3-положений или же непригодностью метода липазного гидролиза для анализа этого масла [211, 212, 913].

Масло Mallotus philippinensis содержит 30—70% твердой 18-оксиэлеостеариновой (камлоленовой) кислоты [368]. Поскольку содержание глицерина в этом масле и ацетильное число последнего составляли лишь около 1/3 теоретического, предположили, что масло состоит из эстолидных триглицеридов, в которых две молекулы камлоленовой кислоты соединены между собой сложноэфирной связью. Действительно, масло М. philippinensis кристаллизацией разделили на шесть фракций, возможный состав которых приведен в табл. 21 (Х = элеостеариновая, линолевая, олеиновая или S) [45].

Таблица 21 Количественный состав и строение триглицеридов отдельных фракций масла семян Mallotus philippinensis

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ДРУГИХ МАСЕЛ НЕОБЫЧНОГО ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА

В масле склероциев и мицелия спорыньи Claviceps purpurea, содержащем 35% рицинолевой кислоты (Р) [368], обнаружили наряду с обычными триглицеридами X—X—X (обозначение Х, стр. 154) также и эстолидные триглицериды трех типов: XP—(X)₂, (XP)₂—Х и ХР — XP — РХ, содержание которых составляло соответственно 10,2, 19,6, 47,4 и 22,8%. Ацетильное <\br> число масла равно нулю, что указывает на полное замещение гидроксилов рицинолевой кислоты ацилами Х. Полиэстолидные триглицериды типа Р—Р, подобные содержащимся в масле M. philippinensis, в масле спорыньи не найдены. Липазным гидролизом сложноэфирных связей остатка глицерина в ХР—(Х)₂ и (ХР)₂—Х обнаружили как симметричные, так и несимметричные ХР—Х-изомеры. Однако вопрос о преобладании ХР-радикалов в 1,3- или 2-положениях еще не решен. Ацилы Х, непосредственно связанные с остатком глицерина, отличались большей ненасыщенностью, чем ацилы Х, связанные с рицинолевой кислотой, а ацилы Х, связанные с эстерифицированной в положении 2 глицерина рицинолевой кислоты, были более ненасыщенными, чем ацилы Х, связанные с рицинолевой кислотой, которая этерифицирована в 1,3-положении. Глицериды Х₃ масла спорыньи по строению не отличаются от обычных растительных триглицеридов и соответствуют теории Ганстоуна [740].

Масло семян Chamaepeuce afra наряду с обычными глицеридами содержит триглицериды, имеющие строение Х—Т(X)₂—Х(І) и Х—Т(ХУ)—Х (ІІ), где У — ацетат, Т — остаток (+)-трео-9,10,18-триоксиоктадец-цис-12-еновой кислоты или ее насыщенного аналога. В соединениях I и II две гидроксильные группы в остатке триоксикислоты замещены ацилами, один из которых расположен в положении 18, а другой — в положении 9 или 10. Группы ТХ₂ и ТХУ связаны с 2-положениями глицеридов соединений І и ІІ [727].

Из других масел необычного состава исследовали масло Parinarium laurinum (сем. Розоцветных), содержащее 27% элеостеариновой кислоты и около 56% 9, 11, 13, 15-октадекатетраеновой (паринариновой) кислоты. В масле имеется 22% трипаринарина, что значительно превышает статистическую и равномерную концентрации [368].

Масло кориандра из сем. Зонтичных содержит около 72% петрозелиновой кислоты (Пе), ацилы которой связаны главным образом с 1,3-положениями триглицеридов. Содержание Пе₃ и Пе₂О + Пе₂Л в триглицеридах значительно отличается от вычисленного по Вандер Валю [916]. В семенах Vernonia anthelmin-tica из сем. Сложноцветных найдено 70% 12,13-эпоксиолеиновой (вернолиновой) кислоты, причем концентрация тривернолина (55%) сильно превышает статистическую [924]. Наконец, в масле семян Cardamine impatiens из сем. Крестоцветных недавно обнаружили триглицериды диоксикислот с m = 22 и 24 [728].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ЖИРОВ ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК

До сих пор рассматривались триглицериды, содержащиеся в семенах растений. Ниже приведены данные о глицеридном составе жиров плодовых оболочек высших растений, из которых подробнее изучены оливковое и пальмовое масла. Среди жирных <\br> кислот плодовых оболочек обычно преобладают пальмитиновая и олеиновая, в меньших количествах содержатся линолевая, стеариновая и миристиновая кислоты, а линоленовая, арахиновая, пальмитолеиновая и лауриновая кислоты обнаруживаются в виде следов. Содержащиеся в одном и том же плоде жиры плодовых оболочек и жиры семян сильно различаются по свойствам у всех растений, кроме маслины. Отдельные жиры плодовых оболочек будут рассмотрены в порядке убывания их ненасыщенности.

Оливковое масло, получаемое из мякоти плодов маслины Olea europea L., имеет разный жирнокислотный состав в зависимости от географического происхождения: в турецких сортах [О] ≥ 75%, а в итальянских — [О] ≤ 65% [258]. Масла наиболее распространенных сортов содержат 72—76% олеиновой, 10—15% пальмитиновой, 8—12% линолевой и 1—2% стеариновой кислот, а также минорные компоненты (см. выше) [208, 368].

По позиционной специфичности оливковое масло не отличается от других жидких масел: [S]₂ (почти исключительно пальмитиновая кислота) не превышает 1—1,5%, а величины [О]₂ и [Л]₂ — на 10—15% и 2—4% соответственно превышают значения [О]₁ и [Л]₁; в этом масле, в отличие от многих других масел, олеиновая кислота имеет более высокую величину SF (стр. 176), чем линолевая [207, 369]. Изучение жирнокислотного состава 1- и 3-положений триглицеридов показало, что S сосредоточены преимущественно в положениях 3, а U — в положениях 1 [146]. Низкий уровень [S] в натуральном масле был использован для обнаружения фальсификации его жирами, полученными этерификацией [702, 707]. Другой способ обнаружения посторонних масел, основанный на выделении из оливкового масла глицеридов с пятью-шестью двойными связями кристаллизацией при —35°, оказался менее пригодным на практике [691].

Типовой состав оливковых масел довольно однороден: около 5% S₂U, 35% SU₂ и 60% U₃; уровень [S₃] и содержание SUU- и USU-изомеров не превышает 0,1—0,3% [964, 797]. В составе SU₂ около 1/5, а в составе S₂U около 1/3 приходится на стеароглицериды [915, 1010]. Имеются данные о том, что [U₃] возрастает после переэтерификации. В олефиновом составе оливкового масла содержание фракций с е = 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6 составляет в среднем 1, 5, 27, 46, 17, 3 и 1% соответственно [273], а в видовом составе обнаружены триолеин (40%), пальмитодиолеин (20%), линолеодиолеин (16%), пальмитоолеолинолеин (6%), олео- и линолеодипальмитин (по 4%), стеародиолеин и олеодилинолеин (по 3%) и пальмитодилинолеин (около 1%) [462]. По одним данным, рассчитанный по Вандер Валю (VW) ПТС и видовой состав глицеридов в пределах 1% совпадают с найденным; по другим — вычисленные величины [S₃]vw и [Л₂О]vw завышены, а значения [О₃]vw — занижены по сравнению с найденными [470, 560].

Большое хозяйственное значение имеет и масло плодовой оболочки пальмы Elaeis guineensis и некоторых других видов <\br> из Западной и Центральной Африки, Индонезии и Малайи. В триглицеридах E. guineensis содержится в среднем 44—46% пальмитиновой, 4—6% стеариновой, 39—41% олеиновой, 8—11% линолевой и следы миристиновой и линоленовой кислот [208, 368]. В отличие от большинства растительных жиров, пальмовому маслу свойственна относительно высокая величина [S]₂: в 2-положении глицеридов содержится 11—18% пальмитиновой и 1—2% стеариновой кислот, а из 80—87% имеющихся здесь U-ацилов 65—70% приходится на долю олеиновой и 16—22% — на долю линолевой кислот [88, 207, 702]. Типовой состав глицеридов изменяется в широких пределах: 6—9% S₃, 44—53% S₂U, 30—39% SU₂ и 6—12% U₃ [258, 658]. Повышенная величина [S]₂ проявляется в значительном содержании S₃, SSU и USU: [SUS]/[SSU] = 4 и [SUU]/[USU] = 15—17 [462].

Первые анализы типового состава пальмового масла хорошо соответствуют теориям Картха, Янгса и Вандер Валя [105, 1006]. В это же время это масло не соответствует равномерному распределению (поскольку [S₃] значительно выше вычисленного и составляет около 1/2 статистического) и теории Ганстоупа, которая не объясняет присутствия в триглицеридах 8% S₃, 9% SSU и 2% USU [464, 848]. Расчет ПТС по теории Вандер Валя привел к получению завышенных значений для [U₃]vw и [S₃]vw и заниженных на 2—3% данных для [S₂U]vw и [SU₂]vw [208, 211—213]. Более удовлетворительными были результаты расчета типового состава по схеме специфического ограниченно-статистического распределения Картха, где данные распределения по Вандер Валю использовались с поправкой на эмпирическую величину [S₃] [486—491].

Ниже приведен примерный видовой состав триглицеридов масла (в мол%):

В триглицериде П₂О содержится около 20% несимметричного позиционного изомера, который был ранее идентифицирован в масле путем определения полиморфизма [915]. В олефиновом составе масла преобладают фракции с е = 1 и 2; вычисленная по Вандер Валю концентрация моноеновых глицеридов занижена, а содержание триеновых компонентов завышено на 3—4% по сравнению с найденными [88, 655, 971].

Жир плодовых оболочек плодов Sapium sebiferum богаче насыщенными кислотами, чем пальмовое масло; он содержит около 73% пальмитиновой, по 2—3% стеариновой и миристиновой и около 20% олеиновой и линолевой кислот [368, 747]. Однако по строению триглицеридов он ближе к обычным растительным <\br> маслам, чем пальмовый жир. Практически все U-ацилы сосредоточены в 2-положениях, в ПТС обнаруживаются почти исключительно SSS- и SUS-изомеры, а концентрация SU₂ в жире не превышает 2% [369, 374]. Найденный типовой состав жира S. sebiferum, как и состав пальмового масла, лучше соответствует вычисленному по Картха, чем вычисленному по теории Ганстоуна, которая не учитывает длину цепи насыщенных кислот в S₃ [486]. Однако расчет по Ганстоуну также приводит к положительным результатам после введения эмпирической поправки на [S₃] [105].

Жир оболочки Myrica carolinensis лишен ненасыщенных кислот и содержит 1% стеариновой, 77,5% пальмитиновой и 21,5% миристиновой кислоты, концентрация которой в 2-положении возрастает до 37% [368]. Углеродный состав этого жира, содержащего 55% трипальмитина, 20—27% миристодипальмитина и 7—12% димиристопальмитина, не соответствует ни одной из разновидностей статистического распределения (стр. 164) [211, 350]; вычисление по Вандер Валю приводит к сильно завышенным результатам для [МП₂] и к заниженным данным для [П₃] и [М₃] [105]. В семенах этого растения обнаружено жидкое масло, сходное с сафлоровым [350].

В заключение рассмотрим глицеридный состав масла патогенного гриба Beauveria tenella из сем. Moniliaceae, который пока остается единственным низшим растением, изученным в этом отношении [931]. По соотношению олеиновой, пальмитиновой, линолевой и стеариновой кислот (1 : 1 : 0,8 : 0,3) жир B. tenella напоминает масло Monilia albicans из того же семейства [368], а по позиционному распределению сходен с жирами высших растений, хотя величина [S]₂ = 14,6% довольно значительна. Типовой состав жира B. tenella ([S₃] = 4,3%, [S₂U] = 32,5%, [SU₂] = 45,4%, [U₃] = 17,8%) близок к статистическому, а ПТС([SUS]/[SSU] = 3,5, [UUS]/[USU] = 14,1) резко от него отклоняется вследствие преобладания ненасыщенных кислот в 2-положениях [931].

СОСТАВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ЖИВОТНЫХ ЖИРОВ

Глава 14. СОСТАВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ЖИРОВЫХ ТКАНЕЙ

ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА ЖИВОТНЫХ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Животные жиры по триглицеридному составу изучены менее подробно, чем растительные; среди животных триглицеридов в большей мере исследованы запасные глицериды жировых тканей и значительно меньше — молочные жиры и жиры печени и других внутренних органов. При обычных условиях животные триглицериды имеют твердую или полужидкую консистенцию, кото- <\br> рая определяется их жирнокислотным составом. Главные кислоты животных жиров — пальмитиновая, стеариновая и олеиновая; почти всегда имеются заметные количества пальмитолеиновой и миристиновой, а также более или менее обширный набор минорных компонентов. Полиненасыщенные кислоты животными в организме не синтезируются, их присутствие в жире целиком зависит от состава рациона (стр. 219). Ненасыщенные кислоты животных жиров часто содержат несколько изомеров положения двойных связей. В отличие от растений (стр. 179), определенным таксономическим группам животных специфические эндогенные кислоты обычно не свойственны [368, 655].

По характеру позиционного распределения S и U большинство животных жиров напоминает растительные масла: пальмитиновая, стеариновая и кислоты с m > 18 содержатся преимущественно в 1,3-положениях, а олеиновая, линолевая и кислоты с m < 16 — в 2-положениях глицеридов. Однако из-за относительно высокого уровня [S]₂ различия в жирнокислотном составе между этими положениями выражены здесь слабее, чем у растений [655]. Возможно, что такая схема распределения вызвана сохранением 2-моноглицеридной структуры жиров рациона (стр. 222), приводящим к накоплению линолевой и других экзогенных кислот в 2-положениях, а стеариновой и пальмитиновой, синтезированных самим организмом, — в 1,3-положениях глицеридов [142]. Было отмечено, что в 2-положения включаются преимущественно те кислоты, которые больше, чем другие, растворимы в гидрофильной фазе обращенно-фазовой хроматографической системы [133].

По сравнению с растительными в животных триглицеридах более выражено несимметричное распределение жирных кислот между 1- и 3-положениями. В положениях 1 обычно преобладают пальмитиновая и стеариновая кислоты; в положениях 2 при равном m включаются преимущественно ненасыщенные кислоты, а при равном е — главным образом кислоты с более короткой цепью; наконец, в положениях 3 в большей мере, чем в положениях 1, содержатся более длинные ненасыщенные кислоты с m = 18, 20 и 22. Таким образом, в S₂U- и SU₂-глицеридах животных жиров преобладают S₁-энантиомерные формы [133, 142, 739].

Величина [S₃] животных жиров более или менее близка к статистической (большинство растительных жиров с m кислот ≥ 16 содержат лишь следы S₃, стр. 179), причем степень этой близости прямо пропорциональна уровню олеиновой кислоты. Этот факт пытались объяснить «гипотезой биогидрирования», согласно которой при первоначальном биосинтезе образуются преимущественно диолеопальмитоглицериды в количествах, отвечающих равномерному распределению; затем бактерии пищеварительного тракта животных подвергают эти глицериды гидрированию, в результате которого около ¹/₂ олеиновой кислоты превращается в стеариновую и значение [S₃] достигает статистического или приближается к нему [368]. Для типового состава <\br> животных жиров характерно также пониженное по сравнению со статистическим значение [U₃]. Вообще животные триглицериды в меньшей степени, чем растительные, соответствуют какой-либо из имеющихся теорий распределения, что вызвано большей функциональной гетерогенностью животных жировых тканей, а также меняющимся составом рациона [655].

Как отметил Брокерхоф, в ходе эволюции животных триглицеридный состав их жиров закономерно изменялся: жиры морских рыб представляют собой жидкие масла, бедные S-ацилами; жиры амфибий и рептилий по составу кислот занимают промежуточное положение между жирами рыб и птиц; жиры птиц и грызунов в свою очередь служат переходной ступенью к жирам плотоядных и всеядных млекопитающих — хищников, приматов и свиней; наконец, наибольшей насыщенностью отличаются жиры крупных травоядных животных. Можно видеть, что эволюция животного мира привела к появлению твердых жиров, в то время как жиры растений, наоборот, эволюционировали от твердых к жидким (стр. 179) [133].

В настоящее время различают ряд групп животных, каждая из которых характеризуется особым механизмом биосинтеза триглицеридов жировых тканей: 1) морские рыбы и беспозвоночные; 2) морские млекопитающие; 3) материковые птицы; 4) грызуны, хищники, приматы; 5) свиньи и пеккари; 6) крупные копытные [133]. Кроме конкретного разбора особенностей триглицеридов каждой их этих групп будут рассмотрены триглицериды печени и молочного жира, а также влияние строения триглицеридов рациона на ПВС глицеридов жировых тканей.

ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ МОРСКИХ ЖИВОТНЫХ

Рассмотрим прежде всего состав и строение глицеридов морских организмов — беспозвоночных, рыб, птиц и млекопитающих. Основой питания всех этих животных служит морской планктон, богатый ненасыщенными кислотами с m = 20 и 22, которые сохраняются затем как характерный признак триглицеридов всей морской фауны и могут переходить в жиры наземных животных при содержании последних на рыбном рационе (стр. 223). Другой отличительной чертой морских жиров следует считать повышенное содержание в них моноеновых кислот с m = 16, 20 и 22 [368].

Триглицериды морских животных сосредоточены в основном в подкожной жировой ткани и отчасти в печени морских млекопитающих, а также в мышцах, печени или гепатопанкреасе рыб и беспозвоночных. Жирнокислотный состав этих глицеридов, особенно глицеридов рыб, весьма сложен. В каждом из морских жиров содержится от 12 до 30 жирных кислот с различной длиной цепи и ненасыщенностью, не считая позиционных изомеров. По- <\br> этому в настоящее время имеются лишь данные о суммарном и позиционном составе этих жиров, а сведения о ПТС и видовом составе глицеридов, который может насчитывать тысячи отдельных соединений, пока почти отсутствуют [250, 251]. В «морских» жирах преобладают ненасыщенные кислоты с m = 14—26, содержание насыщенных кислот (главным образом пальмитиновой) редко превышает 15—20%, возможно, вследствие низкой температуры внешней среды, а S₃-глицериды обычно отсутствуют [368]. У зубатых китов и ряда других морских животных во фракции нейтральных липидов наряду с триглицеридами обнаружены воска, алкокси- и плазмалогенные формы глицеридов [655]. По строению триглицеридов «морские» жиры можно разделить на две группы: жиры морских рыб и беспозвоночных, с одной стороны, и жиры морских млекопитающих — с другой [140].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ МОРСКИХ РЫБ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Из триглицеридов первой группы к настоящему времени исследованы жиры мышц и печени трески Gadus callarius; мышц угольной рыбы Anaplopoma fimbria, сельди Clupea pallassii, сардины Sardinops sagax, макрели Scomber scombrus, чавычи Oncorhynchus tshawytsha, менхадена Brevoortia tyrannus, тунца Euthynnus alleteratus, угря Anguilla rostrata; печени палтуса Hypoglossus hypoglossus и ската Raja laevis; мышц и печени беспозвоночных омара и морского гребешка Platopecten magellanicus. Изучены также жиры пресноводных рыб — карася Carassius auratus, американской палии Salvelinus fontinalis, сомика Mystus seenghala, налима Lota lota и пресноводного барабанщика Aplodinotus grunniens. Жирнокислотный состав этих триглицеридов отличается значительной изменчивостью, вызванной видовой специфичностью и различиями в рационе. Средние данные о составе главных жирных кислот суммы [А] и 2-положения [А]₂ триглицеридов морских рыб и беспозвоночных (в мол %) были следующими [135—137, 139, 144, 250, 251, 323, 351, 772].

Кроме главных кислот в большинстве жиров содержатся следы насыщенных кислот с m = 12, 15, 17, 19, 20, 22 и 23 и следы ненасыщенных кислот 14 : 1, 20 : 2, 16 : 3, 18 : 3, 20 : 3, 22 : 3, 18 : 4, 20 : 4, 22 : 4 и 26 : 4. В глицеридах имеется свыше <\br> 80% насыщенных и моноеновых и по 5—7% ди-, пента- и гексаеновых кислот. Генотип отдельных животных может оказывать значительное влияние на состав их жира. Так, в жире A. fimbria содержится значительное количество кислот 22 : 4 и 26 : 4; у пресноводных рыб отсутствие или пониженная концентрация полиненасыщенных кислот с m = 20—22 компенсируется высоким содержанием линолеата; в жирах беспозвоночных сильно повышена концентрация 16 : 2 и т. д. [136, 368, 655, 772].

Достаточно широкий набор кислот в рыбьих жирах еще более усложняется благодаря наличию многих изомеров положения двойных связей. В моноеновых кислотах с m = 16—22 жира макрели, трески и омара изомеры с двойной связью, расположенной в средней части цепи (16 : 1⁹, 18 : 1⁹, 20 : 1¹¹, 22 : 1⁹⁺¹¹), составляют в среднем 75—90%; наряду с главными изомерами содержится много кислот, где двойная связь смещена к 7 или 13-му атому. Все изомеры полиеновых кислот по положению двойных связей являются структурными аналогами линоленовой кислоты [135, 137, 142, 655].

Как видно из данных, представленных выше, в 2-положении преобладают кислоты с m = 14—16 независимо от их ненасыщенности, а также пента- и гексаеновые кислоты. Следует отметить, что наряду с указанным выше распределением пальмитиновой и олеиновой кислот, которое напоминает их распределение в свином жире и наблюдается в большинстве рыбьих жиров, у ряда животных, в частности беспозвоночных, обнаружено и другое распределение: [П]₂ снижается до 9%, а [О]₂ возрастает до 31%. Обычно положения 1 обогащены насыщенными и C₁₆—₁₈-моноеновыми кислотами, а положения 3 — моноеновыми кислотами с m = 20—22. В концентрации изомеров моноеновых кислот (см. выше) между положениями 1 и 3 значительных различий нет [135, 136, 142].

Для экзогенных, содержащихся в пище морских животных полиеновых кислот 22 : 5 и 22 : 6 значения [А]₁, [А]₂, [А]₃ и [А]₁,₃ можно вычислить из содержания данной кислоты в сумме триглицеридов этих животных по уравнениям вида [А]₁,₂,₃ = a₁,₂,₃ [А], где коэффициенты корреляции между содержанием полиненасыщенных жирных кислот с m > 18 в 1-, 2- и 3-положениях и в сумме триглицеридов составляют: а₁ = 0,26, а₂ = 2,07, а₃ = 0,66, а₁,₃ = 0,46. Величина [А] в уравнениях отражает концентрацию данных кислот в метаболитическом пуле, а константа а — сродство ферментов, катализирующих ацилирование положений 1, 2 или 3, к этим кислотам. Можно видеть, что каждая из полиеновых кислот этерифицируется независимо от других, но из одного и того же метаболитического пула. Абсолютные расхождения между вычисленными и найденными величинами не превышают 2% [636].

Следовательно, в жирах рыб сохраняется без значительных изменений структура триглицеридов, свойственная жирам морского планктона, — главной пищи рыб; полиненасыщенные кис- <\br> лоты, занимающие в триглицеридах центральное положение, играют здесь ту же роль, что и экзогенная линолевая кислота в жирах наземных животных. Мышцы и печень рыб мало различаются по глицеридному составу [136, 137, 142].

Несмотря на крайнюю сложность триглицеридного состава, было сделано несколько попыток фракционирования триглицеридов рыб. Путем окисления жира печени акулы и жира пресноводной рыбы М. seenghala по методу Картха было обнаружено, что строение триглицеридов этих жиров соответствует теории ограниченно-статистического распределения. Разделение глицеридов масла A. fimbria по ненасыщенности на три фракции с иодным числом 38—115 показало, что эти глицериды не соответствуют теории Вандер Валя [250, 251, 655, 772]. В углеродном составе масел B. tyrannus и E. alleteratus обнаружили и нечетные триглицериды [351].

Жиры морских птиц — чаек и бакланов — в общем сходны с жирами материковых птиц (стр. 204); различия заключаются в снижении концентрации линолевой кислоты и появления кислот 20 : 1, 22 : 1, 20 : 5, 22 : 5 и 22 : 6. Высокое содержание последних наблюдалось в содержимом желудка Fulmarus glacialis [142, 314, 323].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ МОРСКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

К другой группе «морских» жиров относятся триглицериды жировых тканей и печени кита, тюленя и белого медведя. В среднем глицериды жировых тканей содержат 13% насыщенных кислот (5% миристиновой, 8% пальмитиновой) и 44% моно- и диеновых кислот (1% — 14 : 1 и 18 : 2, 16% — 16 : 1 и 26% — 18 : 1); кроме 57% кислот с m = 14—18, в глицеридах содержится 43% кислот с m = 20—22 (16% — 20 : 1, по 8% — 22 : 1 и 22 : 6, по 5—6% — 22 : 5 и 20 : 5 и следы 20 : 4). Позиционное распределение ацилов (стр. 199) определяется почти исключительно длиной цепи: около 91% А₂-ацилов приходится на долю кислот с m = 14—18 (34% — 18 : 1, 28% — 16 : 1, 13% миристиновой, 11% пальмитиновой и по 2—3% — 14 : 1 и 18 : 2) [133].

В отличие от рыбьих жиров, характерной чертой глицеридов жировых тканей морского зверя можно считать незначительное включение полиненасыщенных кислот с m = 20—22 в 2-положения глицеридов, где концентрация каждой из них не превышает 1—2%. В 2-положениях содержится также около 4% 20 : 1 и 1% — 22 : 1 [133, 137, 140—142]. Полиеновые кислоты сосредоточены главным образом в 3-положениях, а в положениях 1 содержатся преимущественно моноеновые кислоты с m = 20—22 и насыщенные кислоты с m = 16—18 [137, 140—142, 1011]. В уравнениях, аналогичных приведенным выше (стр. 202), величина а₁ = 0,90, а₂ = 0,23, а₃ = 1,87 и а₁,₃ = 1,39; вычисленные и найденные значения совпадали [636]. <\br> Преимущественное включение экзогенных кислот в 1,3-положения глицеридов доказывается также изучением изомерного состава моноеновых кислот с m = 16—22 в этих положениях. Установлено, что в тюленьем жире изомеры экзогенного происхождения, у которых двойные связи смещены из центра цепи в направлении метильной или карбоксильной группы (16 : 1⁷, 16 : 1¹¹, 18 : 1⁷, 18 : 1¹¹ и др.), сосредоточены главным образом в 1,3-положениях глицеридов. Эндогенные Δ⁹-моноеновые кислоты образуются в самом организме тюленя и занимают в триглицеридах преимущественно 2-положение. Возможно, что эти кислоты составляют особый метаболитический пул, который при недостатке поступающих с пищей полиненасыщенных кислот может использоваться для синтеза ненасыщенных триглицеридов, имеющих жидкую консистенцию в условиях жизни организма [142]. В жире китового молока подобной неравномерности в распределении ацилов не было обнаружено [135].

Глицериды печени тюленя значительно отличаются от глицеридов его жировой ткани. В них повышена концентрация 16 : 0 и 18 : 1 кислот, но зато в пять раз понижено содержание полиненасыщенных кислот, которые здесь сосредоточены в 2-положениях [137]. Эта особенность сближает глицериды печени тюленя с рыбьими жирами. В жире дельфина Delphinus delphis L. обнаружены триглицериды, содержащие один или два остатка оптически активной (+)-метилэтилуксусной кислоты и имеющие [α]²⁵_D = 3,45° и 10,16° соответственно [856].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ПТИЦ, АМФИБИЙ, РЕПТИЛИЙ И НАСЕКОМЫХ

Среди жиров птиц наиболее исследован куриный жир. По жирнокислотному составу ([M] = 1, [П] = 21—25, [C] = 5—6, [По] = 7—10, [О] = 37—45, [Л] = 15—17, [Ле] = 2, [S] = 33, [U] = 67%) он близок к жиру кролика (стр. 205) и отличается от последнего меньшим содержанием миристиновой и пальмитиновой кислот. Распределение кислот между 1,3- и 2-положениями определяется только их ненасыщенностью, причем [S]₂ не превышает 20%. В противоположность жирам млекопитающих, в жирах птиц пальмитиновая кислота сосредоточена преимущественно в 1,3-положениях. Эта черта строения сближает жиры птиц с жирами рептилий, амфибий, рыб и беспозвоночных. От жиров более высоко организованных животных, жиры птиц отличаются почти симметричным распределением кислот между положениями 1 и 3: характерная для животных жиров картина (стр. 199) хотя и сохраняется, но абсолютные различия концентраций отдельных видов кислот не превышают 2—3%. Типовой состав жира близок к статистическому. В составе S₂U отношение [SSU]/[SUS] = 2/3, а величина [USU] составляет ¹/₅ — ¹/₃ от [SUU]. ПТС и ПВС триглицеридов соответствуют теории Вандер Валя [84, 133, 144, 207, 213, 368, 369, 655, 658, 1007]. <\br> Жиры фазана и утки близки по свойствам к куриному. Однако в жире фазана по сравнению с куриным величина [S]₂ равна 20—11% и концентрации SSU- и USU-изомеров соответственно снижены. Жиры фазана и курицы сходны по составу кислот с некоторыми сортами свиного жира, но различия в ПВС приводят к тому, что свиной жир однороден при комнатной температуре, а куриный жир расслаивается на жидкую и твердую фракции, так называемый «стеарин». В жире утки в составе 16 : 1 и 18 : 1 кислот на долю Δ⁹-изомеров приходится 91—92%, а на долю Δ⁷- и Δ¹¹-изомеров — около 8—9%; различий в распределении отдельных изомеров кислот между 1,3- и 2-положениями не обнаружено [135, 144, 207, 208, 212]. Жиры индейки и голубя также сходны с куриным, если не считать повышенного содержания стеариновой и пальмитиновой кислот и пониженного уровня олеиновой [144, 207].

К птичьим жирам примыкают жиры мучного червя (личинки жука Tenebrio mollitor) и лягушки, в которых, однако, более резко выражены обычная для животных жиров 1,3-асимметрия (стр. 199). Жир мучного червя по ПВС ([S]₂ < 2%) напоминает растительные масла, а в жире лягушки повышено содержание линолената (>10%) [131]. Жиры других амфибий, а также жиры рептилий сходны с жирами пресноводных рыб: в них появляются кислоты с m = 20—22, заметные количества моноеновых и следы полиненасыщенных кислот. Эти жиры служат как бы переходным звеном между жирами рыб и птиц [142].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ГРЫЗУНОВ, ХИЩНИКОВ И ПРИМАТОВ

Из жиров грызунов данные триглицеридного состава имеются лишь для жиров крысы и кролика и в меньшей степени для морской свинки, мыши и суслика. Состав жирных кислот в триглицеридах крысы очень изменчив и сильно зависит от жиров рациона: [По] изменяется от 4 до 18%, а [Ле] от 0,3 до 26%. М и По в жире крысы сосредоточены в 1,3-положениях, Л — в 2-положении, а олеиновая — в положениях 2 и 3, в которых она распределяется в равной степени. В глицеридах лимфы и плазмы отдельные кислоты по сродству к 2-положению глицеридов распределяются в порядке Л > П > О. На безжировом рационе кислоты 16 : 1 и 18 : 1 на 90% состоят из Δ⁹-изомеров; небольшие количества 16 : 1⁷ и 18 : 1¹¹ изомеров содержатся главным образом в 1,3-положениях. Несмотря на отмеченные различия, типовой состав ПТС и ПВС жировой ткани, лимфы и плазмы крысы в общем близок к статистическому: абсолютная разность вычисленных и найденных значений редко превышает 2%. Жиры внутренних органов крысы сходны между собой по ПТС глицеридов; под влиянием жиров рациона ПТС значительно меняется [84, 135, 141, 144, 224, 368, 639, 655, 781, 885, 953, 954, 961, 1007].

Жир кролика по составу кислот напоминает жир крысы: в среднем имеется по 30% олеиновой и пальмитиновой кислот, <\br> 20% линолевой и равные количества По, М, Ле и С. Исключая последние четыре кислоты, различия в концентрации отдельных кислот в 1-, 2- и 3-положениях невелики; миристиновая, пальмитолеиновая и линоленовая содержатся преимущественно в 2-, а стеариновая — в 1,3-положениях глицеридов. Типовой состав и ПТС триглицеридов близки к статистическим. Вычисленный по Вандер Валю видовой состав жиров кролика, морской свинки и суслика мало отличается от найденного хроматографически: 35% ПО₂, 20—30% О₃, 15—20% П₂О и др. Углеродный состав глицеридов крысы, кролика, морской свинки и мыши при содержании на одном и том же рационе примерно одинаков: глицериды с m = 48, 50, 52 и 54 составляют 5—6, 23—25, 39—43 и 21—26% соответственно [84, 144, 207, 208, 213, 368, 885, 915].

К числу хищников, глицериды которых изучались, принадлежат собака, кошка и норка. В жире собаки содержится в среднем 42—52% О, 23% П, 9—12% С, 8—10% Л и по 3—5% М и По. Обычная для животных жиров позиционная специфичность невелика — величины [S] и [S]₂ близки. Поэтому жир собаки почти единственный из животных жиров, где типовой состав и ПТС в пределах ошибки опыта отвечают статистическому распределению. Кроме того, триглицериды собаки отличаются от других жиров особенно несимметричным распределением отдельных ацилов в 1- и 3-положениях глицеридов — сумма [П] + [С] в этих положениях равна 48 и 30%, а величина [О] + [Л] — 41 и 64% соответственно. В 18 : 1 кислотах, независимо от их положения, 90% приходится на олеиновую кислоту и около 10% — на 18 : 1¹¹-изомер. В распределении 16 : 1 кислот имеются характерные различия — в 1,3-положениях содержание 16 : 1⁷-изомера выше [84, 135, 144, 915].

Жир кошки по составу кислот и стереоспецифичности сходен с жиром собаки, но различия между [S] и [S]₂ выражены здесь резче. Для сходного с жиром собаки жира норки характерно повышенное содержание Л, появление эйкозеновой кислоты и преобладание S₁-энантиомерных триглицеридов: по содержанию стеариновой кислоты 1-положения в пять раз превосходят положения 3 [141, 144].

Подкожная жировая ткань человека по жирнокислотному составу несколько напоминает свиной жир и сильно изменяется под влиянием жиров рациона. Преобладают олеиновая и пальмитиновая кислоты — около 45 и 25% соответственно; содержится также по 6—7% С, По и Л, 4% миристиновой и следы лауриновой, тетрадеценовой, пентадекановой, пентадеценовой, гептадекановой, гептадеценовой, линоленовой и эйкозеновой кислот. В транспортных триглицеридах хиломикронов по сравнению с запасными уровень Л повышен до 35%. ПВС запасного жира типичен для животных глицеридов: [П]₂ не превышает 10%, а [С]₂ — 1—2%; в 2-положениях сосредоточены U-кислоты и миристиновая кислота. По характеру распределения ацилов между <\br> 1- и 3-положениями глицеридов также имеется сходство с другими животными жирами: По и насыщенные ацилы сосредоточены в 1-, а главные ненасыщенные ацилы — в 3-положениях. Указанная картина распределения изменялась после переэтерификации [109, 130, 144, 368, 915].

По типовому составу ([S₃] = 0—2%, [S₂U] = 15—16%, [SU₂] = 50—60%, [U₃] = 20—30%) триглицериды человека отличаются от сходного по ненасыщенности свиного жира более высоким содержанием SU₂ и U₃; возможно, это связано с большим содержанием в последнем стеариновой кислоты. В S₂U имеется приблизительно одинаковое количество обоих позиционных типов, а доля USU в SU₂, вероятно, не превышает 3—6%. Вычисление ПТС по Вандер Валю дает результаты, завышенные для [S₃]vw, [S₂U]vw и [U₃]vw и заниженные на 5—10% — для [SU₂]vw. Таким образом, жир человека в целом не отвечает позиционно-статистическому распределению. Не исключено, что отсутствие совпадения связано с неоднородностью жира, возникшей вследствие непрерывно меняющегося взаимовлияния эндо- и экзогенного жира. Расчет ПТС, согласно теориям 1-статистического, 2-статистического, 3-статистического и 1,3-статистического, 2-статистического распределения (стр. 164), дает почти одинаковые результаты (стр. 178). В видовом составе содержались ПО₂ (37%), S₂O и SОЛ (по 13%), О₃ (18%), ЛО₂ (8%) и др. [105, 211, 212, 820, 915].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ СВИНОГО ЖИРА

Триглицериды жировых тканей свиньи исследованы больше, чем какой-либо другой животный жир. Однако полная картина триглицеридного состава свиного жира еще не создана, поскольку на этот состав оказывают сильное влияние жиры рациона и другие факторы [368]. Поэтому далее рассматриваются главным образом жиры, синтезированные на безжировом рационе.

В табл. 22 приведены средние данные жирнокислотного состава суммы и отдельных положений триглицеридов подкожной жировой ткани и других тканей свиньи [67, 84, 88, 135, 137, 144, 172, 207, 209, 212, 289, 368, 369, 462, 596, 655, 656, 705, 797, 819, 907, 914, 915, 1011]. В свином жире, иодное число которого равно приблизительно 60, содержатся также следы 12 : 0, 15 : 0, 17 : 0, 14 : 1, 15 : 1, 17 : 1, 20 : 1 и 20 : 4 кислот. Почечный жир свиньи и других животных отличается от подкожного большей насыщенностью и меньшим содержанием олеиновой и линолевой кислот [172, 268, 907], а внутренние слои подкожного жира по ненасыщенности несколько уступают внешним слоям [84, 289]. Систематическое включение в рацион поросят китового жира или сафлорового масла со времени отъема вызывает адекватные и весьма глубокие изменения жирнокислотного состава: так, в последнем случае содержание линолевой кислоты в жире возрастало до 54% [368, 705]. <\br> Таблица 22 Средний состав главных жирных кислот суммы и отдельных положений триглицеридов свиного жира (в мол %)

Из табл. 22 видно, что в 2-положениях свиного жира содержатся преимущественно жирные кислоты с m ≤ 16, а 18 : 0, 18 : 1 и 18 : 2 кислоты сосредоточены в основном в 1,3-положениях. Эта особенность, которая, наряду с жиром домашней свиньи свойственна жирам дикого кабана (Sus scrofa) и пеккари (Peccari angulatus и P. tojacu), отличает свиной жир от подавляющего большинства других природных жиров, в том числе и от жиров таких парнокопытных как бегемот, верблюд и др. [705], и сильно влияет на физико-химические свойства этого жира (стр. 148). Преобладание пальмитиновой и других кислот с более короткой цепью в 2-положении наблюдается во всех свиных жирах, независимо от ненасыщенности и анатомического происхождения (за исключением жира печени), но в почечном жире и во внутреннем слое подкожного жира эта тенденция выражена резче [105, 207].

Следовательно, распределение кислот в отдельных положениях глицеридов отличается от статистического и определяется не ненасыщенностью, а длиной цепи [137, 907]. Так, повышение уровня стеариновой кислоты в жире не приводит к росту его содержания в 2-положениях за счет концентрации пальмитиновой [207]. В 1,3-положениях свиного жира отдельные кислоты распределены крайне несимметрично (табл. 22): пальмитиновая почти полностью, а стеариновая — на ²/₃ сосредоточены в положениях 1, в то время как кислоты 18 : 1 и 18 : 2 сосредоточены преимущественно в положениях 3 [144]. На безжировом рационе ацилы 16 : 1 и 18 : 1 в сумме глицеридов и в 2-положениях на 90% состоят из Δ⁹-изомеров; на содержащем жир рационе соотношение 18 : 1 изомеров почти не меняется, но 16 : 1⁷ сосредоточен преимущественно в 1,3-, а 16 : 1⁹ — в 2-положениях (стр. 223). Таким образом, свиной жир в общем соответствует <\br> Рис. 34. Позиционно-типовой состав ряда свиных жиров в зависимости от содержания насыщенных кислот в жире 1 — статистическое распределение; 2 — вычислено по Вандер Валю

схеме строения большинства животных жиров. От других жиров свиной жир отличается преобладанием жирных кислот с более короткой цепью в 2-положениях глицеридов [133, 135].

Типовой состав глицеридов свиного жира, как и их жирнокислотный состав, колеблется в довольно широких пределах. В среднем при росте [S] с 34 до 51% содержание S₃ повышается с 2 до 10%, [S₂U] — с 19 до 45%, [SU₂] снижается с 57 до 40%, а [U₃] с 21 до 6%. В почечном жире (см. выше) величины [S₃], [S₂U] и [SSU] выше приведенных. Типовой состав глицеридов свиного жира отличается от статистического (RD): обычно [S₃]RD и [U₃]RD выше, а [SU₂]RD — ниже найденного, лишь содержание [S₂U] близко к статистическому. Вычисленное по Картха [SU₂]к сильно расходится с фактическим. По данным, полученным методом кристаллизации, типовой состав жира дикого кабана соответствует теории Хилдитча [773].

В ПТС жира преобладание пальмитата в 2-положениях вызывает еще более значительные отклонения от статистического распределения. Содержание изомеров SUS и SUU, независимо от жирнокислотного состава суммы триглицеридов, обычно постоянно и составляет 1—2% и 7—9% соответственно. Величина [USU] + [SSU] также, следовательно, постоянна и равна 65—70%, причем между концентрациями каждого из позиционных типов имеется обратно пропорциональная зависимость, поскольку при росте [S] с 34 до 51% содержание [SSU] возрастает с 20 до 39%. В последней фракции найдены оптически активные глицериды с избытком S в 1-положениях. ПТС можно определить по жирнокислотному составу жира, пользуясь графиками (рис. 34). Найденный хроматографически ПТС свиного жира и сходный с ним ПТС жира свиного молока ближе соответствует распределению по Вандер Валю, чем чисто статистическому: для отдельных фракций абсолютные различия достигают 6—7% вследствие несимметричного распределения ацилов в глицеридах (табл. 22). После переэтерификации ПТС соответствует статистическому. ПТС почечного жира (см. выше) закономерно отличается на 1—7% в одну и ту же сторону для каждого позиционного типа от соответ- <\br> ствующих величин, вычисленных по Вандер Валю, причем значения [SUS]vw, [SUU]vw и [USU]vw обычно завышены, а [SSU]vw и [U₃]vw — занижены [67, 84, 105, 107, 172, 207—209, 212, 368, 655, 658, 739, 805, 819, 826, 907, 953—955, 1007].

Изучение олефинового состава триглицеридов свиного жира показало, что в отдельных жирах содержание глицеридов с е = 0, 1, 2, 3 и 4 и более составляет 2—12, 16—36, 36—59, 12—24 и 5—13% соответственно. В углеродном составе около 90% глицеридов содержит 50, 52 и 54 атома углерода; имеются также фракции с m = 42—48 и с m = 56. Данные ПВС из-за значительных различий в жирнокислотном составе между разными жирами сильно отличаются друг от друга, поэтому здесь можно привести лишь диапазон концентраций. Более ¹/₂ глицеридов приходится на ОПО + СПО, соотношение которых равно 1,5; содержится также 7—15% триолеина и ОПЛ, 2—8% ППО и ПОО, 2—4% ООЛ, 2—3% СПС, СПЛ и ОСО, 1—3% ЛПЛ и 1—2% ППС, COC, OCO, ОМО, ПЛО, ОЛО и ОЛЛ. Содержание остальных глицеридов не достигает 1%. В ряде работ говорится о соответствии ПВС теории Вандер Валя. Однако сейчас установлено, что распределение пальмитиновой и стеариновой кислот в триглицеридах не является статистическим: так, соотношение этих кислот в жире равно 1,5—3,5, а в S₃ — 1—1,5. Кроме того, содержание глицеридов с m = 50 во фракции S₃ и глицеридов с m = 52 во фракции с е = 1 было много выше вычисленного. Наконец, величина [П]₂ в триглицеридах различных типов из ряда органов свиньи варьирует от 60—70% в S₃ до 100% в SОЛ и SO₂. Все это свидетельствует о принципиальной неприменимости расчета по Вандер Валю к ПВС свиного жира [88, 105, 207, 209, 213, 368, 462, 596, 797, 819, 914, 915, 955].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ КОПЫТНЫХ

Говяжьи жиры, возможно из-за большей однородности рациона крупного рогатого скота, менее различаются по жирнокислотному составу, чем свиные. В наиболее широких пределах изменяется содержание стеариновой и олеиновой кислот, составляющее около 21—34 и 29—42% соответственно. Концентрация суммы этих кислот в отдельных говяжьих жирах (55—60%) более постоянна. Это, вероятно, связано с различной активностью десатураз, превращающих стеариновую кислоту в олеиновую, в разных жировых тканях. В жире содержится также 27—34% пальмитиновой кислоты, 4—6% миристиновой, 3—5% пальмитолеиновой, по 1—2% линолевой и 14 : 1 кислот и следы 18 : 3. Таким образом, в большинстве жиров 50—75% всех ацилов — насыщенные. Жирнокислотный состав отдельных тканей зависит от их анатомического положения. Так, внутренние слои подкожного жира, почечный и кишечный жир содержат больше стеарата в составе кислот с m = 18, чем внешний подкожный жир, и от- <\br> личаются от него по ПТС, а жир брыжейки занимает промежуточное положение [84, 172, 207, 213, 655, 705, 805, 826, 953].

Позиционное распределение ацилов в говяжьем жире, как и в других животных жирах, за исключением свиного, в большей степени определяется ненасыщенностью, чем длиной цепи. Однако избирательное сродство U-ацилов к 2-положениям в этом жире много ниже, чем в растительных маслах, а такая насыщенная кислота, как миристиновая, сосредоточена преимущественно в 2-положениях. В среднем 2-положения глицеридов содержат 8—10% миристиновой, 2—3% тетрадеценовой, 15—20% пальмитиновой, 6—9% пальмитолеиновой, 2—10% стеариновой, 52—60% олеиновой и 3—5% линолевой кислот. Несимметричность строения глицеридов выражена сравнительно слабо; кислоты с m = 14—16 большей частью сосредоточены в 1-, а кислоты с m = 18, в том числе и стеариновая — в 3-положениях [84, 144, 172, 207, 213, 368, 369, 705].

Типовой состав говяжьего жира зависит от состава кислот: при росте [S] с 50 до 73% наблюдается повышение [S₃] с 13 до 30% и [S₂U] с 40 до 58% при одновременном снижении [SU₂] с 33 до 20% и [U]₃ с 8 до 3%, причем в S₂U около 13—18% составляет SSU, а в SU₂ доля USU равна 3—6%. Говяжий жир отличается от свиного тем, что типовой состав его глицеридов близок к статистическому и специфическому ограниченно-статистическому типовому составу. Однако ПТС и ПВС говяжьего жира резко отличаются от статистического из-за преобладания U в 2-положении и удовлетворительно согласуются с вычисленными по Вандер Валю. Хроматографические данные по видовому составу и ПВС этого жира еще не получены. Предполагается, что к числу главных глицеридов относятся ПОО, СОО, СОП, ПОП, ППО, ППС и ППП [84, 172, 207, 213, 368, 491, 655, 805, 826, 953, 954].

Бараний жир сходен с говяжьим по жирнокислотному составу и отличается от последнего лишь несколько пониженной концентрацией кислот с m = 14—16 и повышенным уровнем стеариновой и олеиновой кислот. В среднем в бараньем жире содержится 35—43% олеиновой, 30—35% стеариновой, 21—26% пальмитиновой, 2—4% миристиновой и 1—2% пальмитолеиновой и линолевой кислот. Значение [S] обычно не превышает 60% и, как всегда, зависит от анатомического положения ткани. Сходен с говяжьим и состав 2-положений — около 60% кислот приходится здесь на долю олеиновой, а ¹/₂ S-кислот — на стеариновую. Интересно, что в 2-положениях глицеридов лимфы овцы уровень пальмитиновой кислоты достигает 55%, что сближает их с глицеридами свиного жира. Типовой состав бараньего жира (15—20% S₃, 39—42% S₂U, 27—34% SU₂ и 5—8% U₃) близок к статистическому и позиционно-статистическому уровню, но ПТС отличается от статистического, поскольку SSU и USU занимают в составе S₂U и SU₂ соответственно приблизительно <\br> ту же долю, что и в говяжьем жире; по ПВС эти жиры также сходны. О полиморфизме глицеридов бараньего и говяжьего жира см. стр. 149 [84, 172, 207, 213, 289, 368, 655, 705, 805].

Из жиров других копытных по составу глицеридов изучены жиры оленя, козы, бегемота, верблюда и лошади. По типовому составу и ПТС жиры оленя и козы фактически не отличаются от говяжьего или бараньего жира с соответствующей величиной [S]. По жирнокислотному составу ([S] = 58—60%) олений жир близок к бараньему, а по составу 2-положений — к говяжьему [84, 368, 705]. Жиры бегемота и верблюда по составу кислот жира аналогичны говяжьему; однако преобладание олеиновой кислоты в 2-положениях выражено здесь резче, а содержание пальмитиновой и стеариновой в 3-положениях не превышает 10—15% и 6—7% соответственно [705].

Жир лошади отличается от жиров парнокопытных большей ненасыщенностью ([S] = 36%). Наряду с 16—17% линоленовой он содержит 34—37% олеиновой, 26—27% пальмитиновой, по 4—7% стеариновой, пальмитолеиновой и линолевой и 2—4% миристиновой кислот. Концентрация S в 2-положениях не превышает 17%. Пальмитиновая кислота, как обычно, сосредоточена преимущественно в 1-положениях, олеиновая — в 3-положениях, а другие ацилы распределяются симметрично. Найденные значения [S₃] и [S₂U] лошадиного жира близки к статистическим; однако [SU₂]RD оказался ниже, а [U₃]RD — выше найденного [144, 655].

Глава 15. СОСТАВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПЕЧЕНИ И МОЛОЧНОГО ЖИРА

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ПЕЧЕНИ СВИНЕЙ И РОГАТОГО СКОТА

В липидах печени млекопитающих содержится значительно меньше триглицеридов, чем в жировой ткани, а сами эти глицериды, как правило, отличаются по составу от запасного жира соответствующего вида животного. Вместе с тем жиры печени различных млекопитающих имеют ряд общих признаков: пониженное содержание стеариновой и пальмитиновой, повышенную концентрацию линолевой и присутствие 2—4% арахидоновой кислоты. Обычно по составу кислот эти триглицериды ближе к фосфолипидам печени, чем к триглицеридам жировой ткани. Более подробно изучены глицериды печени свиньи, крупного рогатого скота и грызунов.

Печень свиньи по величине [S]/[U] ≈ 0,7 и по набору кислот в триглицеридах близка к соответствующей жировой ткани, однако в видовом составе кислот имеются отклонения, отмеченные выше. Данные о позиционном распределении ацилов противоречивы: согласно одним результатам, в 2-положениях, как и в запасном жире, сосредоточены миристиновая, пальмитиновая <\br> и пальмитолеиновая кислоты; согласно другим, печеночный жир свиньи построен подобно большинству животных жиров, но отличается преобладанием U-кислот и низким (не более 15%) уровнем пальмитиновой кислоты в 2-положениях. На основе последних данных определили типовой состав и ПТС жира печени; соотношение между найденным и вычисленным статистическим типовым составом было таким же, как и для запасного жира (стр. 209). ПТС обнаруживал обычные для животных жиров отклонения от статистического уровня. Результаты вычисления ПВС противоречивы; более однородны данные по олефиновому составу: около ¹/₂ глицеридов имеет е = 2 и 3, а доли глицеридов с е = 1, 4 и 5 приблизительно одинаковы [84, 105, 137, 837].

Триглицериды печени крупного рогатого скота по жирнокислотному составу сильно отличаются от запасных глицеридов: содержание стеариновой кислоты снижено до 4%, примерно равные концентрации олеиновой и пальмитиновой составляют в сумме около 80%, содержание пальмитолеиновой повышено до 6%, а остаток приходится на долю 18 : 3, 18 : 2, 14 : 0, 15 : 0 и других минорных компонентов. В 2-положениях преобладают U-ацилы, а все S-ацилы находятся в основном в 1,3-положениях. Типовой состав глицеридов близок к статистическому, а ПТС и ПВС соответствуют вычисленным по Вандер Валю. К главным глицеридам относятся SOO, SOS, SSO и ООО, составляющие вместе около 80% от суммы [837].

Триглицериды печени овец, в отличие от соответствующих компонентов печени крупного рогатого скота, по концентрации стеариновой, пальмитиновой и олеиновой кислот почти не отличаются от запасного жира низкой ненасыщенности, но содержат около 12% миристиновой и по 5% пальмитолеиновой и линолевой кислот. Состав 2-положений также характеризуется высокой насыщенностью (около 30—50% S — пальмитиновой, миристиновой и 15% стеариновой). В этих глицеридах обнаружены многократно разветвленные кислоты, не отщепляемые липазой из-за стерических затруднений. Типовой состав глицеридов почти совпадает со статистическим, но в ПТС имеются значительные отклонения. Равные количества S₃ и SU₂ составляют ¹/₂ триглицеридов, а содержание U₃ не превышает 5% [84, 289].

ТРИГЛИЦЕРИДЫ ПЕЧЕНИ ГРЫЗУНОВ И ХИЩНИКОВ

В противоположность глицеридам печени овец, триглицериды печени крысы, получающей безжировой рацион, содержат 25% S, а [S]₂ составляет здесь всего 11% (почти полностью пальмитиновая). Главными кислотами являются линолевая (42%), олеиновая (25%) и пальмитиновая (21%), составляющие вместе с арахидоновой и стеариновой около 95% суммы кислот. Повышенная ненасыщенность жира отражается на его ПТС: содержится всего <\br> Таблица 23 Позиционно-типовой состав триглицеридов печени крысы на безжировом рационе (в вес %) [105]

по 2% SSS и USU и 4—7% SSU, а из высоконенасыщенных изомеров имеется 60% SUU, 14—18% UUU и 12—15 SUS. По одним данным, типовой состав и ПТС этих глицеридов хорошо соответствует теории Вандер Валя [224, 837], а согласно другим, по-видимому более достоверным результатам, значительно от нее отклоняется: независимо от наличия жиров в рационе, величины [SUS]vw и [UUU]vw сильно завышены, а значения [SUU]vw — занижены против найденных (табл. 23) [15, 107, 211].

Существует также мнение о полном соответствии видового состава глицеридов печени крысы теории Вандер Валя [837]. Однако данные о резко несимметричном распределении S и U между положениями 1 и 3 этих глицеридов и об отсутствии жирнокислотной специфичности при ацилировании 1,2-диглицеридов (стр. 277) противоречат этому выводу. В табл. 24 приведены результаты разделения триглицеридов преобладающего в жире SU₂-типа и последующего стереоспецифического анализа отдельных фракций с применением диглицеридкиназы. Найденный состав триглицеридов сравнивали с составом, вычисленным по составу кислот 1-, 2-, 3-положений, и обнаружили, что он значительно ближе к составу, рассчитанному по данным стереоспецифического анализа, чем к S-видовому составу, вычисленному по теории Вандер Валя. В то же время резкое преобладание S₁-изомеров во всех SU₂-глицеридах приводит к тому, что уравнения Вандер Валя становятся полностью непригодными для расчета стереовидового состава триглицеридов печени крысы [616, 882, 883].

Наконец, следует упомянуть о сходных между собой триглицеридах печени кролика и собаки. В них имеются примерно равные количества S и U, причем в составе первых содержится около 40% пальмитиновой и одинаковые концентрации миристиновой и стеариновой, а в последних — 30—40% олеиновой, 10—16% линолевой и 3—7% пальмитолеиновой кислот. В 2-положениях глицеридов довольно много S-ацилов (около 16—34%), с преобладанием пальмитата и миристата; в этих же положениях со- <\br> Таблица 24 Вычисленный и найденный стереовидовой состав SU₂-триглицеридов и печени крысы (в вес %) [882]

средоточена большая часть ненасыщенных кислот. Типовой состав глицеридов близок к статистическому, как это наблюдается и в жировых тканях тех же животных. Однако ПТС печени, в отличие от жировых тканей, значительно отличается от статистического: 6—7% S₃, 7—12% SSU, 2—5% USU, 22—33% SUS, 28—39% SUU и 12—16% U₃ [84, 733].

ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МОЛОЧНОГО ЖИРА

Еще в начале ХІХ в. Шеврель именно на примере молочного жира установил химическую природу триглицеридов (стр. 10). Он обнаружил в этом жире летучие жирные кислоты — масляную, капроновую и каприновую [288, 368]. Однако и сейчас молочный жир исследован еще недостаточно, а имеющиеся данные относятся главным образом к жирам крупного и мелкого рогатого скота. В то же время знать глицеридный состав молочного жира необходимо, поскольку триглицериды являются важнейшей составной частью липидов молока, а распределение ацилов во многом обусловливает качество сливочного масла и других молочных продуктов [120, 425, 596].

При помощи газохроматографического анализа бутиловых или 2-хлорэтиловых эфиров жирных кислот (в программированном температурном режиме), а также другими методами обнаружили, что кислоты важнейших молочных жиров имеют m = 4—26. Обычно преобладают пальмитиновая (около 25%), олеиновая (35—40%; в эту величину входит около 7% транс-вакценовой и других транс-18 : 1 кислот), летучие кислоты с <\br> m = 4—10 (15—20%), миристиновая и стеариновая (по 5—10%). Именно эти кислоты чаще всего учитываются при вычислении триглицеридного состава. Всего же в молочном жире содержится 64 жирные кислоты — н-насыщенные («четные» и «нечетные»), н-моно-, -ди-, -три- и полиненасыщенные (цис- и транс-изомеры), изо-, антеизо- и многократно разветвленные кислоты. Кроме летучих кислот для молочного жира характерны Δ⁹-гомологи олеиновой с m = 10—16. Содержание в коровьем молоке линолевой кислоты, незаменимой в питании животных, по-видимому, незначительно. В молочных жирах много минорных компонентов, причем 27 из них составляют в сумме 1% от общего количества кислот. Жиры молока отдельных видов животных различаются по жирнокислотному составу. Содержание летучих кислот в молочном жире травоядных выше, чем в других молочных жирах, причем среди летучих кислот молока коровы преобладают C₄—₆-, овец и коз — C₈—₁₀-, а лошади, крольчихи и крысы — C₈—₁₂- жирные кислоты. У других животных молочные жиры обычно сходны по составу с запасными: например, для молока свиньи и человека характерна линолевая кислота, для молока морских животных — полиненасыщенные кислоты с m = 20—22 и т. д. Глицеридный состав этих жиров изучен еще мало; при дальнейшем изложении термином «молочный жир» обычно обозначается жир коровьего молока [104, 127, 424, 425, 592, 885].

ГРУППОВЫЕ КАТЕГОРИИ СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ МОЛОЧНОГО ЖИРА

Исследование углеродного состава триглицеридов позволило разделить изученные до сих пор молочные жиры на три группы. К одной из этих групп принадлежат жиры коровьего, козьего и овечьего молока, которые отличаются большим набором триглицеридов от m = 26 до m = 56 с двумя максимумами при m = 38—40 и 50—52. Даже в самой летучей фракции глицеридов не обнаружены C₂₄ и более легкие компоненты, которые содержали бы два и три остатка летучих кислот. При газовой хроматографии триглицеридов между главными «четными» пиками обычно обнаруживаются минорные пики, содержащие триглицериды с одним «нечетным» или разветвленным ацилом. В видовом составе каждого «четного» пика триглицерида, имеющего обычно все главные кислоты исходного жира, может быть десять и более компонентов, поэтому видовой состав молочного жира, по данным углеродного состава, можно определить лишь весьма приближенно. Изучение насыщенных и моноеновых глицеридов фракции молекулярного дистиллята жира с m = 26—38 (см. рис. 3) позволило установить, что олеиновая кислота содержится главным образом в триглицеридах с m = 36—38. Как показывает рис. 8, найденный углеродный состав молочного жира значительно отличается от статистического по числу и концентрации отдель- <\br> ных пиков. Это различие выражено еще сильнее в наиболее летучих фракциях жира. Переэтерификация (см. рис. 9) вызывает заметные изменения в углеродном составе, которые указывают на преимущественное образование пальмитодистеарина и триглицеридов с короткой цепью. По углеродному составу молочного жира можно легко установить его фальсификацию: примесь даже 5—10% свиного жира или растительного масла достоверно обнаруживается по непропорциональному увеличению пиков с m = 52 и 54 [104, 127, 248, 592, 596—598, 775, 884, 885].

В олефиновом составе молочного жира найдено 35 фракций. При обычной тонкослойной хроматографии триглицериды молока разделяются на фракции Д₃ и КоД₂ в отношении 2 : 1 (Ко и Д — остатки жирных кислот с m < 12 и с m ≥ 12 соответственно), что само по себе исключает возможность статистического распределения. При переэтерификации жира получали статистические количества Ко₃, Ко₂Д и КоД₂ [104]. Тонкослойная хроматография диглицеридов — продуктов частичного деацилирования триглицеридов молочного жира — дала три зоны: 1,2(2,3)-КоД, 1,3-КоД + 1,2(2,3)-ДД и 1,3-ДД [1011]. Отдельные фракции, полученные противоточным распределением, больше отклоняются от статистического распределения, чем исходный жир [884].

ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ КАТЕГОРИИ СОСТАВА ТРИГЛИЦЕРИДОВ МОЛОЧНОГО ЖИРА И ЕГО БИОСИНТЕЗ

Липазный гидролиз показал, что, в отличие от большинства животных жиров, в 1,3-положениях глицеридов молочного жира преобладают стеариновая, октадеценовая и иногда каприновая кислоты, а в 2-положениях — лауриновая, миристиновая, тетрадеценовая, гептадекановая, пальмитиновая и пальмитолеиновая. Вычисленный по этим данным ПТС жира отличается от статистического. Значительных различий между отдельными положениями по содержанию линолевой и линоленовой кислот не было обнаружено [73, 110, 119, 120, 127, 288, 368, 425, 445, 597, 598, 669, 884, 995]. Положение летучих кислот окончательно не установлено, поскольку липаза для этой цели непригодна (стр. 117). Можно лишь предположить, что эти кислоты в большей мере сосредоточены в 1,3-положениях [104, 119, 120, 599, 775].

Несмотря на очевидное несоответствие других категорий состава молочного жира статистическому распределению, его типовой состав приближается к статистическому. Возможно, это объясняется сильной гетерогенностью и большой сложностью жира, который, имея 64 вида кислот, может содержать свыше 250 000 триглицеридов. Высокая концентрация S₃ в молочном жире (15—40%) определяет его большую твердость [73, 110, 884]. Триглицериды оболочки глобулы молочного жира тверже остального жира, так как они не содержат летучих кислот и по строению напоминают свиной жир. В 2-положениях этих глицеридов имеются <\br> почти исключительно насыщенные кислоты с m = 14—18, а в 1,3-положениях — каприновая, лауриновая, олеиновая и линолевая [288, 995].

Вследствие несоответствия состава триглицеридов молочного жира статистическому распределению вопрос о возможном механизме их биосинтеза остается открытым. Предположение Хилдитча о возникновении летучих кислот путем ступенчатого укорочения остатков олеиновой кислоты в триглицеридах рациона или путем селективного обмена этих остатков на ацилы летучих кислот в дальнейшем не подтвердилось. В настоящее время твердо установлено гетерогенное происхождение молочного жира: с одной стороны, этот жир возникает из глицеридов пищи, поскольку в нем легко обнаружить включаемые в рацион необычные жирные кислоты (эруковую, 9,10-Н³-стеариновую и др.); с другой стороны, летучие кислоты триглицеридов синтезируются в самой молочной железе из ацетата и оксибутирата. Если учесть к тому же, что летучие кислоты встречаются в молочном жире только в составе КоД₂-триглицеридов, то можно предположить, что триглицериды молока образуются из поступающих в молочную железу диглицеридов с длинной цепью в результате ацилирования последних эндогенными летучими кислотами. Однако более вероятно, что диглицеридные предшественники молочного жира также возникают в самой железе. В пользу этого вывода свидетельствует тот факт, что диглицериды, получаемые при липазном гидролизе молочного жира, и нативные диглицериды, заведомо синтезированные самой железой, сходны по жирнокислотному составу [120, 127, 288, 368, 599, 669, 775].

По углеродному составу их молочных жиров кроме жвачных исследованы еще две группы животных. Жиры лошади, крольчихи и крысы сходны по широте спектра триглицеридов с жирами жвачных из-за преобладания кислот с m = 8—12, содержание которых в кроличьем молоке достигает 65, а в крысином — 24%. У лошади первый максимум газовой хроматограммы триглицеридов молока смещен к C₄₂, а «нечетные» триглицериды отсутствуют. Молочный жир крысы имеет лишь один максимум при C₄₀—₄₄, а жир кроличьего молока — три максимума при m = 26—28, 34—36 и 42—44. Молочный жир мыши, содержащий глицериды с m = 32—56 с максимумом при m = 52, служит переходной ступенью к последней группе, в которую входят молочные жиры человека, собаки и морской свинки, имеющие узкий спектр глицеридов с m = 44—54 из-за отсутствия в них кислот с m < 10 [127, 885].

Глава 16. ВЛИЯНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ РАЦИОНА НА ТРИГЛИЦЕРИДНЫЙ СОСТАВ ЖИРОВ ОРГАНИЗМА

ВЛИЯНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ РАЦИОНА НА СОСТАВ ТРАНСПОРТНЫХ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Большинство транспортных и запасных жиров, как правило, образуется из эндогенных жирных кислот за счет безжировой части рациона — углеводов и белков [846]. В то же время значительное влияние на жирнокислотный и триглицеридный состав и на строение этих жиров оказывают триглицериды рациона, способные включаться во внутриклеточные липиды без разрушения своих алифатических цепей и без гидролиза всех сложноэфирных связей [203]. Точный учет этого влияния важен для понимания механизма биосинтеза триглицеридов, для изучения этиологии и терапии болезней сердечно-сосудистой системы в связи с липидным составом рациона, а также для поисков практических способов направленного изменения технологических и пищевых свойств животных жиров [781].

Перестройка структуры глицеридов рациона путем ацильной миграции, обеспечивающая гомеостазис физических свойств запасного жира, происходит, по-видимому, в печени или в самой жировой ткани, поскольку транспортные глицериды обычно сходны по строению с триглицеридами рациона (стр. 220) [800, 961]. Многочисленные данные об адекватном изменении жирнокислотного состава липидов организма под действием того или иного состава жирных кислот в рационе здесь не рассматриваются [368].

Триглицериды рациона в тонком кишечнике на 60% гидролизуются панкреатической липазой, давая СЖК и 2-моноглицериды, которые после соединения с желчнокислыми солями образуют гидрофильную мицеллу, способную проникать через стенку кишечника в лимфатическую систему [699, 703]. Ресинтез триглицеридов из липидов мицеллы и эндогенных жирных кислот при этом проникновении приводит к появлению хиломикронов плазмы и лимфы — транспортной формы триглицеридов [204, 217, 846].

Ненасыщенные кислоты и моноглицериды всасываются с одинаковой скоростью, а насыщенные кислоты с m > 12 уступают в этом отношении соответствующим моноглицеридам, которые легко всасываются без гидролиза: моноглицериды с m < 12 расщепляются в слизистой вследствие легкой миграции ацилов летучих кислот (стр. 117) [99, 202]. Несмотря на это, транспортные глицериды часто сходны с пищевыми по [А] и [А]₂ отдельных видов кислот [109, 961]. Для изучения превращений липидов в организме обычно применяют свободные жирные кислоты, а также глицериды с определенным ПВС или с характерным рас- <\br> Рис. 35. Расщепление, поглощение и ресинтез триглицеридов в кишечнике Цифры жирным шрифтом — соотношения различных продуктов расщепления и ресинтеза триглицеридов в расчете на остатки глицерина; цифры тонким шрифтом — то же, в расчете на остатки жирных кислот; α, β — жирные кислоты, занимающие соответственно 1-3- или 2-положение в исходных триглицеридах

пределением меченых ацилов; после экспозиции, длящейся от нескольких часов до нескольких недель, выделяют триглицериды тех или иных органов и определяют состав или радиоактивность продуктов их липазного гидролиза in vitro (стр. 116) [118, 845, 987].

Через 10 час. после скармливания крысам олеата-, пальмитата- или стеарата-C¹⁴ 70—90% соответствующих ацилов триглицеридов лимфы содержали C¹⁴ [217, 987]. Если в рацион включали Г*-1-О*, Г*-1,3-ОО, Г-ООО, Г-ООО, ГООО, Г*ООО или ГООО (Г — остаток глицерина, * — наличие C¹⁴), то в первые часы после скармливания меченого моно-, ди- или триолеина в триглицеридах лимфы обнаруживалось лишь 22% эндогенного немеченого глицерина. Хотя 75% жирных кислот жира рациона всасывалось в свободном виде, их участие в ресинтезе транспортных триглицеридов привело к тому, что в составе последних до 88% 1,3-ацилов и 75% 2-ацилов содержались в тех же положениях, что и в жире рациона (рис. 35) [699, 845]. Аналогичные данные были получены при введении крысам необычного триглицерида трипентадеканоина [961]. В течение следующих суток C¹⁴-триглицериды хиломикронов постепенно разбавлялись эндогенными липидами [118, 204, 703].

Сходство триглицеридов из рациона и из хиломикронов по ПВС, отражающее моноглицеридный путь биосинтеза триглицеридов в слизистой (стр. 264), доказано скармливанием животным синтетических или природных жиров определенной структуры [118]. Так, при скармливании крысе или свинье свиного жира или ОСО, ОПО и других глицеридов значение [S]₂ в транспортных глицеридах превышало 78%, а при введении масла какао, арахиса или кукурузы [S]₂ не достигало и 15%, причем в двух последних случаях независимо от ПВС жировой ткани того или иного животного среди U₂ хиломикронов преобладала линолевая кислота [800].

Различия по ПВС между транспортными и пищевыми глицеридами вызваны примесью эндогенных жиров (стр. 222), ацильной миграцией при гидролизе и ресинтезе (редко превышающей 10—15%) и, наконец, той или иной жирнокислотной специфичностью ацилтрансфераз слизистой и хиломикронов; в результате транспортные глицериды по ПВС обычно занимают промежуточное положение между экзо- и эндогенными триглицеридами [699, 813]. Роль миграции ацилов проявляется сильнее при всасывании жиров, богатых летучими кислотами, например, кокосового масла [202]. При введении его крысам [Ла]₂ исходного масла, содержимого и слизистой кишечника, хиломикронов и жировой ткани составило 59, 53, 38, 33 и 18% соответственно, что указывает на постепенное приближение ПВС жира рациона к строению SUS, свойственному запасному жиру крысы [99].

Влияние жирнокислотной специфичности биосинтеза изучали путем скармливания крысам переэтерифицированных жиров или <\br> свободных кислот [217]. В первом случае 1,3-положения глицеридов хиломикронов занимают стеариновая или олеиновая кислоты (особенно при отсутствии линолевой кислоты в рационе), а также элаидиновая кислота; в 2-положения преимущественно включаются пальмитиновая, линолевая и полиненасыщенные кислоты с m = 20—22 [204]. СЖК рациона в хиломикронах по глицерофосфатному пути биосинтеза превращаются в триглицериды, ПВС которых обычно соответствует эндогенному [109]. Интенсивность и направление присоединения свободных кислот сильно зависят от уровня линолевой кислоты в рационе или эн- <\br> догенных транспортных липидах: при высоком содержании линолевая кислота конкурирует за 2-положения с пальмитиновой и олеиновой, что приводит к их преимущественному присоединению в 1,3-положения. Таким образом, синтез транспортных триглицеридов в целом контролируется специфическими ацилтрансферазными ферментами, и ПВС этих глицеридов далек от статистического [846, 961].

ВЛИЯНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ РАЦИОНА НА СОСТАВ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ЖИРОВЫХ ТКАНЕЙ

Транспортные триглицериды плазмы и лимфы поступают в жировую ткань и печень и откладываются там в виде запасных триглицеридов [987]. ПВС тех и других можно сравнить по величине j_t = [A]₂/[A]₁,₃ = 2[A]₂/3([A] — [A]₂), вычисляемой по данным липазного гидролиза, а степень удерживания состава меченых жирных кислот, свойственного 2-положениям триглицеридов рациона, или так называемой «2-моноглицеридной структуры» этих глицеридов, — по величине S_R = 100 ([A]₂ жировой ткани — 33) : ([А]₂ рациона — 33), где [А]₂ — радиоактивность кислоты А в 2-положении глицеридов в % от ее радиоактивности в сумме глицеридов, 33 — теоретическая доля радиоактивности ацилов в 2-положениях при полной рандомизации глицеридов рациона в жировой ткани [143]. Введение свободных кислот и их соответствующих триглицеридов оказывает сходное действие на ПВС глицеридов жировой ткани благодаря быстрой этерификации СЖК в хиломикронах [781].

Триглицериды рациона, как правило, изменяют соответственно своему составу жирнокислотный состав жировой ткани, а на типовой состав ее глицеридов оказывают меньшее влияние [203]. Последний в большинстве тканей в общем напоминает статистический (стр. 199); под действием жиров рациона он качественно не меняется, а количественно колеблется в сравнительно узком диапазоне вблизи основного типового состава, соответствующего триглицеридам чисто эндогенного происхождения [817]. Значительные отклонения от этого правила наблюдали лишь в отдельных случаях; так с ростом [U₃] в рационе уровень U₃ в организме обычно несколько возрастает [800]. ПТС вновь отложившихся в жировой ткани глицеридов в большей степени определяется специфичностью эндогенного жирового обмена этой ткани и всего организма, чем строением транспортных триглицеридов [224, 846]. Так, триглицериды, образовавшиеся в жировой ткани человека, получавшего с пищей свиной жир, содержали в 2-положениях преимущественно ненасыщенные ацилы [564].

ПТС глицеридов смешанного происхождения обычно приближается к вычисленному по Вандер Валю и изменяется в более узком диапазоне, чем ПТС жира рациона [955]. Если диапазон [S] в рационах различного состава равнялся 1—64%, то величины [S], <\br> [S]₁,₃ и [S]₂ в триглицеридах жировой ткани изменялись от 26 до 38, от 35 до 46, и от 5 до 30% соответственно [781].

При высокой концентрации той или иной жирной кислоты в рационе ее содержание в соответствующем положении запасных триглицеридов повышается. Значения j_t для С, П и М жировой ткани обычно ниже единицы [938]. Жирнокислотный состав глицеридов внутренних органов (печени и др.) меняется под действием жиров рациона медленнее, чем в жировой ткани. В печени величина j_t С, П и М близка к единице [733].

При изучении всасывания триглицеридов, богатых ненасыщенными кислотами, было обнаружено, что в жировой ткани мыши на рационе, лишенном линолевой и арахидоновой кислот, величина j_t этих кислот обычно много выше единицы [647]. После длительного скармливания растительных масел, когда в запасном жире достигается [Л] ≥ 33%, может наблюдаться j_t < 1; если мышей снова перевести на безжировой рацион, то j_t быстро возвращается к норме вследствие первоочередного расходования линолеата из 1,3-положений [937—939]. Величина [Л]₂ не зависит от состава рациона [800]. В жировой ткани крысы олеиновая кислота отличается значительно меньшим, чем линолевая, сродством к 2-положениям и меньшей способностью к замещению S-ацилов в 1,3-положениях при ее избытке в рационе [203, 224, 781].

При частичной или полной замене цис-связей (с) в олеиновой или линолевой кислоте транс-связями (t) снижается включение этих кислот в 2-положения триглицеридов жировой ткани крыс, выращенных на безжировом рационе: для cc-, ct- и tt-изомеров 18 : 2 отмечено параллельное снижение j_t с 4,9 до 0,5 и снижение сродства данного изомера к ацилтрансферазе, специфичной для 2-положений, что доказывает участие этих ферментов в биосинтезе триглицеридов in vivo. С ростом концентрации транс-кислот в рационе их уровень в 1,3-положениях возрастает; одновременное снижение общей ненасыщенности в 2-положениях приводит к тому, что запасные глицериды крысы начинают приобретать несвойственное им строение USU [616, 648, 811, 812].

Полиненасыщенные кислоты рациона с m = 20—22 в жировых тканях норки и крысы распределяются различно. В жире норки наблюдалась прямая зависимость между РМ отдельных видов кислот (стр. 47) и значением их j_t (более гидрофильные ацилы 14 : 0, 16 : 0, 16 : 1, 18 : 2 — преимущественно в 2-положении, а более липофильные — 18 : 0, 20 : 1, 22 : 1, C₂₀—₂₂-полиненасыщенные — главным образом в 1,3-положении). В жире крысы величина j_t была пропорциональна е кислот — все S-ацилы независимо от m находились в основном в 1,3-положениях [141].

Среди моноеновых ацилов (m = 16—22) глицеридов обоих животных ацилы с центральным положением двойной связи (16 : 1⁹, 18 : 1⁹, 20 : 1¹¹, 22 : 1⁹⁺¹¹), образовавшиеся (за исключением ацилов с m > 18) эндогенно, путем дегидрирования <\br> Рис. 36. Распределение массы (1) и радиоактивности (2) между жирными кислотами рациона и лецитина хиломикронов а — рацион А; б — рацион В; в — лецитин А; г — лецитин В

соответствующих S-кислот, были выше по величине j_t, чем изомеры с несимметричным положением связи (16 : 1⁷, 16 : 1¹¹, 18 : 1⁷, 18 : 1¹¹ и др.), которые поступали с рационом [135]. Таким образом, ацилы в 1,3-положениях, возможно под влиянием обратимого действия липазы жировой ткани (стр. 113), быстрее обмениваются с ацилами экзогенных липидов, чем остатки кислот в центральных положениях триглицеридов [353, 733].

РОЛЬ ЭНДО- И ЭКЗОГЕННЫХ ТРИГЛИЦЕРИДОВ В СТРУКТУРЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ И ФОСФОЛИПИДОВ ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ

Существование у высших животных сильной перестройки 2-моноглицеридной структуры пищевых и транспортных жиров [938, 846], которая предшествует отложению последних в запас и отражает биосинтез триглицеридов в организме de novo по глицерофосфатному пути, можно показать на примере позиционно-S-видового состава запасных глицеридов крыс, четыре месяца получавших свиной жир (табл. 25) [800]. Эта перестройка выражается в отрицательной величине S_R после скармливания крысам синтетических ОПО и ООТО* (обозначения * и Т на стр. 220 и 119) [143]. Пока еще не известно, где именно меняется ПВС транспортных глицеридов на их пути к жировой ткани и какова здесь роль печени и липопротеиновой липазы плазмы [118, 262, 733]. У более низкоорганизованных животных — беспозвоночных и рыб — величина S_R составляла +50—80%, что указывает на образование их запасных жиров по моноглицеридному пути биосинтеза и на значительное сохранение 2-моноглицеридной структуры жиров морского планктона, в которых полиненасыщенные кислоты с m = 20—22 находятся в 2-положениях (стр. 202) [132].

Таблица 25 Позиционно-S-видовой состав глицеридов жировой ткани крыс, получавших в рационе свиной жир (в вес %)

Таким образом, несмотря на значительную роль жиров рациона в адекватном изменении строения глицеридов животного организма, в целом позиционный состав запасных триглицеридов определяется в первую очередь потребностями самого организма и спецификой его обмена веществ.

III. Биосинтез триглицеридов

Исследование ферментативного механизма, исходных и промежуточных продуктов, энергетики и внутриклеточной локализации биосинтеза триглицеридов имеет большое теоретическое и практическое значение. Поэтому биосинтез нейтральных липидов изучали во многих органах и тканях живых организмов — в печени, слизистой оболочке кишечника, молочной железе, жировой ткани животных, в семенах и иных запасающих органах масличных растений и т. д.

Еще в середине 30-х годов классическими исследованиями Шенхеймера и Риттенберга, в которых применялась дейтерированная вода, было установлено, что в жировой ткани мышей происходят непрерывный синтез и распад запасных триглицеридов, которые, следовательно, находятся в состоянии динамического равновесия [858]. На основе распространенных в то время концепций обратимости гидролитических и синтетических ферментативных реакций синтез триглицеридов пытались представить как их «обращенный» гидролиз, катализируемый одним и тем же ферментом — липазой. В дальнейшем подобные представления потеряли значение, но на смену им до 50-х годов не было предложено никаких новых гипотез образования глицеридов. Только в течение последних 15 лет современные методы хроматографии, радиоактивных изотопов, фракционирования клеточных органоидов и другие позволили начать интенсивные исследования триглицеридов и путей их биосинтеза.

Известно, что меченые предшественники продуктов обмена веществ облегчают изучение биосинтеза, поскольку новообразованные соединения легко отличаются от веществ, содержавшихся в организме до опыта. Однако для успешного проведения изотопных исследований in vivo необходимо поддерживать постоянный обмен веществ, знать заранее распределение предшественников между многими «резервуарами» метаболизма и соблюдать целый ряд других условий опыта. Поэтому предпочитают изучать биосинтез in vitro, где удельную активность окружающей среды <\br> легко поддерживать на определенном уровне и где исключен физиологическое действие регуляторных реакций живого организма. Изложенные принципы и методы позволили довольно быстро установить, что триглицериды, как и другие сложные природные соединения, следуют при своем образовании и распаде по различным путям обмена веществ. Если при ферментативном гидролизе глицерида образуются свободные жирные кислоты и глицерин, то для непосредственного ферментативного синтеза исходного соединения эти продукты сами по себе непригодны. Было показано, что и жирные кислоты, и глицерин перед вовлечением в биосинтетические реакции должны перейти в особое, активированное состояние. Реакции активирования, отдельные элементарные акты этерификации жирных кислот и сам процесс жирообразования в целом осуществляются за счет энергии, запасенной в аденозинтрифосфорной кислоте (АТФ). В животных тканях найдены многочисленные промежуточные продукты биосинтеза: наоборот, в семенах растений синтез и распад триглицеридов не сопровождаются образованием свободных жирных кислот, диглицеридов и других предполагаемых промежуточных веществ, присутствие которых можно было бы легко обнаружить современными методами [481, 484, 492].

В настоящее время вскрыта взаимосвязь биосинтеза триглицеридов и таких процессов, как синтез фосфолипидов [569], углеводный обмен [158] и окислительное фосфорилирование [122]. Показано, что синтез триглицеридов локализован в эндоплазматическом ретикулуме цитоплазмы и отличается жирнокислотной специфичностью. Обнаруженные недавно особенности биосинтеза триглицеридов в жировом теле москитов свидетельствуют о возможной связи жирообразования с генетическим аппаратом клетки. У этих насекомых при выращивании на среде, содержащей глюкозу, способностью к синтезу глицеридов обладают только самки, а самцы не образуют нейтральных липидов даже при обильном углеводном питании [346].

Вопросы, связанные с механизмом образования триглицеридов, ввиду их большой актуальности, обсуждались в ряде статей обзорного характера [20, 31, 36, 155, 344, 409, 449, 565, 566, 569, 710, 713, 828, 867, 977]. Однако и до настоящего времени в литературе отсутствуют работы, целиком посвященные этой важной проблеме. Поэтому здесь сделана попытка отразить современные представления о последовательных этапах отдельных путей биосинтеза триглицеридов в животных и растительных тканях. Изменения глицеридного обмена животных под действием гормонов, а также механизм синтеза насыщенных и ненасыщенных кислот в данной работе не рассматриваются.

ВКЛЮЧЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ГЛИЦЕРИНА В ЖИР ИНТАКТНОЙ ТКАНИ И ИХ АКТИВИРОВАНИЕ

Глава 17. ВКЛЮЧЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ГЛИЦЕРИНА В ТРИГЛИЦЕРИДЫ

ВКЛЮЧЕНИЕ МЕЧЕНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ТРИГЛИЦЕРИДЫ

Обнаружение динамического состояния запасных глицеридов в организме [858] побудило многих исследователей изучить включение меченых и немеченых жирных кислот и глицерина в триглицериды интактных органов и тканей. Работы, которые рассматриваются в данной главе, предшествовали исследованию механизма биосинтеза триглицеридов in vitro на уровне изолированных субклеточных частиц.

Еще в 1880 г. Мунк показал, что свободные алифатические кислоты в слизистой оболочке кишечника собаки превращаются в триглицериды, поступающие затем в лимфу [867]. При инкубации роговицы кролика с олеатом-1-С¹⁴ и глюкозой-С¹⁴ триглицериды синтезировались со скоростью 10 мкмолей/г сырого веса за 48 час., причем олеат включался только в ацильные части молекулы, а глюкоза-С¹⁴, как показано ниже, использовалась почти исключительно для синтеза остатка глицерина [906].

Наряду с радиоактивными изотопами для изучения биосинтеза триглицеридов иногда применяют жирные кислоты необычного состава, например пентадеканоат. После введения этого предшественника в виде свободной кислоты или моноглицерида в молочную железу козы он обнаруживался в большом количестве в составе моно-, ди- и триглицеридов молока [776]. В стенке кишечника крысы и хомяка С¹⁴-жирные кислоты (пальмитиновая и олеиновая) образуют главным образом триглицериды, но в небольшой степени включаются и в диглицериды; синтез радиоактивных моноглицеридов не наблюдается [69, 448, 933].

Условия инкубации ткани с мечеными предшественниками сильно влияют на скорость биосинтеза. Так, ингибиторы аэробного энергетического обмена — цианид, азид и 2,4-динитрофенол (ДНФ) — останавливают включение пальмитата- и стеарата-1-C¹⁴ в триглицериды жировой ткани крысы и жирового тела шелко- <\br> пряда [185, 810, 872, 960]. Эти результаты опровергают прежние утверждения о независимости биосинтеза триглицеридов от состава газовой среды [443]. Интересно, что поглощение ненасыщенной линолевой кислоты-1-C¹⁴ лейкоцитами кролика не нарушается этими дыхательными ядами, но в то же время сильно тормозится ингибиторами анаэробного гликолиза — фторидом и йодацетатом, которые в свою очередь почти не оказывают влияния на скорость превращения насыщенных кислот [262, 810, 872]. В скелетной мышце образование нейтрального жира из пальмитата-1-C¹⁴ усиливается вдвое после добавления глюкозы [31, 142].

При совместной инкубации жирные кислоты могут адсорбироваться на клеточных частицах. Так, митохондрии и микросомы при 0° в отсутствие АТФ избирательно поглощали пальмитат-1-C¹⁴ из его комплекса с сывороточным альбумином. В связывании меченой кислоты труднорастворимыми белками органоидов участвовали конституционные липиды. Возможно, что неметаболитическое поглощение жирных кислот предшествует их этерификации [822].

Ионы калия увеличивают, а ионы натрия снижают общую скорость жирообразования в стенках кишечника и в печени; однако затрагивается не сам синтез триглицеридов непосредственно, а лишь его подготовительные реакции, в которых возникают активированные предшественники этого синтеза [621, 810].

Скорость и направление включения жирной кислоты в триглицериды или другие липиды в значительной степени определяются длиной ее цепи и ненасыщенностью. Уксусная, пропионовая, масляная и стеариновая кислоты-1-C¹⁴ с разной интенсивностью образовывали триглицериды молока в молочной железе коровы [659]. Относительная радиоактивность глицеридов, полученных при всасывании альбуминовых комплексов жирных кислот-1-С¹⁴ срезами кишечника хомяка [293], показана ниже (активность для пальмитата принята за 100). Можно видеть, что скорость включения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот не определяется простыми физическими свойствами жирных кислот, такими, как растворимость или точка плавления, а регулируется ферментативным механизмом ацилирования [293].

Аналогичные результаты были получены при поглощении пальмитиновой, стеариновой, олеиновой и линолевой кислот эпидидимальной жировой тканью крысы [900]. <\br> Различные жирные кислоты включались в 1-, 2- или 3-положение триглицерида по-разному. Олеат-, пальмитат- или стеарат-1-С¹⁴ инкубировали с неразрушенными клетками слизистой оболочки кишечника ягненка или крысы, триглицериды-С¹⁴ выделяли препаративно и расщепляли их в 1,3-положениях липазным гидролизом (стр. 113). Продукты гидролиза выделяли и радиоактивность в 2-положении исходных триглицеридов (х) вычисляли по формуле: x = c — a — √(c — a)² + 4b (a + b + c) / 2 (a + + b + c), где а, b и с — соответственно активность (в имп/мин) СЖК, 2-моноглицеридов и 1,2(2,3)-диглицеридов, возникших при гидролизе. Иногда величину х определяли непосредственно по радиоактивности 2-моноглицеридов: х = 100 b' / 3d', где b' и d' — удельные активности (в имп/мин/мкмоль) 2-моноглицеридов и триглицеридов. Оба способа вычисления дали сходные результаты. Определение включения жирных кислот-1-C¹⁴ в 2-положение триглицеридов клеток слизистой оболочки кишечника ягненка и крысы in vitro в процентах С¹⁴ [348, 349] показало (см. ниже), что пальмитиновая кислота распределяется в глицеридах слизистой статистически, а стеариновая ацилирует главным образом крайние гидроксилы молекулы.

Этерификация олеиновой кислоты отличается видовой специфичностью: если у ягненка эта кислота связывается почти исключительно в 1,3-положениях, то в кишечнике крысы она включается преимущественно в 2-положение триглицеридов [288, 348, 349].

Меченые жирные кислоты обнаруживаются при инкубации не только в триглицеридах, но и в диглицеридах и в фосфолипидах. Преимущественный синтез триглицеридов по сравнению с фосфолипидами наблюдается в слизистой кишечника [215, 810], мышцах [753], лейкоцитах [262] и свежевыделенном молоке [668]. Напротив, в печени и выделенных из нее митохондриях и микросомах радиоактивный пальмитат обычно включается сильнее в фосфолипиды [301, 449]. Природа жирной кислоты также в значительной степени определяет направление синтеза. Ниже показано включение жирных кислот в триглицериды и фосфолипиды тканей крысы.

ВКЛЮЧЕНИЕ МЕЧЕНОГО ГЛИЦЕРИНА И ГЛЮКОЗЫ В ТРИГЛИЦЕРИДЫ

О биосинтезе триглицеридов в интактной ткани можно судить не только по включению в них жирных кислот, но и по включению глицерина. В печени и молочной железе, обладающих активной глицерокиназой (стр. 240), меченый глицерин легко переходил в глицериды [153, 664]. Однако после введения в кишечник глицерина-С¹⁴ или Н³ метка в хиломикронах лимфы почти не обнаруживалась [867]. Возник вопрос, может ли глицерин, освободившийся при гидролизе глицеролипидов в кишечнике, снова использоваться для ресинтеза триглицеридов в слизистой оболочке.

Для решения этого вопроса надосадочную жидкость гомогената слизистой кишечника свиньи инкубировали в системе кофакторов с пальмитатом и фруктозо-1,6-дифосфатом-С¹⁴; к смеси прибавляли эквимолярное количество немеченого глицерина и его производных. Оказалось, что добавка глицерина совершенно не влияла на включение С¹⁴ в спиртовой радикал триглицеридов; в то же время диоксиацетонфосфат и L-глицеро-3-фосфат в 1,5—2 раза снижали активность полученного жира [158]. В дальнейшем, однако, удалось продемонстрировать включение свободного глицерина рациона в глицериды лимфы, причем этот процесс стимулировался жирными кислотами и желчнокислыми солями [867]. В слизистой срезов кишечника крысы до 12% глицерина-1-C¹⁴ переходило без разрыва цепи в состав глицеридов [843]. По-видимому, для окончательного решения вопроса о наличии глицерокиназы в этой ткани необходимы дальнейшие исследования.

Включение активности глюкозы-С¹⁴ в триглицериды наблюдали в эпидидимальной жировой ткани, кишечнике и печени крысы [303, 572, 867], а также в молочной железе [289, 664], причем в последнем случае глюкоза-С¹⁴ более эффективно превращалась в спиртовой радикал глицеридов, чем глицерин-С¹⁴ [664]. Выше уже отмечалось стимулирующее действие глюкозы на синтез гли- <\br> церидов. Наоборот, под влиянием ингибиторов глюкозного обмена (фторида, цианида, иодацетата и 2-дезоксиглюкозы) этерификация жирных кислот в жировой ткани замедлялась, а скорость выделения свободных жирных кислот во внешнюю среду возрастала ([572], см. также стр. 228).

ДИНАМИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ В РАЗЛИЧНЫХ МЕТАБОЛИТИЧЕСКИХ РЕЗЕРВУАРАХ

Возвращаясь к вопросу о подвижном состоянии запасных глицеридов в организме, которое изучалось главным образом в опытах на целом организме или на интактных органах и тканях, следует отметить, что по современным представлениям это состояние поддерживается динамическим равновесием между образованием и гидролизом сложноэфирных связей. По длительности периода полуобновления триглицеридов разные органы и ткани и отдельные органоиды клетки сильно различаются между собой. Путем инкубации ткани крысы с пальмитиновой- и линолевой-1-С¹⁴ кислотами было показано, что в изолированных клеточных частицах жировой ткани и печени этот период не превышал 20—25 мин. [899], а в интактной эпидидимальной жировой ткани in vivo составлял 163—187 дней [900]. По более ранним данным многих исследователей, остатки алифатических кислот в запасных триглицеридах жировой ткани обновлялись наполовину за 9—80 дней в зависимости от режима питания, что свидетельствовало о ее сравнительной метаболической инертности [900].

Скорость обновления глицеридов в этой ткани можно измерить по включению и освобождению меченого глицерина. Использование глицерина или глюкозы в подобных опытах имеет определенные методические преимущества: образовавшийся в процессе гидролиза липидов глицерин не может, в отличие от жирных кислот, реутилизироваться жировой тканью in situ для биосинтеза триглицеридов из-за отсутствия в ней глицерокиназы (см., однако, стр. 240). Применяя глюкозу-С¹⁴ в качестве предшественника спиртового радикала жиров и определяя количество выделенного во внешнюю среду глицерина, установили, что средний период полуобновления триглицеридов в эпидидимальной ткани крысы (согласно уравнению скорости реакции первого порядка) составляет 41 день [303]. Найденная величина несколько ниже полученной в прежних работах [900], где не учитывали возможность вторичной этерификации кислот в жировой ткани.

Неодинаковая скорость обновления триглицеридов разного происхождения свидетельствует о том, что в ткани имеется несколько связанных между собой резервуаров («пулов») жирнокислотного и глицеридного обмена, которые не находятся в равновесии между собой. Такой градиент может долго поддерживаться лишь при том условии, что синтез триглицеридов сосредоточен в небольшом метаболическом резервуаре, содержащем только вы- <\br> сокорадиоактивную фракцию жирных кислот ткани. Поскольку удельная активность этого пула остается неизвестной, истинную скорость биосинтеза глицеридов определить невозможно [960].

Фракционированием гомогената жировой ткани установили, что триглицериды («свободный жир») составляют 85% ее свежего веса [960]. После включения пальмитата-1-C¹⁴ удельная радиоактивность алифатических кислот и глицеридов в клеточных частицах была намного выше, чем в свободном жире; выравнивание активности внутри клеток достигалось только трех- четырехчасовой инкубацией печени или жировой ткани в отсутствие изотопа [899, 960].

Таким образом, в запасающих тканях имеются по меньшей мере два метаболитических резервуара, различающихся по скорости кругооборота триглицеридов, — клеточные частицы и эндоплазматический ретикулум цитоплазменного слоя, с одной стороны, и крупные капли «свободного жира» — с другой [900].

Представление о нескольких пулах обмена липидов в организме подтвердилось при изучении образования триглицеридов в печени и сыворотке крови крысы. Когда меченый пальмитат вводили внутривенно, то радиоактивность триглицеридов в печени достигала максимума через 5 мин., а в сыворотке — лишь через 30 мин. после инъекции; при этом появлению С¹⁴-глицеридов в крови предшествовал 10-минутный лаг-период. Следовательно, источником триглицеридов сыворотки служит один из метаболитических пулов печени, отличающийся большой скоростью обновления. Схема взаимоотношений глицеридов крови и печени показана ниже [79].

Резервуары: А — быстро метящиеся триглицериды клеточных частиц печени; Б — триглицериды сыворотки крови; В — медленно метящиеся триглицериды жировых «депо» печени; а — поступление триглицеридов из сыворотки в печень; б — поступление свободных жирных кислот из сыворотки для синтеза триглицеридов в печени; в — поступление триглицеридов из липидов печени; г — поступление триглицеридов, образованных в резервуаре А, в резервуар В; д — выделение триглицеридов и продуктов их гидролиза и переэтерификации из резервуаров А и В; е — поступление триглицеридов из печени в сыворотку (лаг-период 10 мин.); ж — превращение триглицеридов сыворотки в другие липиды; з — незначительное поступление триглицеридов в резервуар Б при отсутствии жиров в рационе.

Аналогичная модель, отражающая обмен (глицерин-С¹⁴)-триглицеридов, была предложена при исследовании печени и сыворотки человека [271]. <\br> Единый резервуар жирных кислот, обеспечивающий биосинтез липидов нескольких классов, обнаружен до настоящего времени только в одном биологическом объекте. Имеется в виду молочная железа козы, где соотношение стеарата и олеата у всех изученных липидов составляет 1/2 — 1/3. Интересно, что сразу после инъекции пальмитата-1-С¹⁴ в железу наибольшей радиоактивностью обладали эфиры холестерина. Поскольку кислотные остатки этих эфиров включались в триглицериды и фосфолипиды быстрее, чем свободные алифатические кислоты, предположили, что именно эфиры холестерина служат предшественниками и переносчиками жирных кислот при биосинтезе глицеролипидов молочного жира [774].

При голодании крыс, получавших пальмитат-С¹⁴, содержание глицеридов в жировой ткани снижается, а удельная радиоактивность этих соединений не меняется. Отсюда ясно, что новообразованные триглицериды не откладываются концентрическими слоями на периферии этой ткани, как думали прежде, а равномерно перемешиваются с предсуществующим свободным жиром [894]. В то же время разные жирные кислоты включались в глицериды той или иной степени ненасыщенности с различной скоростью. После инкубации пальмитиновой кислоты-1-С¹⁴ с эпидидимальной тканью крысы удельная активность пальмитата в насыщенных триглицеридах была в четыре раза выше, чем в ненасыщенной фракции. В опытах in vivo такое соотношение С¹⁴ сохранялось в течение двух недель. Можно сделать вывод о том, что близкое к статистическому распределение остатков жирных кислот в триглицеридах некоторых природных жиров, по-видимому, не обусловлено быстрой интенсивной переэтерификацией вновь синтезированных глицеридов [388].

В начале раздела уже отмечалось, что инкубация смеси триглицеридов и С¹⁴-жирных кислот in vitro с липазой поджелудочной железы не увеличивает общего содержания сложноэфирных связей. Однако благодаря ацилтрансферазным обменным реакциям, которые тоже катализируются липазой (стр. 113), меченые жирные кислоты включаются в небольшой степени в крайние положения триглицеридов, что приводит к частичному обновлению жирнокислотного состава последних [60, 61, 115, 873].

В настоящее время можно представить следующую примерную схему образования триглицеридов интактных запасающих тканей. Свободные жирные кислоты неферментативно адсорбируются клеточными структурами, а затем переходят в активированное состояние при участии АТФ. Путем этерификации активные производные образуют глицериды и фосфолипиды. Свободный глицерин включается в сложные эфиры лишь в присутствии глицерокиназы.

По мере образования триглицериды мигрируют с поверхности клеточных частиц и поглощаются каплями «свободного жира», более инертными в метаболическом отношении. Частицы и «сво- <\br> бодный жир» представляют собой отдельные резервуары, или пулы глицеридного обмена, и отличаются друг от друга по длительности периода полуобновления триглицеридов. В «свободном жире» новообразованные триглицериды быстро перемешиваются; однако во включении различных жирных кислот в триглицеридные фракции разной насыщенности имеется известная специфичность.

Глава 18. АКТИВИРОВАНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

СУБКЛЕТОЧНАЯ СИСТЕМА АКТИВИРОВАНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

После того как было обнаружено включение жирных кислот в триглицериды ряда органов и тканей, механизм отдельных этапов этого процесса стали изучать на субклеточном уровне. Оказалось, что для биосинтеза глицеридов в гомогенатах и клеточных частицах необходимы кофакторы — АТФ, кофермент ацетилирования (КоА) и ионы Mg²⁺ [587, 868]. Отсюда следует, что жирные кислоты, по-видимому, участвуют в биосинтетических процессах в виде ацил-КоА-производных. Таким образом, образование этих производных можно считать первым этапом построения триглицеридов.

Ферменты активирования жирных кислот получили название тиокиназ, ацил-КоА-синтетаз, или, по новой классификации, жирная кислота : КоА-лигаз (АМФ), КФ 6.2.1.2 или КФ. 6.2.1.3 [96].

Образование ацил-КоА-производных из жирных кислот и КоА было обнаружено в субклеточных системах печени морской свинки [587], слизистой кишечника крысы и свиньи [53, 56, 868, 869] и жировой ткани крысы [827]. Для выделения ацил-КоА-синтетазы ткани гомогенизировали в 0,25 М растворе сахарозы, 0,2 М растворе фосфатного буфера, рН 7,4, или растворе 0,28 М маннита-0,01 М фосфатного буфера, рН 7,5 [53, 56, 587, 827, 868]. Центрифугированием гомогената получали фракции ядер и «свободного жира» (450—500g, 10 мин.), митохондрий (2500—4500g, 20 мин.) и микросом (7800—110000g, 30—60 мин.). Многократным замораживанием и оттаиванием суспензии клеточных частиц печени часть фермента можно было перевести в растворимую форму, причем активность фермента составляла 25% от исходной. Иногда микросомы отделяли в подкисленной среде, рН 5,8. Лиофилизированные препараты каждой фракции сохраняли на холоду [53, 58, 587, 827, 863].

Чистоту препарата митохондрий определяли по активности в нем щелочной β-глицерофосфатазы, которая обычно свойственна микросомам, а загрязнение микросом митохондриями — по активности цитохромоксидазы в препарате микросом. Микросомы отличались также от других фракций высоким содержанием РНК <\br> Таблица 26 Биосинтез пальмитил-КоА в субклеточных фракциях слизистой тонкого кишечника крысы [868]

и активностью НАД-Н-цитохром с-редуктазы ([53, 868, 869] (стр. 261).

В табл. 26 показано распределение активности ацил-КоА-синтетазы в субклеточных фракциях слизистой тонкого кишечника крысы [868]. Полученные данные и результаты других работ [409, 587, 827, 867, 869] однозначно свидетельствуют о том, что образование ацил-КоА-производных связано с микросомами, представляющими собой продукты разрыва мембран ретикулума (стр. 248). В других фракциях активность фермента тесно коррелирует с активностью щелочной фосфатазы [53, 868]. Таким образом, современные представления о внутриклеточной локализации ацил-КоА-синтетазы отличаются от старой концепции [587], согласно которой в митохондриях, микросомах и надосадочной жидкости гомогената печени активирование жирных кислот осуществляется с одинаковой скоростью ([867, 868], см. также стр. 247).

Активность ацил-КоА-синтетазы определяли в присутствии кофакторов (примерный состав среды показан ниже) [53, 56, 587, 827, 868], и выражали количеством моногидроксамовых производных жирных кислот (моноацилпроизводных гидроксиламина).

Если превращение сложных эфиров высших алифатических кислот в гидроксамовые кислоты требует высокой температуры и присутствия концентрированной щелочи, то гидраксиламино- <\br> лиз ацил-КоА-производных, представляющих собой тиоэфиры КоА с макроэргической связью, легко осуществляется при обычных условиях инкубации фермента — рН 7,4—8,3 и 37°: RCH₂CO ~ SKoA + NH₂OH → RCH₂CONHOH + HSKoA. После 30—60 мин. инкубации при 37—40° ферментативную реакцию останавливали прибавлением к смеси хлорной кислоты, гидроксаматы высших жирных кислот извлекали этанолом и колориметрировали в виде комплексов с ионами Fe³⁺ при 520 нм; молярная экстинкция составляла 1,28×10³ [56, 868]. Образование ацил-КоА-производных при активировании жирных кислот было подтверждено непосредственным выделением и идентификацией самих производных и полученных из них ацил-гидроксаматов соответствующих кислот [56, 587, 868].

МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ АКТИВИРОВАНИЯ И СВОЙСТВА АЦИЛ-КоА-СИНТЕТАЗ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ

Потребность системы в АТФ, КоА и Mg²⁺ позволяет заключить, что по механизму реакция активирования высших алифатических жирных кислот сходна с исследованной ранее [713] реакцией активирования ацетата. Реакция обратима и идет с участием ионов Mg²⁺, связывающих фосфатные группы ацил-аденилатного комплекса [867].

CH₃(CH₂)₁₄C—OH + HSKoA + аденозил—O—P—O—P—O—P—O⁻ → (фермент-Мg²⁺-АМФ-ацил)-комплекс + HS KOA ↔ CH₃(CH₂)₁₄C—S—KoA + аденозилмонофосфат (АМФ) + ⁻О—Р—О—Р—О⁻

В течение первых 30 мин. инкубации наблюдается линейный рост концентрации ацил-КоА в системе, а затем синтез приостанавливается из-за термолабильности фермента in vitro при 37° [53, 56]. В печени на 1 моль АТФ образуется 1 моль пальмитилгидроксамата; в присутствии избытка АТФ и фермента пальмитат полностью превращается в пальмитил-КоА. Таким образом, реакция ацил-КоА-синтетазы является здесь стехиометрической [587]. В слизистой кишечника такой стехиометричности не наблюдалось даже при повышенных концентрациях фторида, тормозящего эндогенную АТФ-азу, а добавленный пальмитат переходил в ацил-КоА только на 25% [56]. <\br> Образование ацил-КоА-производных обнаруживает линейную зависимость от содержания АТФ и КоА. Как показывают данные (стр. 236), АТФ необходим для синтеза ацил-КоА в субстратных, а КоА — в каталитических количествах. Однако исключение из среды любого из этих кофакторов в одинаковой степени снижает скорость реакции. Увеличение концентрации белка микросом до 3 мг также усиливает активирование жирных кислот; дальнейший рост содержания фермента приводит к торможению [53, 56]. У крысы оптимум рН фермента кишечника составлял 6,8—7,8 [868], а у свиньи — 8,3 [56]. Активность тормозилась трипсином [587] и таурохолеатом [868], а также исключением из среды цистеина и глутатиона-SH [55]. Добавление ДНФ к митохондриям печени крысы из-за активирования АТФ-азы снимало образование ацил-КоА, зависимое от АТФ. После прибавления ингибитора индуцированной АТФ-азы — олигомицина — синтез ацил-КоА восстанавливался [96].

Ацил-КоА-синтетаза исследованных тканей специфична для насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с m ≥ 8 [56, 449, 587, 867]. Такая специфичность хорошо согласуется с тем, что глицериды, которые запасаются или секретируются этими тканями, содержат только высшие жирные кислоты [56, 449]. Максимальная активность в печени морской свинки и в слизистой кишечника свиньи проявлялась по отношению к лауриновой, а в жировой ткани и слизистой крыс — к пальмитиновой кислотам [56, 587, 827, 868]. Ненасыщенные кислоты также образовывали ацил-КоА-производные, причем в кишечнике свиньи пальмитат и олеат активировались с одинаковой скоростью. В то же время высокие концентрации свободного линолеата и линолената несколько тормозили ацил-КоА-синтетазу [56, 587, 827, 868]. Следовательно, активирование разнообразных жирных кислот происходит с различной скоростью.

В слизистой кишечника свиньи кроме ацил-КоА-синтетазы, описанной выше, была обнаружена другая ферментная система, которая медленно образовывала олеил- и пальмитил-гидроксаматы в нейтральной среде при полном отсутствии кофакторов. Эта активность, связанная с переносом остатков жирных кислот ферментами типа эстераз, имела оптимум рН 7,0—7,5 и была более устойчива к температуре. Неизвестно, участвует ли независимая от кофакторов система переноса ацилов в биосинтезе глицеридов ([56], см. также стр. 234).

Таким образом, в печени, жировой ткани и слизистой кишечника имеются ацил-КоА-синтетазы, способные активировать именно те жирные кислоты, которые обычно встречаются в синтезируемых этими тканями триглицеридах. Ацил-КоА-производные с длинной цепью образуются за счет энергии АТФ и по активности в реакции этерификации превосходят исходные кислоты. Кроме того, благодаря содержанию многочисленных полярных групп в остатке КоА эти производные, в отличие от кислот, становятся во- <\br> дорастворимыми при нейтральном рН, что значительно облегчает их участие в реакциях ацилирования на дальнейших этапах биосинтеза триглицеридов. Ниже представлена структурная диаграмма пальмитил-КоА [867]. Показан значительный объем водорастворимого полярного остатка КоА по сравнению с неполярным углеводородным «хвостом» остатка жирной кислоты.

где: C ~ S — макроэргическая тиоэфирная связь.

Глава 19. АКТИВИРОВАНИЕ ГЛИЦЕРИНА

СУБКЛЕТОЧНАЯ СИСТЕМА АКТИВИРОВАНИЯ ГЛИЦЕРИНА

Описанные выше опыты с целыми тканями или их срезами показали, что глицерин включается в спиртовой радикал глицеролипидов только после предварительного активирования. Сначала считали, что единственным путем образования активированной формы глицерина и его аналогов служит анаэробный гликолиз. Затем было показано, что свободный глицерин может активироваться непосредственно под действием глицерокиназы. Это способствовало появлению многочисленных исследований, посвященных локализации, механизму действия и свойствам связанной с липогенезом ферментной системы активирования самого глицерина.

Глицерокиназа [153], или АТФ : глицерин-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.30, катализирует стереоспецифическое фосфорилирование глицерина с образованием L-глицеро-3-фосфата (ниже этот изомер обозначается «глицерофосфат») [331, 867]. Этот фермент <\br> довольно широко распространен у животных, растений и микроорганизмов; он обнаружен в печени крысы, голубя и курицы [44, 153, 897, 988], молочной железе морской свинки [664], почках крысы [988], проростках клещевины [1003], межплоднике авокадо [91], а также в адаптированных к глицерину клетках Oospora lactis и Candida mycoderma [155, 988].

До сих пор окончательно не установлено, содержится ли глицерокиназа в слизистой кишечника (стр. 231). Вначале глицерокиназа не была обнаружена [158, 988], возможно из-за наличия в слизистой фосфатазы [867]. В дальнейшем путем фракционирования растворимых белков гомогената сульфатом аммония удалось убедительно продемонстрировать глицерокиназную активность в слизистой кишечника кошки, крысы и хомяка [197, 331]. Играет ли эта глицерокиназа сколько-нибудь существенную роль в процессе всасывания жиров в кишечнике? Для ответа на этот вопрос необходимо будет определить, в какой мере глицерофосфат, образованный глицерокиназой, и глицерофосфат, возникший в гликолитических реакциях, участвуют в синтезе глицеридов из продуктов их гидролиза.

В аорте кролика и собаки [899] и в листьях шпината [184] глицерокиназа отсутствует. Большинство исследователей считают, что этот фермент не содержится и в жировой ткани [685, 988]. Однако при инкубации жировых клеток эпидидимальной ткани крысы в присутствии высоких концентраций глицерина-С¹⁴ было обнаружено включение С¹⁴ в спиртовой радикал триглицеридов [403а]. По-видимому, для окончательного решения этого вопроса нужны дальнейшие исследования.

Для препаративного получения фермента ткани гомогенизировали на холоду (табл. 27). Клеточные частицы осаждали часовым нагреванием гомогената [155], подкислением среды [567] или центрифугированием при 78—144 тыс. g [91, 331, 664]. Надоса-

Таблица 27 Условия получения гомогената ткани для препаративного выделения глицерокиназы

Таблица 28 Очистка глицерокиназы печени голубя [988]

Аналогичным путем из адаптированных клеток С. mycoderma получили фермент с высоким выходом (35%) и высокой активностью (165 000 ед/мг) [155]. Глицерокиназу проростков клещевины при помощи фракционирования сульфатом аммония удалось очистить в 86 раз [1003].

Определение удельной активности фермента основано на сочетании глицерокиназной реакции с действием L-глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы (фермента Барановского, КФ 1.1.1.8):

L-глицеро-3-фосфат + НАД⁺ ↔ диоксиацетон (ДОА)-фосфат + НАД·Н + Н⁺ ↓ комплекс с гидразином

Если проводить определение в щелочной среде, а образующийся ДОА-фосфат сразу же связывать гидразином, то реакция идет только в сторону восстановления НАД. Количество НАД·Н, эквивалентное концентрации глицерофосфата, измеряли спектрофо- <\br> тометрически. Реакционная смесь содержала MgCl₂-гидразин-глициновый буфер, рН 9,8, а также избыток глицерина, НАД·Н, АТФ и фермента Барановского. За единицу активности принимали количество фермента, увеличивающее оптическую плотность D при 340 нм в среде определенного состава при 25° со скоростью 0,001 ед/мин в течение первых 2 мин. инкубации [155, 331, 664].

В неочищенных ферментных препаратах молочной железы спектрофотометрическое определение глицерокиназы было невозможно из-за быстрого восстановления НАД в контрольном опыте. Для снижения D в контроле препарат очищали от глицерина; скорость реакции можно было определить радиохроматографически по включению глицерина-С¹⁴ в глицерофосфат [91, 331, 664].

Практически вся глицерокиназа межплодника авокадо, слизистой кишечника, молочной железы и других тканей была сосредоточена в надосадочной жидкости после отделения микросом (стр. 235) [91, 331, 664]. Так, в плодах авокадо включение добавленного глицерина-С¹⁴ в глицерофосфат составляло в надосадочной жидкости 14%, а в микросомах — не более 0,6% [91]. Аналогичная картина распределения наблюдалась и в гомогенате молочной железы морской свинки [664]:

Активирование глицерина изучали в системе, содержащей (в мкмолях/мл) АТФ — 6—15, глицерин — 1—30, MgCl₂ — 1—6, а также фермент и К-фосфатный буфер, рН 7,4, 25—50 (его можно заменить трис-буфером, рН 7,4—9,0; 30—170, или глициновым буфером, рН 9,4; 33). Иногда добавляли цистеин или меркаптопропанол 10—25, фторид Na или К 8—40 и фосфокреатин 3. Через 30—180 мин. при 37° реакцию останавливали добавлением 0,2 моля метафосфорной или хлорной кислоты и возникший глицерофосфат определяли, как описано выше [91, 153, 154, 331, 664].

Для хроматографической идентификации L-глицеро-3-фосфата как продукта глицерокиназной реакции депротеинизированную надосадочную жидкость реакционной смеси пропускали через катионит Дауэкс-50 (Н⁺), а затем через анионит Амберлит ІН-4В (ОН⁻). Глицерофосфат, поглощенный анионитом, элюировали 1М раствором NН₄ОН и идентифицировали хроматографией на бумаге в трех системах растворителей: этанол — 1M NaOH (3 : 1), этанол или этилацетат — уксусная кислота — вода (3 : 3 : 1), метилэтилкетон — метилцеллозольв — АНОН — вода (7 : 2 : 0,7 : 2, 3). Если субстратом реакции был глицерин-С¹⁴, то единственным радиоактивным фосфорным эфиром на хроматограмме был L-глицеро-3-фосфат [91, 331, 664].

МЕХАНИЗМ ГЛИЦЕРОКИНАЗНОЙ РЕАКЦИИ И СВОЙСТВА ГЛИЦЕРОКИНАЗ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ

Глицерокиназа катализирует реакцию фосфорилирования [153, 567, 988, 1003]: глицерин + АТФ ↔ L-глицеро-3-фосфат + аденозиндифосфат (АДФ). Возникающий глицеро-3-фосфат принадлежит к L-ряду — следовательно, фосфорилирование является стереоспецифическим [154, 567, 1003] и тем самым определяет окончательную пространственную конфигурацию липидов (стр. 122) — производных L-глицеро-3-фосфата [713]. Таким образом, глицерин фосфорилируется асимметрически (в противном случае фермент не различал бы 1-ОН- и 3-ОН-группы глицерина и наблюдалось бы образование смеси D- и L-форм глицерофосфата). Для проверки этого утверждения глицерин-1-C¹⁴, полученный биосинтетически, действием глицерокиназы печени превращали в его фосфат, который расщепляли затем на отдельные С-атомы периодатным окислением. Поскольку на С-1 глицеро-3-фосфата приходилось 83% всей активности молекулы, был сделан вывод, что глицерокиназа стереоспецифически фосфорилирует глицерин по С-3. Глицерокиназную реакцию можно считать первым шагом асимметрического обмена глицерина в ткани [154].

Между исчезновением кислотолабильного фосфата и образованием глицерофосфата в реакционной смеси наблюдалось стехиометрическое соотношение, соответствующее уравнению реакции [153, 1003]. Количество глицерофосфата в среде находилось в линейной зависимости от концентрации глицерина, фермента и времени инкубации [331, 664, 988]. Для фермента дрожжей при 37° число кругооборотов составило 10⁵ молей фосфорилированного глицерина в мин. на 251000 г белка [155]. Скорость биосинтеза глицерофосфата у животных достигала 16—18 молей/час г, что вполне обеспечивало потребность организма в субстрате для синтеза спиртового радикала глицеридов [664, 988]. Константы Михаэлиса (Км) ферментов различного происхождения (табл. 29) были достаточно близки между собой.

Таблица 29 Величина констант Михаэлиса глицерокиназ различного происхождения

Молекулярный вес фермента дрожжей составляет 251 тыс., изоэлектрическая точка (ИЭТ)=4,6. Фермент печени, судя по его нерастворимости в воде, представляет собой глобулин. Он наиболее стабилен в кислой среде (рН 4,5—6,7), содержащей глицерин и ЭДТА. По устойчивости к изменениям температуры глицерокиназа превосходит другие киназы. При определенных условиях она выдерживает нагревание до 70—80°, замораживание и оттаивание, глубокое охлаждение и лиофилизацию. Частичная инактивация фермента на холоду снимается цистеином или глютатионом. Кристаллы дрожжевой глицерокиназы устойчивы в виде суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония [153, 197, 988].

Глицерокиназа действует лишь в присутствии АТФ и Mg²⁺, который можно заменить ионами Mn²⁺ [153, 155]. Для максимальной активности необходим цистеин, который можно заменить меркаптоэтанолом, тиогликолевой кислотой, сульфидом Na и т. д. Ингибиторы SH-групп — иодацетамид и n-хлорртутьбензосульфонат — тормозят ферментативную активность [153, 155, 664]. Оптимум рН фермента печени и слизистой кишечника составляет соответственно 9,8 и 9,4, а глицерокиназы проростков клещевины — 8,5 [155, 331, 1003]. Один и тот же фермент катализирует фосфорилирование глицерина, ДОА и глицеринового альдегида [153, 988, 1003].

Таким образом, несмотря на определенные различия в действии глицерокиназы в зависимости от источника выделения, ферменты животных, растений и микроорганизмов (возможно, изозимы глицерокиназы) в общем довольно сходны по оптимуму рН, термостойкости, Км, потребности в кофакторах, внутриклеточной локализации, устойчивости в кислой среде и т. д. [331, 664, 988]. Возможно, что это сходство отражает одинаковую физиологическую роль глицерокиназы, которая заключается в активировании глицерина, используемого затем для биосинтеза глицеролипидов. В исследованных тканях глицерокиназная реакция покрывает потребность липогенеза в глицерофосфате. Так, в молочной железе глицерин-С¹⁴ включается в глицерофосфат в 10 раз быстрее, чем в глицериды [664].

ОБРАЗОВАНИЕ ГЛИЦЕРОФОСФАТА ИЗ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ГЛИКОЛИЗА

В жировой ткани для построения спиртового радикала глицеридов служит L-глицеро-3-фосфат, образующийся из продуктов гликолиза при стереоспецифическом восстановлении ДОА-фосфата под действием фермента Барановского [567, 713]. В гомогена- <\br> те эпидидимальной ткани (ткани придатков семенников) фруктозо-1,6-дифосфат, глюкозо-6-фосфат, 3-фосфоглицериновый альдегид и ДОА-фосфат могли в присутствии НАД·Н превращаться в глицерофосфат. В случае глюкозо-6-фосфата кроме НАД·Н требовался АТФ или глицериновый альдегид, который в результате трансальдолазной реакции переходил в 3-фосфоглицериновый альдегид:

глюкозо-6-фосфат ↔ фруктозо-6-фосфат + D-глицериновый альдегид ↔ 3-фосфоглицериновый альдегид + D-фруктоза.

Образование глицерофосфата из промежуточных продуктов гликолиза было сосредоточено в надосадочной жидкости гомогената, полученной осаждением микросом [685].

В настоящее время еще трудно судить, какой путь образования глицерофосфата — глицерокиназный или гликолитический — имеет большее значение для синтеза глицеридов in vivo. Тем не менее очевидно, что обмен глицерина как одно из связующих звеньев между углеводным и жировым обменом ткани играет значительную роль в липогенезе, обеспечивая для него субстрат и определяя направление и специфику последующих этапов этого процесса.

БИОСИНТЕЗ ГЛИЦЕРИДОВ В СУБКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ НА ОСНОВЕ ГЛИЦЕРОФОСФАТА И ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ЭТОГО ПРОЦЕССА

Глава 20. БИОСИНТЕЗ ГЛИЦЕРИДОВ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ ГЛИЦЕРОФОСФАТА

РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГФ-ТРАНСАЦИЛАЗЫ

Первая попытка изучения синтеза липидов в субклеточной системе относится к 1883 г. Инкубация глицерина и калиевых солей высших жирных кислот с экстрактом слизистой кишечника собаки привела к образованию сложноэфирных связей [270]. Сейчас, когда исследовано включение меченых кислот и глицерина в глицериды неразрушенных тканей (стр. 234), можно считать, что процесс in vivo представляет собой ферментативную этерификацию.

По современным данным, для биосинтеза глицеридов в гомогенате и его фракциях необходимо сочетание многих кофакторов — КоА, АТФ, Mg²⁺, глицерофосфата, глутатиона и других, образующих систему трансацилирования между алифатическими тиоэфирами <\br> КоА и теми или иными акцепторами ацилов. Помимо включения меченых предшественников в нейтральные липиды в бесклеточном ферментном препарате удается обнаружить и довольно значительный прирост общего содержания глицеролипидов.

Превращение глицерофосфата и активированных жирных кислот в глицериды осуществляется ацил-КоА : L-глицеро-3-фосфат-ацилтрансферазой (ГФ-трансацилазой), КФ 2.3.1.15 [123], содержащейся в бесклеточных препаратах диафрагмы [751], аорты [901], слизистой кишечника [404, 408, 409], печени [36, 123, 896—898, 902, 934, 945—947], почек [36, 405], эпидидимальной жировой ткани [31, 827, 903, 904], молочной железы [247, 665, 804], межплодника авокадо [91] и листьев шпината [184].

Активность ГФ-трансацилазы определяли различными путями. Один метод — измерение уровня глицеридов в смеси гидроксамовым методом (стр. 237). Другой, спектрофотометрический метод основан на количественном определении свободного КоА при ацилировании в простой системе, содержащей (в мкмолях) пальмитил-КоА—0,05, глицерофосфат — 5, глутатион — 1 и глицилглициновый буфер, рН 7,5—5, в общем объеме 0,1 мл. Через 15 мин. белок и пальмитил-КоА осаждали 3%-ной хлорной кислотой, а затем учитывали D кислотного экстракта при 260 нм. По чувствительности данная реакция была в 10 раз выше гидроксамовой. Благодаря нейтральной среде удалось подавить образование КоА за счет гидролитического деацилирования тиоэфиров [827, 892]. Если перед инкубацией добавить 4 мг сывороточного альбумина, который связывает возникающие при гидролизе ацил-КоА свободные кислоты (стр. 252), то для работы можно использовать кислую среду, рН 6,5, и трансацилазная реакция значительно активируется. Образование КоА и включение глицерофосфата-С¹⁴ в липиды в микросомах печени морской свинки (в мкмолях) [123] равно соответственно для реакции с альбумином 74 и 59, а в опыте без альбумина — 3 и 5. Этот метод особенно применим для определения фермента в органоидах с сильным гидролитическим действием, например в митохондриях [123].

Для радиохроматографической оценки активности фермента глицериды экстрагировали из реакционной смеси этанолом с эфиром (3 : 1) [902, 934], ацетоном, эфиром и петролейным эфиром [196], а также смесями хлороформа с метанолом 2 : 1 [751], изопропанола, изооктана и серной кислоты (40 : 10 : 1) [904] или гептана, изопропанола, воды и н. NaOH (40 : 40 : 30 : 1) [665]. Эфирную фазу очищали водной щелочью от свободных жирных кислот и частично — от моноглицеридов и фосфолипидов [665, 904]. Глицериды выделяли препаративной адсорбционной хроматографией на колонке [91, 196, 904], на бумаге, пропитанной адсорбентом [904], или в тонком слое [665]. Радиоактивность определяли на сцинтилляционном спектрометре, а молярную концентрацию — гидроксамовым методом. Затем вычисляли удельную радиоактивность [91, 194, 196, 407, 665, 904]. Процент включения меченого <\br> предшественника в глицериды (І) рассчитывали по формуле I = 100A/MА', где А — удельная активность глицеридов, М и А' — количество и удельная активность предшественника [804] (см. также стр. 265).

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГФ-ТРАНСАЦИЛАЗЫ И ФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА БИОСИНТЕЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Действие ГФ-трансацилазы было прежде всего изучено в гомогенатах ряда тканей (стр. 246). Гомогенат получали обычными способами (стр. 241 и табл. 27). «Свободный жир», ядра и обломки клеток отделяли кратковременным центрифугированием при 500—1000 g. При дальнейшем фракционировании было установлено, что активность фермента связана со структурными элементами клетки [247, 405, 664, 901, 934]. Так, в митохондриальных препаратах печени даже после экстрагирования многократным замораживанием и оттаиванием почти 70% белка вся оставшаяся ГФ-трансацилазная активность сохранялась в нерастворившихся субъединицах клеточных структур [36, 863]. После разделения клеточных частиц определяли однородность полученных фракций митохондрий и микросом [409, 751]. Иногда для максимальной активности ГФ-трансацилазы помимо клеточных частиц требовалось небольшое количество надосадочной жидкости гомогената, служившей источником глицерокиназы или просто структурного белка [247, 934] (см. также стр. 252).

Изучению внутриклеточной локализации ГФ-трансацилазной активности были посвящены многолетние работы лаборатории Шапиро с печенью крысы и лаборатории Хюбшера со слизистой оболочкой кишечника и другими тканями. Ранние исследования по фракционированию гомогената печени привели авторов к выводу, что биосинтез глицеридов осуществляется в митохондриях, полученных центрифугированием при 11 000 об/мин (система 1). Образование глицеридов в этом препарате требовало кроме АТФ и Mg²⁺ добавления 0,2 части нативной надосадочной жидкости (микросом) и 3 частей кипяченой надосадочной жидкости, которую можно было заменить КоА и небольшим количеством глицерофосфата [896, 902, 934, 945]. Однако позже было показано, что ГФ-трансацилазную активность, нуждающуюся для включения жирных кислот в глицериды в АТФ, КоА, Mg²⁺ и 5—10-кратном по сравнению с системой 1 количестве глицерофосфата, можно выделить из нативной надосадочной жидкости при 40 000 об/мин или подкислением уксусной кислотой до рН 5,8 (система 2) [896]. Среди продуктов биосинтеза в системе 1 преобладали триглицериды, а в системе 2 — ди- и моноглицериды [902]. После отделения микросом (система 2) гомогенат уже не содержал ГФ-трансацилазу [405, 897, 947]. На основе полученных данных возникло представление о двух независимых системах синтеза глицеридов в печени — митохондриальной и микросомной, которые различаются <\br> по механизму действия [896, 902]. Однако в последней работе этой лаборатории уже не упоминается система 1, а о микросомах говорится как о единственном средоточии образования глицеридов в гомогенате [946].

Сначала считали, что и в слизистой кишечника синтез глицеридов происходит в митохондриях [36, 194, 196], но в дальнейшем выяснилось, что ГФ-трансацилазная активность этой ткани на 70—80% локализована в микросомах [408]. Опыты с молочной железой крысы дали аналогичный результат [247]. В своем обзоре Хюбшер подробно обсуждает вопрос о месте образования глицеридов в гомогенате слизистой и приходит к выводу, что этот процесс протекает главным образом в микросомах. Оптимальный биосинтез требует прибавления термолабильного недиализуемого фактора белковой природы, осаждаемого сульфатом аммония из бесструктурной надосадочной жидкости, т. е. глицерокиназы [409]. Ниже показано влияние центрифугирования в градиенте плотности (ЦГП) на глицерофосфатный путь синтеза нейтральных липидов во фракции митохондрий листьев шпината [184].

Можно видеть, что в результате длительных исследований двух лабораторий прежние представления об исключительном значении митохондрий в биосинтезе триглицеридов были пересмотрены. По-видимому, в ранних работах обнаружение ГФ-трансацилазной активности во фракции митохондрий было связано с загрязнением этой фракции микросомами [751]. Митохондриальные препараты растительных тканей удалось очистить от такой примеси центрифугированием в градиенте плотности (ЦГП) (см. выше). Сходные результаты были получены в опытах с межплодником авокадо [91]. Таким образом, ГФ-трансацилазная активность тканевого гомогената связана с микросомами ¹, в которых и обнаруживаются образованные ферментом глицериды [408, 665, 751, 946]. Возникает вопрос, какой морфологической структуре живой клетки соответствуют микросомы. В настоящее время микросомы считают обломками липопротеиновых мембран эндоплазматического ретикулума клетки, на поверхности которых укрепле-

¹ Недавно было показано, что одна из реакций глицерофосфатного пути биосинтеза триглицеридов — ацилирование лизофосфатидных кислот с образованием фосфатидных кислот (стр. 256) — осуществляется как в микросомах, так и во фракции внешних мембран митохондрий, выделенных после разрушения этих органоидов [842а]. <\br> ны рибосомы (стр. 236 и 265). В то же время нельзя исключить возможности образования части микросом из гладких мембран аппарата Гольджи [91, 409].

Ниже представлены в обобщенном виде условия инкубации и примерный состав бесклеточной ферментной системы биосинтеза глицеридов.

Как и в случае ацил-КоА-синтетазы, источник энергии (АТФ) был необходим для реакции в субстратных, а кофактор активирования жирных кислот (КоА) — в каталитических количествах [196, 751]. Глутатион-SH можно было заменить цистеином или этилмеркаптаном, фторид — ингибитор АТФ-азы — ионами Ni²⁺, жирную кислоту — КоА- ацил-КоА-производными, а фосфатный буфер — трис-буфером, рН 7,4—8 [31, 184, 196, 665, 751, 904].

Для разделения, идентификации и количественного определения липидных продуктов ферментативной реакции применяли хроматографические методы (стр. 246). ГФ-Трансацилаза синтезирует не только глицериды, но и фосфолипиды (главным образом фосфатидные кислоты, стр. 253), причем относительное содержание этих классов липидов в реакционной смеси изменяется в широких пределах в зависимости от происхождения фермента, длительности инкубации и т. д. [31, 184, 901, 903, 904, 946, 977]. Большая часть нейтральных липидов, возникших в ферментной системе, представляет собой смесь три- и диглицеридов [194]. Преобладают количественно обычно триглицериды, но иногда наблюдается и обратное соотношение [196, 407], связанное с источником фермента ([247]; а также стр. 247), со сравнительной скоростью отдельных этапов ГФ-трансацилирования и с активностью липазы в ферментных препаратах [196, 407]. В опытах с жирными кислотами-С¹⁴ удельная радиоактивность углерода в диглицеридах обычно в десятки раз выше, чем в триглицеридах-С¹⁴, сильно разбавляемых эндогенными, не содержащими С¹⁴ триглицеридами гомогената [31, 751, 904]. Иногда среди продуктов биосинтеза in vitro встречаются моноглицериды, несущие подчас значительную долю <\br> Рис. 37. Адсорбционная хроматограмма нейтральных липидов, синтезированных из пальмитата-1-C¹⁴ гомогенатом жировой ткани крысы [903] По горизонтали — номера фракций и градиент концентрации подвижной фазы (1—100%-ный раствор эфира в петролейном эфире). По вертикали — концентрация липидов в элюате колонки (в мк-экв гидроксамата на 1 мл, II) и радиоактивность элюата (в имп/мин-мл, I, III, IV). I — эфиры холестерина; II — триглицериды; III — диглицериды; IV — моноглицериды

радиоуглерода суммы глицеридов [184, 901]. В качестве примера на рис. 37 представлена хроматограмма нейтральных липидов, образовавшихся при инкубации гомогената жировой ткани с пальмитатом-С¹⁴ и с системой кофакторов [903].

СВОЙСТВА И КИНЕТИКА ГФ-ТРАНСАЦИЛАЗЫ И СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ БЕЛКА НА ЕЕ АКТИВНОСТЬ

Направление и скорость ГФ-трансацилазной реакции определяются и жирнокислотной специфичностью фермента. Так, линолеат и олеат включались в глицериды клеточных частиц печени сильнее, чем пальмитат [898]. Последний, в свою очередь, интенсивнее, чем ацилы летучих кислот с m = 4—8, превращался в ди- и триглицериды молочной железы [804].

Исследование кинетики реакции показало, что в зависимости <\br> от происхождения фермента постоянная скорость включения глицерофосфата-С¹⁴ сохранялась в течение 10—60 мин.; лаг-период в системе включения не обнаружили. После 30—60 мин. инкубации биосинтез новых глицеридов обычно прекращался; его можно возобновить прибавлением свежего набора кофакторов ГФ-трансацилирования. В отсутствие ингибиторов АТФ-азы (фторида или ионов Ni) уже через 15 мин. реакция останавливалась перед энергетическим барьером [184, 196, 751, 904].

Включение жирных кислот и глицерофосфата в глицериды, особенно в анаэробных условиях, обнаруживает абсолютную потребность в АТФ, КоА и ионах Mg²⁺ и заметно стимулируется глутатионом-SH [91, 184, 902, 904, 934]. Другие нуклеозид-трифосфаты не заменяют АТФ [196, 247]. Необходимость ионов Mg²⁺ была показана в опытах с ферментными препаратами, которые были обработаны ЭДТА для связывания эндогенного магния. Ионы Mg²⁺ в реакции можно было заменить ионами Mn²⁺ [184]. Избыток Mg²⁺ (3 × 10⁻³ М) несколько ингибировал трансацилирование [91, 196, 407, 897]. Ферментные системы слизистой крысы и листьев шпината активировались ненасыщенными жирными кислотами с m = 14—18 (0,2—0,5 мкмоля) [184, 196].

ГФ-трансацилаза специфически тормозится даже низкими концентрациями (0,66 мг/мл) поверхностно-активного полиэфира Твин-20 [196, 407, 751]. Оптимум рН обычно сглажен и для ферментов различных тканей составляет 6,7—8,5 [184, 196, 407, 751].

Внесение глицерофосфата в субклеточные системы молочной железы и других органов усиливало биосинтез глицеридов в 12—88 раз [196, 247, 901]. Возможность замены этого эфира глицерином или фосфорилированными продуктами гликолиза зависела от присутствия глицерокиназы в ферментном препарате (стр. 240). Симметричный β-глицерофосфат не мог быть использован вместо L-глицеро-3-фосфата [196, 247, 664]. В структурных элементах жировой ткани и слизистой кишечника заметное образование глицеридов наблюдалось и без добавления глицерофосфата, за счет возникшего при гликолизе эндогенного глицерофосфата, содержание которого в эпидидимальной ткани крысы было равно 0,2 мкмоля/г [31, 196, 904]. Для печени крысы соответствующая величина составляла 1 мкмоль/г; падение концентрации глицерофосфата под действием голодания или по другой причине значительно снижало способность этой ткани к биосинтезу глицеридов [947]. Регуляторная роль глицерофосфата в липидном обмене печени по принципу обратной связи была снова показана при исследовании превращения цитрата-С¹⁴ в жирные кислоты в бесструктурной надосадочной жидкости. Ниже представлены данные о стимулирующем действии микросом и L-глицеро-3-фосфата (ГФ) на биосинтез жирных кислот в надосадочной жидкости гомогената печени крысы, определяемый по включению цитрата в жирные кислоты (в мкмолях/мг белка надосадочной жидкости за час) [401]: <\br> | Белок микросом, мг | —ГФ | +ГФ | | :--- | :--- | :--- | | 0,0 | 14,6 | 18,6 | | 0,6 | 17,4 | 91,0 | | 1,2 | 16,7 | 106,6 |

Продукты превращения цитрата — алифатические ацил-КоА-производные — сильно тормозят синтез самих жирных кислот. Если же в систему внести микросомы печени, способные к образованию глицеридов, а также акцептор ацилов — глицерофосфат, то в результате ГФ-трансацилазной реакции содержание ацил-КоА-производных падает, их ингибирующее действие снимается, а включение меченых предшественников в жирные кислоты возрастает в несколько раз. По-видимому, физиологический уровень глицерофосфата имеет жизненно важное значение для регуляции синтеза глицеролипидов в живой ткани [401].

При низких концентрациях ГФ-трансацилазы слизистой кишечника скорость включения пальмитата в глицериды пропорциональна количеству фермента. Оптимальное содержание последнего в обычной системе кофакторов (см. выше) составляет 3—5 мг белка на 3 мл [196, 407, 946]. Активность свежего фермента значительно понижается после его выдерживания при комнатной температуре, замораживания или обработки ацетоном [184, 751, 934]. Лиофилизированная ГФ-трансацилаза микросом выдерживает хранение при —10° С без инактивации [897].

Было отмечено несколько случаев стимуляции биосинтеза глицеридов in vitro сывороточным альбумином и другими белками [91, 247]. В опытах с микросомами печени обнаружено, что вторичное добавление свежего фермента в реакционную смесь после 30 мин. инкубации вызывает резкий подъем ГФ-трансацилазной активности [946]. Аналогичный эффект давали сывороточные альбумины и различные липопротеины, действие которых было аддитивным даже при оптимальной концентрации каждого компонента. Ниже показано активирование биосинтеза глицеридов микросомами печени in vitro альбумином и другими белками [140]. Состав реакционной смеси и единицы измерения те же, что и на стр. 249, содержание белка микросом 0,9 мг.

Предполагается, что положительное влияние альбумина на микросомную систему липогенеза основано на стабилизации ГФ-трансацилазы (стр. 246). Как и в гомогенате жировой ткани [904], избыток сывороточного белка тормозит активность фермента. <\br> В то же время липопротеин, по-видимому, играет в этой системе роль акцептора синтезированных глицеролипидов, которые сосредоточены в микросомах. Последние, освободившись от избытка липидов, восстанавливают способность к включению жирных кислот. С этой точки зрения первыми свободными продуктами биосинтеза глицеридов в живых тканях являются не сами липиды, а липопротеины [947].

Таким образом, при биосинтезе глицеридов в субклеточной ГФ-трансацилазной системе происходит перенос ацильных групп с КоА-производных жирных кислот на глицерофосфат. В продуктах этого биосинтеза обнаружено несколько соединений — три-, ди- и моноглицериды, фосфатидные кислоты и т. д. (стр. 249). Поэтому можно считать, что ГФ-трансацилазная реакция — это сложный, многоступенчатый процесс, а сама ГФ-трансацилаза представляет собой комплекс различных ферментов.

Глава 21. ФОСФАТИДНЫЕ КИСЛОТЫ КАК ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ БИОСИНТЕЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

БИОСИНТЕЗ ГЛИЦЕРИДОВ ИЗ ГЛИЦЕРОФОСФАТА ЧЕРЕЗ ФОСФАТИДНЫЕ КИСЛОТЫ

Гипотеза о том, что синтез глицеридов в слизистой оболочке кишечника осуществляется при участии фосфолипидов, была высказана еще в 1929 г. [879].

Позднее предположили, что такими промежуточными веществами могут быть представители безазотистых фосфолипидов — фосфатидные кислоты. Во-первых, именно фосфатидные кислоты (ІІІ) легче всего представить себе возможным продуктом ацилирования глицерофосфата (І). Кроме того, эти соединения часто находят в бесклеточных системах биосинтеза триглицеридов. И наконец, давно известно, что фосфатидные кислоты служат предшественниками фосфолипидов.

В живой ткани фосфатидных кислот обычно очень мало [406, 977]. Поэтому прежде они считались артефактом автолиза клеток, возникшим из фосфолипидов под действием фосфолипазы [184, 565, 587].

По современным данным, фосфатидные кислоты содержатся в нормальной живой клетке. Однако обнаруживаются они с трудом из-за их гидрофильности и чрезвычайно высокой скорости обмена, особенно дефосфорилирования [184, 565, 828, 886]. Поэтому первым прямым доводом в пользу их важной метаболической роли стало выделение меченых фосфатидных кислот из природных источников в условиях, исключающих гидролиз. <\br> Схема реакций биосинтеза диглицеридов из глицерофосфата и моноглицеридов с промежуточным образованием фосфатидных кислот

где: 1—3 — атомы углерода в цепи глицерина; I — L-глицеро-3-фосфат; II — L-α-лизофосфатидные кислоты; III — L-α-фосфатидные кислоты; IV — D-1,2-диглицериды; V — 1-моноглицериды; а — глицерофосфат-трансацилаза; б — лизофосфатидат-трансацилаза; в — диглицеридкиназа; г — моноглицеридкиназа; д — фосфатидат-фосфатаза; R, R' — ацилы жирных кислот

С этой целью дегидратированные метанолом ткани гомогенизировали в 5%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ) в присутствии нерадиоактивных фосфатидных кислот, добавленных в качестве носителя, и экстрагировали хлороформом или его смесью с метанолом [61, 406, 451, 452]. Фосфатидные кислоты осаждали <\br> метанолом, рН 8, или раствором хлорида Мg в ацетоне и очищали хроматографией на ионообменных смолах, кремнекислоте или бумаге, пропитанной кремнекислотой, в системе диизобутилкетон — уксусная кислота — вода [184, 328, 384, 404, 406, 451, 452, 587]. На бумаге фосфатидные кислоты давали цветную реакцию с Родамином Ж, но не окрашивались Родамином 6Ж. Пятна совпадали с зонами активности на радиоавтографах хроматограмм [184, 451, 452, 784]. Лизофосфатидные кислоты (см. схему, ІІ) анализировали аналогичным методом, но для их отделения от фосфатидилэтаноламина применяли двумерную тонкослойную хроматографию [91, 184, 770, 784].

Рис. 38. Последовательность появления радиоактивности глицерофосфата в различных классах липидов Источник ферментов — микросомы межплодника авокадо (20,5 мг белка). Система содержала глицерофосфат-1,3-С¹⁴ (4,65 × 10⁵ распадов в 1 мин.). 1 — фосфатидные кислоты; 2 — диглицериды; 3 — триглицериды; 4 — моноглицериды [91]

Фосфатидные кислоты и дифосфатидилглицерины можно разделить только в виде их деацилатов — глицерофосфата и диглицерофосфатглицерина соответственно [328, 404]. Единственным водорастворимым продуктом щелочного деацилирования фосфатидных и лизофосфатидных кислот, который идентифицируется методом бумажной и ионообменной хроматографии (стр. 243), является несимметричный L-глицеро-3-фосфат [91, 184, 328, 404, 451, 784]. Следовательно, природные фосфатидные кислоты содержат фосфатный остаток только в положении 3. Соотношения глицерина, фосфата и жирных кислот в препаратах фосфатидных кислот близки к теоретическим [404, 587].

Имеются и другие доказательства промежуточной роли фосфатидных кислот в образовании глицеридов. Так, в микросомной системе биосинтеза из плодов авокадо (стр. 249) глицерофосфат-1,3-С¹⁴ включался прежде всего в фосфатидные кислоты (рис. 38). Затем радиоактивность переходила в указанном порядке в моноглицериды (см. схему, V), диглицериды (IV) и триглицериды. В аналогичном опыте с листьями шпината фосфатидные кислоты в начале инкубации составляли 80—90% суммы липидов. Через 2 часа после начала опыта в системе преобладали глицериды. По-видимому, глицерофосфат образует с ацил-КоА-производными фосфатидные кислоты, которые, в свою очередь, дефосфорилируются, давая диглицериды [91, 184].

Когда пальмитат-С¹⁴ ввели в слизистую кишечника или в дру- <\br> гие ткани in vitro или in vivo, а затем разделили их фосфолипиды, то на долю фосфатидных кислот пришлось 90% общей радиоактивности и только 0,4—1,5% органического фосфора [328, 406, 451, 452, 565, 828]. Таким образом, весьма быструю обмениваемость этих соединений в клетке можно считать доказанной.

В суспензиях клеточных частиц слизистой оболочки, печени, почек и молочной железы немеченые фосфатидные кислоты конкурировали с глицерофосфатом-С¹⁴ за включение в глицериды и полностью заменяли его в системе биосинтеза [36, 196, 247, 405, 407, 449, 452, 665, 867, 897]. В срезах слизистой кишечника жирные кислоты в несколько раз усиливали этерификацию NaH₂P³²O₄ с образованием фосфатидных кислот. Радиоактивность других фосфолипидов при этом не изменялась [449—452].

Все изложенное не оставляет сомнения в том, что фосфатидные кислоты широко распространены в природе и играют роль промежуточных продуктов в глицеролипидном обмене.

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ ФОСФАТИДНЫХ КИСЛОТ ИЗ ГЛИЦЕРОФОСФАТА

Помимо биологических объектов, уже упомянутых выше, биосинтез L-α-фосфатидных кислот обнаружен в скелетных мышцах и эритроцитах [384, 751]. Эта реакция является составной частью ГФ-трансацилазного пути образования триглицеридов и потому не отличается от него по составу субклеточной ферментной смеси и по внутриклеточной локализации [91, 184, 384, 587, 751, 867] (стр. 247).

Изучение кинетики биосинтеза показало, что скорость реакции, пропорциональная концентрации фермента, была постоянной в первый час инкубации, а затем снижалась. Между убылью АТФ и глицерофосфата-Р³² и реакции и образованием АМФ, пирофосфата и Р³²-фосфатидных кислот наблюдалось стехиометрическое соотношение. Включение жирных кислот не происходило вовсе или было сильно ослаблено в отсутствие АТФ и КоА, а также цистеина и ионов Mg²⁺. Фторид, гидроксиламин и избыток самих фосфатидных кислот тормозили реакцию. Выход фосфатидных кислот в субклеточной системе (из расчета на пальмитил-КоА) составлял 80% [384, 587, 665].

Механизм включения жирных кислот в фосфатидные кислоты отличается высокой специфичностью. Хотя пальмитат и стеарат могут входить в эти соединения, главная роль в жирнокислотном обмене фосфатидных кислот, содержащих 10—20% олеата и 70—80% линолеата, принадлежит ненасыщенным кислотам, которые ацилируют преимущественно средние гидроксилы молекулы и при этом усиливают этерификацию пальмитиновой кислоты [406, 587, 751, 841, 898, 977].

Каков же механизм превращения глицерофосфата в фосфатидные кислоты? Как видно из данных рис. 38, в начале инкуба- <\br> ции моноглицериды обнаруживали более высокую радиоактивность, чем диглицериды. Можно думать, что эти моноглицериды представляли собой продукты гидролиза лизофосфатидных кислот фосфатидат-фосфатазой (стр. 258). К тому же небольшое количество лизофосфатидных кислот выделили непосредственно из реакционной смеси [91]. Если это предположение справедливо, то лизофосфатидные кислоты следует считать первыми продуктами неполного ацилирования глицерофосфата. Пока неизвестно, какой из его гидроксилов ацилируется сначала — средний или крайний [713]. Возможно, что замещение каждой ОН-группы контролируется особым ферментом, причем один из них катализирует преимущественное включение ненасыщенных кислот в положение 2 [20].

ОБРАЗОВАНИЕ ФОСФАТИДНЫХ КИСЛОТ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ДИГЛИЦЕРИДКИНАЗЫ

В клеточных структурах мозга, эритроцитов, семядолей арахиса и листьев шпината был обнаружен другой путь синтеза фосфатидных кислот — под действием особого фермента диглицеридкиназы [122, 184, 384, 386]. Этот фермент в простой системе кофакторов (эмульсия диглицерида, АТФ, ионы Mg²⁺, глутатион, фторид и буфер, рН 7—8) осуществлял прямое анаэробное фосфорилирование D-1,2-диглицеридов (см. в на схеме, стр. 254) с образованием фосфатидных и частично лизофосфатидных кислот. В разных тканях относительные скорости ГФ-трансацилазного и диглицеридкиназного путей биосинтеза были различны. Активность диглицеридкиназы, которую легко перевести в раствор путем замораживания и оттаивания, была пропорциональна концентрации ферментного белка, АТФ и диглицеридов, а также ненасыщенности последних. Реакцию тормозило связывание ионов Mg²⁺ с ЭДТА, нагревание до 100° и добавление иодацетата. Вследствие стереоспецифичности фермента фосфорилирование L-1,2-диглицеридов почти не происходило [122, 184, 384, 386, 828].

Физиологическая роль диглицеридкиназы неясна. Непосредственно в биосинтезе диглицеридов она, по-видимому, не участвует, поскольку количество сложноэфирных связей в этой реакции не увеличивается. Вместе с растворимой фосфатидатфосфатазой диглицеридкиназа образует так называемый цикл фосфатидных кислот, которому приписывают важную роль в регуляции ионной проницаемости биомембран (стр. 263) [384].

МОНОГЛИЦЕРИДКИНАЗА И ЕЕ РОЛЬ В БИОСИНТЕЗЕ ГЛИЦЕРИДОВ

Третий путь биосинтеза фосфатидных кислот, являющийся в то же время одним из механизмов прямого использования моноглицеридов в липогенезе (стр. 264), был обнаружен в структурных элементах клеток мозга, печени, эритроцитов, слизистой <\br> кишечника и семядолей арахиса [122, 383, 384, 770, 784]. Фермент моноглицеридкиназа образует из АТФ и моноглицеридов лизофосфатидные кислоты, которые путем ацилирования превращаются в фосфатидные кислоты (см. г, б на схеме, стр. 254) [344, 409, 867].

Содержание лизофосфатидных кислот достигало максимума после 30 мин инкубации. Для проявления активности было необходимо сохранение свободных SH-групп ферментного белка. При фракционировании сульфатом аммония в препарате возрастала концентрация моноглицеридкиназы и снижалось содержание системы, синтезирующей фосфатидные кислоты. Ненасыщенные моноглицериды превращались в лизофосфатидные кислоты быстрее, чем насыщенные [784].

Ниже приведен метод выделения и определения активности фермента из микросом мозга. Микросомы экстрагировали раствором, содержащим (в молях) глицилглициновый буфер — 0,02, pH 6,8, дезоксихолеат Na — 0,006, сахарозу — 4,25% и глутатион — 0,001. Осадок отделяли при 105 000 g и надосадочную жидкость фракционировали сульфатом аммония (30% насыщения). Фермент (4 мг) инкубировали один час в системе, содержащей, кроме раствора для экстракции, 1-монопальмитин — 0,002, Mg²⁺ — 0,002, фторид Na — 0,01 и АТФ-генерирующую систему в общем объеме 9 мл. После инкубации смеси методами хроматографии (стр. 254) выделили всего 0,1—2,0 мкмоля лизофосфатидных кислот [784].

Столь малое количество этих кислот указывает на их быстрое превращение в какие-то другие продукты. Действительно, в клеточных структурах мозга, печени и эритроцитов под действием фермента лизофосфатидат-трансацилазы P³²-L-α-(α'-олеил)-лизофосфатидные кислоты этерифицировались пальмитил-КоА, давая P³²-L-α-фосфатидные кислоты. Это трансацилирование обычно в несколько раз превосходило по скорости моноглицеридкиназную реакцию. Максимума радиоактивности фосфатидных кислот в клеточных частицах и в мембранах эритроцитов достигали соответственно за 10 и 60 мин. Фторид и ионы Mg²⁺ активировали трансацилирование благодаря торможению фосфатидат-фосфатазы (стр. 262). Несмотря на то, что моноглицеридкиназа фосфорилировала 1- и 2-моноглицериды с одинаковой скоростью, β-лизофосфатидные кислоты, возникшие из 2-моноглицеридов, не были способны превращаться в фосфатидные кислоты [384, 784].

До недавнего времени роль моноглицеридного пути образования фосфатидных кислот в биосинтезе триглицеридов в живой ткани, в частности в слизистой кишечника, оставалась неясной [409, 867]. Сейчас, однако, показано, что в превращении моноглицеридов в ди- и триглицериды могут участвовать фосфорилированные производные. В кишечник крысы вводили дважды меченный 1-монопальмитин (пальмитат-9,10-Н³-глицерин-1-C¹⁴), где соотношение активностей р = [H³] / [C¹⁴] составляло 3,6. Липиды слизистой раз- <\br> Таблица 30 Включение 1-монопальмитина-1-С¹⁴-9,10-Н³ в глицериды и фосфолипиды слизистой оболочки кишечника крысы in vitro [770]

деляли хроматографически и определяли [Н³] и [С¹⁴] в их отдельных классах. Табл. 30 показывает, что значение р изменялось по следующей схеме: моноглицериды (3,6) → лизофосфатидные кислоты (3,2) → фосфатидные кислоты (4,5) → диглицериды (4,6) → триглицериды (6,0). Таким образом, глицериды слизистой синтезировались путем ацилирования лизофосфатидных кислот и диглицеридов пальмитатом-Н³, образовавшимся из 1-монопальмитина (см. б, г, д на схеме, стр. 254), а величина прироста р на каждом этапе этого процесса, приблизительно равная 1,4, по-видимому, отражала радиоактивность метаболического резервуара (стр. 233) свободных жирных кислот ткани [770].

ФОСФАТИДАТ-ФОСФАТАЗА: ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ, СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ВЫДЕЛЕНИЕ

Превращение фосфатидных кислот в D-1,2-диглицериды (см. д на схеме, стр. 254) осуществляет специфический фермент фосфатидат-фосфатаза (Ф-фосфатаза), впервые обнаруженная в 1957 г. Кеннеди в печени [886]. Ф-фосфатаза (L-α-фосфатидат-фосфогидролаза, КФ 3.1.3.4) в том или ином количестве найдена также в мозгу, сердце, мембране эритроцитов, скелетных мышцах, слизистой кишечника, почках и жировой ткани различных млекопитающих и птиц [214, 384, 386, 449, 453, 710, 827, 841, 886, 977]. В настоящее время установлено, что в живых тканях содержится не одна, а несколько Ф-фосфатаз, различных по свойствам. <\br> Для измерения активности фермента 0,03 моля малеатного буфера, рН 6,4, и 0,0025 моля фосфатидной кислоты инкубировали с ферментом один час в общем объеме 2 мл, прибавляли 4 мл 5%-ной ТХУ и определяли содержание ортофосфата в фильтрате. Количестве фермента, образующее 1 мкмоль фосфата в час на 1 мг белка, принимали за единицу его активности [214, 989].

Специфическим субстратом всех Ф-фосфатаз служат L-α-фосфатидные и L-α-лизофосфатидные кислоты (см. II, III на схеме, стр. 254) [385, 449, 453]. Жирнокислотный состав субстрата влияет на скорость его гидролиза, поскольку фосфатидные кислоты, полученные из природного лецитина или же содержащие одинаковые ацильные группы в обоих положениях, преимущественно расщеплялись ферментом. Возможно, что такая специфичность определяет своеобразие глицеридного состава данной ткани [20, 911]. Выход D-1,2-диглицеридов при гидролизе достигает 90% [886].

Фермент почти не гидролизует L-глицеро-3-фосфат, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, дифосфоинозитид и синтетические β-фосфатидные кислоты, но может расщеплять алкилфосфаты с длинной цепью [214, 385, 449, 453, 568]. Таким образом, для проявления активности Ф-фосфатазы необходимо, чтобы глицерофосфат был этерифицирован хотя бы одним остатком жирной кислоты, чтобы ортофосфатная группа находилась в α-положении и чтобы в этой группе не происходило дальнейшего замещения [214, 453].

Ф-Фосфатаза была впервые выделена путем осаждения надосадочной жидкости гомогената печени цыплят 1 М ацетатным буфером, рН 5 [886]. Современные методы препаративного получения этого фермента основаны на предварительном разделении и тщательной очистке клеточных фракций. Например, гомогенат печени в 9 частях раствора 0,25 М сахарозы и 0,002 М ЭДТА разделяли на безъядерный гомогенат, митохондрии, лизосомы, микросомы и бесструктурную надосадочную жидкость при 1000 g (10 мин.), 4300 g (10 мин.), 11 700 g (20 мин.), 104 000 g (60 мин.) соответственно. Для обеспечения однородности каждый осадок многократно промывали на центрифуге [863, 989].

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ, КИНЕТИКА И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ОБЕИХ ФОРМ Ф-ФОСФАТАЗЫ

Сейчас установлено, что Ф-фосфатаза содержится в структурных элементах клетки [911]. Действительно, в жировой ткани фермент обнаружили в «тяжелых частицах» (по-видимому, митохондриях); в слизистой хомяка он распределялся почти поровну между митохондриями и микросомами, а в слизистой кишечника кошки и в почках свиньи на 60% сосредоточивался в микросомах [214, 408, 409, 452, 453, 827]. Возникло мнение, что Ф-фосфатаза, как и другие ферменты глицерофосфатного пути биосинтеза, кроме глицерокиназы, локализована только в микросомах [214]. Однако <\br> ее активность постоянно обнаруживалась и в более тяжелых частицах гомогената. Распределение Ф-фосфатазы внутри клетки изучали с использованием очищенных субклеточных фракций (см. выше). Однородность фракций определяли по удельной активности для данной фракции маркирующего фермента: 1) сукциноксидазы для митохондрий, 2) фосфомоноэстеразы для лизосом, 3) глюкозо-6-фосфат-фосфатазы для микросом ¹ и 4) 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы для бесструктурной надосадочной жидкости [409, 863, 989]. Было показано, что основная активность Ф-фосфатазы сосредоточена в лизосомах печени крысы, а при переходе к митохондриям и затем к микросомам эта активность каждый раз снижается вдвое. Результаты другого опыта (табл. 31) свидетельствуют о том, что каждая из фракций обладает собственной Ф-фосфатазой, причем микросомы содержат наибольшее количество этого фермента, а лизосомы характеризуются его наивысшей удельной активностью [863, 989].

Таблица 31 Внутриклеточное распределение маркирующих ферментов, фосфатидат-фосфатазы и белка в печени крысы [863]

• По отношению к активности в безъядерном гомогенате. Обозначения маркирующих ферментов приведены на стр. 260 и 261.

Однако изучение внутриклеточной локализации Ф-фосфатазы не ограничилось уровнем отдельных структур цитоплазмы. Оказалось, что в каждой клеточной частице печени имеются две формы фермента. Растворимую Ф-фосфатазу, содержащуюся преимущественно в лизосомах и митохондриях, можно было извлечь

¹ Недавно было показано, что глюкозо-6-фосфат-фосфатазная активность препарата митохондрий, составляющая 4—10% от соответствующей активности в микросомах, не связана с присутствием последних в препарате, а вызывается содержанием этого фермента во внешних мембранах митохондрий. Поэтому глюкозо-6-фосфат-фосфатазу допустимо использовать для контроля микросомного загрязнения лишь в интактных митохондриях [152a]. <\br> трех-четырех-кратным замораживанием и оттаиванием суспензии. Неэкстрагируемая часть фермента прочно связана и преобладает в микросомах [863, 989].

Когда микросомы печени после четырехдневного автолиза и шестичасового действия РНК-азы обработали 8%-ным н-бутанолом в 2,5×10⁻² М этаноламиновом буфере, рН 10,5, то прочно связанная Ф-фосфатаза полностью растворилась. Очищенный фермент частично осаждался 5 × 10⁻² М малеатным буфером, рН 6, содержал 0,3 мкмоля высших жирных кислот на единицу активности, снижал активность на 25% под действием фосфолипазы А и тормозился детергентами. Сопоставляя эти факты с необходимостью органического растворителя (бутанола) для растворения фермента, можно заключить, что прочно связанная Ф-фосфатаза микросом имеет липопротеиновую природу [214, 863].

В течение первых 40 мин. инкубации, когда расщеплялось 35—40% субстрата, кинетика гидролиза соответствовала уравнению нулевого порядка [214]. Судя по величине Км, растворимые ферменты лизосом и митохондрий печени отличались более высоким сродством к субстрату, чем прочно связанные Ф-фосфатазы митохондрий и микросом [863]. Оптимум концентрации для фосфатидной кислоты был равен 3 × 10⁻³ М, а для фермента — 5,5 мг белка на 1 мл [385, 886].

Другие фосфатазы цитоплазмы — кислая и щелочная (рН 5 и 10) — не расщепляют фосфатидные кислоты. Оптимум рН суммарной Ф-фосфатазной активности клеточных частиц составляет 6,0—6,5, а различие между растворимым и прочно связанным ферментом по этому показателю равно единице рН [214, 568, 863].

Тормозящее действие детергентов и свободных жирных кислот на Ф-фосфатазу вызвано изменением дзета-потенциала связанных с белком липидов на поверхности липопротеинового комплекса фермента. Особенно сильным ингибитором фермента является неионогенный детергент Твин-20, который тормозит преимущественно нерастворимую часть фермента. В то же время ингибирующее действие ионогенных детергентов направлено главным образом на растворимую Ф-фосфатазу [196, 214, 407, 863, 867, 886, 898].

Торможение фермента n-хлорртутьбензоатом снимается глутатионом; следовательно, свободные SH-группы ферментного белка необходимы для проявления Ф-фосфатазной активности. Ионы фторида (10⁻² М) вдвое снижают суммарную активность микросом, а на действие растворимого фермента эритроцитов не влияют [214, 385, 897].

Для всех Ф-фосфатаз чрезвычайно характерна чувствительность к двухвалентным катионам, особенно к ионам Mg²⁺. В нейтральной среде высокие концентрации Mg²⁺ (10—20 мкмолей/мл), образующего нерастворимые Mg-фосфатидаты, сильнее ингибировали активность фермента и вызывали большее накопление фосфатидных кислот, чем в кислой среде, где растворимость фос- <\br> фатидатов была выше. В малых дозах (2—10 мкмолей/мл) ионы Mg²⁺ стимулировали растворимые Ф-фосфатазы митохондрий печени и мембран эритроцитов, а на прочно связанную форму фермента оказывали только тормозящее действие. Ингибиторами реакции были также двухвалентные катионы Са, Ва, Mn, Fe, Zn и Hg [214, 386, 568, 863, 897].

Таким образом, в клетке присутствуют по меньшей мере две различные Ф-фосфатазы. Сопоставление некоторых свойств обоих ферментов показало, что константы Михаэлиса растворимой и прочно связанной фосфатазы равны 1,6—6,1 × 10⁻³ и 1,3—1,5 × × 10⁻² М, а оптимум рН 6,5 и 5,5 соответственно. Растворимая фосфатаза ингибируется ионными детергентами и не ингибируется фторидом, активируется ионами Mg²⁺ и сосредоточена преимущественно в структурах, не синтезирующих глицериды. Прочно связанная фосфатаза, напротив, ингибируется неионными детергентами, фторидом и ионами Mg²⁺. Она сосредоточена в структурах, синтезирующих глицериды.

Растворимая Ф-фосфатаза содержится главным образом в лизосомах, которые известны как средоточие гидролитической активности цитоплазмы, и в мембранах оболочки эритроцитов, где глицерофосфатный путь синтеза фосфатидных кислот почти отсутствует. Полное извлечение растворимого фермента из митохондрий не приводит к снижению их общей ГФ-трансацилазной активности [385, 863, 989]. По-видимому, Ф-фосфатаза этого типа имеет непосредственное отношение не к липогенезу, а к процессам регуляции поглощения катионов биологическими мембранами (стр. 257).

Прочно связанная форма Ф-фосфатазы сходна с ферментами синтеза глицеридов тем, что она тоже сосредоточена в микросомах и отчасти в митохондриях и не экстрагируется из клеточных структур при замораживании [863]. Весьма вероятно, что эта форма фермента является составной частью пространственно-организованного многоферментного комплекса микросом, который осуществляет синтез триглицеридов в живой клетке.

Выше (стр. 254) приведены те реакции этого комплекса, которые связаны с образованием диглицеридов из фосфорилированных предшественников. Как видно, исходным продуктом синтеза диглицеридов может служить не только глицерофосфат, но и моноглицерид. Далее будет рассмотрен другой путь превращения моноглицеридов в ди- и триглицериды, в котором соединения фосфорной кислоты не являются непосредственными промежуточными продуктами.

ОБРАЗОВАНИЕ ДИГЛИЦЕРИДОВ НА ОСНОВЕ МОНОГЛИЦЕРИДОВ И ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ БИОСИНТЕЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Глава 22. БИОСИНТЕЗ ДИГЛИЦЕРИДОВ НА ОСНОВЕ МОНОГЛИЦЕРИДОВ

СВОЙСТВА МОНОГЛИЦЕРИД-ТРАНСАЦИЛАЗЫ

Исследование всасывания жиров в кишечнике (стр. 219) показало, что 85—90% триглицеридов лимфы сходны с триглицеридами рациона по 2-моноглицеридной структуре. Если бы триглицериды слизистой образовывались только из глицерофосфата и свободных жирных кислот, возникших при гидролизе, то наблюдаемое сходство в строении было бы невозможным. Поэтому предположили, что наряду с глицерофосфатным путем в этой ткани имеется и другой — «моноглицеридный» путь жирообразования, который состоит в непосредственном ацилировании моноглицеридов алифатическими ацил-КоА-производными без участия фосфатидных кислот [867, 977].

Действительно, в слизистой кишечника различных животных, а также в молочной железе морской свинки, поджелудочной железе и почках был найден фермент моноглицерид-трансацилаза (МГ-трансацилаза), или ацил-КоА : моноглицерид-ацилтрансфераза, КФ 2.3.1, осуществляющий прямое превращение моноглицеридов в диглицериды. Распространение этого фермента в живых тканях, по-видимому, ограничено, поскольку в молочной железе козы и крысы, в мозгу, печени, жировой ткани и аорте он не был обнаружен [36, 54, 664, 863, 870].

Как и в случае ГФ-трансацилазы (стр. 247), внутриклеточная локализация МГ-трансацилазы была установлена не сразу. Сначала средоточием фермента считали митохондрии и бесструктурную надосадочную жидкость гомогената [36, 194]. Затем возникло представление о двух формах МГ-трансацилазы — прочно связанном ферменте митохондрий и микросом, который нельзя солюбилизировать замораживанием или действием змеиного яда, и растворимой форме, на долю которой приходится до 66% всей активности гомогената [195, 198].

В дальнейшем для получения гомогената слизистой разрушаемую этой тканью 0,25 М сахарозу (d = 1,034) заменили изотоническим раствором маннита (d = 1,016), что привело к более полному осаждению микросом при тех же условиях центрифугирования; одновременно чистоту фракций клеточных частиц стали характеризовать активностью цитохромоксидазы (митохондрии) и высоким содержанием РНК (микросомы, стр. 235). Применение этих <\br> новых методов не оставило сомнения в том, что МГ-трансацилаза вместе с ацил-КоА-синтетазой и диглицерид-трансацилазой на 65—90% локализована в микросомах и что, следовательно, там содержится полный набор ферментов моноглицеридного пути ресинтеза триглицеридов [55, 198, 408, 409, 867, 869, 870]. Электронномикроскопическое исследование эпителия кишечника в период всасывания жира подтвердило этот вывод, показав, что мельчайшие жировые капли заключены в мембранах эндоплазматического ретикулума эпителиальной клетки (стр. 248) [870].

Таким образом, препаратом МГ-трансацилазы чаще всего служат микросомы, выделенные центрифугированием гомогената слизистой в растворе 0,28 М маннита-0,01 М трис-малеатного буфера, рН 7 (стр. 235) [55, 194, 408, 456, 870]. Среда для определения активности фермента была близка по составу к приведеной выше (стр. 249), но вместо глицерофосфата в фосфатном буфере содержала эквимолярное количество моноглицеридов в трис-буфере, pH 7 [36, 194, 196, 664]. Если вместо жирных кислот применяли ацил-КоА-производные (0,2 — 1,0 мкмоль), то из среды исключали кофакторы их биосинтеза (стр. 238) — АТФ, КоА и глутатион. Прирост сложноэфирных связей в полной системе, установленный гидроксамовым методом (стр. 237), свидетельствует об увеличении общего содержания глицеридов при инкубации. В данном случае образование диглицеридов в присутствии АТФ доказывает, что лизофосфатидные кислоты не участвуют в реакции (см. ниже) [152, 454, 456, 457, 870].

Действие фермента останавливали ТХУ, серной кислотой или растворителями липидов — смесью хлороформа с метанолом (2 : 1) и этанолом. Триглицериды, 1,2 (2,3)-диглицериды, моноглицериды и СЖК разделяли на силикагеле [55, 456, 870, 874], а радиоактивность отдельных классов измеряли на сцинтилляционном спектрометре (стр. 246) [870]. Содержание моноглицеридов определяли периодатным методом в сочетании с изомеризацией в хлорной кислоте [55].

Для сопоставления ацилакцепторной способности моноглицеридов разного жирнокислотного состава в реакции степень их эмульгирования в водной среде должна быть одинаковой. Эмульгаторами обычно служат Твин-20 или Твин-80 (2—10 мг), а также щелочные соли жирных кислот, сывороточный альбумин и 5%-ный ацетон. Твин ингибирует диглицерид-трансацилазу и моноглицерид-липазу микросом (стр. 275), приводя тем самым к накоплению в них диглицеридов и облегчая определение МГ-трансацилазной активности, которая не только не снижается, но даже несколько активируется этими эмульгаторами. Отсутствие тормозящего действия Твина в МГ-трансацилазной системе, отсутствие конкурентного влияния фосфатидных и лизофосфатидных кислот на включение пальмитата-С¹⁴ в диглицериды и, наконец, установленное хроматографически отсутствие самих фосфорилированных производных в продуктах реакции — все это еще раз доказывает, <\br> что фосфатидные кислоты не являются промежуточными продуктами ацилирования моноглицеридов [36, 196, 198, 238, 407, 455, 664, 665, 867, 870].

Оптимальная концентрация моноглицеридов и ферментного белка в реакционной смеси равнялась соответственно 3,3 мкмоля и 1,5—2,5 мг/мл, а средняя скорость включения пальмитата в диглицериды микросомами слизистой составляла 47—80 мкмолей/мг белка в час [198, 408, 409, 449]. МГ-Трансацилаза была устойчива к замораживанию до —20°, но тормозилась нагреванием и избытком ионов Mg²⁺ [196, 198, 869, 870].

Поскольку свободный глицерин или глицерофосфат не заменяют моноглицериды в ферментативной реакции, можно предположить, что МГ-трансацилаза представляет собой липопротеин, к активному центру которого присоединяются только гидрофобные производные глицерина, замещенные по одной из ОН-групп алифатической цепью [198, 870, 874]. Природа возникающей при замещении сложной или простой эфирной связи (стр. 269), 1- или 2-положение алифатического остатка, D- или L-конфигурация 1-замещенного производного глицерина не определяют субстратной специфичности фермента [150, 152, 405, 449, 867]. Уменьшение m и увеличение е в жирной цепи моноглицеридов облегчают их эмульгирование и обычно стимулируют МГ-трансацилазу, причем наиболее активными акцепторами ацилов оказываются монокаприн, моноундецилин и моноолеин. Однако растворимые в воде производные насыщенных кислот с m = 2—8 — худшие субстраты реакции, чем монопальмитин [196, 198, 407, 449, 870].

ПРОДУКТЫ МГ-ТРАНСАЦИЛАЗНОЙ РЕАКЦИИ

Глицеридный состав бесклеточной МГ-трансацилазной системы (1,87% моно-, 88,80% ди- и 9,33% триглицеридов) и динамика радиоактивности отдельных классов липидов в реакционной смеси (рис. 39) свидетельствуют о том, что первыми продуктами ацилирования в микросомах кишечника крысы являются диглицериды [194, 198, 405, 449, 870].

Рис. 39. Последовательность появления радиоактивности пальмитил-1-С¹⁴-КоА в различных классах липидов и накопление свободного пальмитата-1-С¹⁴ во фракции микросом слизистой кишечника крысы в присутствии 1-монопальмитина Условия инкубации и анализа липидов см. стр. 249 [870]. 1 — фосфатидные кислоты; 2 — моноглицериды; 3 — триглицериды; 4 — свободный пальмитат; 5 — диглицериды <\br> В микросомах слизистой хомяка 2-монопальмитин сразу, без промежуточного накопления диглицеридов, превращался в триглицериды, которые разделяли тонкослойной хроматографией с Ag⁺ (стр. 41). Ниже показана схема реакции и приведен теоретически ожидавшийся и найденный экспериментально состав триглицеридов.

Схема биосинтеза триглицеридов в эквимолярной смеси 2-монопальмитина-9,10-С¹⁴, пальмитил-КоА (П-КоА) и олеил-КоА (О-КоА) [456]

где: 25, 50, 25 — вычисленное (в %) распределение концентрации; 24, 48, 22 — найденное распределение концентрации.

Можно видеть, что схема достаточно полно отражает действительный ход биосинтеза. При инкубации 2-монопальмитина только с пальмитил-КоА или олеил-КоА в триглицеридах преобладали соответственно ППП и ОПО. Если же ацил-КоА-производные заменяли смесью свободных жирных кислот, АТФ и КоА, то при применении чистых жирных кислот результаты оставались прежними, а из эквимолярной смеси олеата и пальмитата возникал главным образом ППП. Аналогичные результаты были получены в реакции 1-монопальмитина с отдельными ацил-КоА-производными или их смесью, а также со свободными жирными кислотами. Итак, в изучаемой системе ферментов при ацилировании моноглицеридов тиоэфирами КоА не происходило первоочередного замещения первичных или вторичных ОН-групп и преимущественного использования насыщенных или ненасыщенных жирных кислот и моноглицеридов. Повышенная скорость включения свободного пальмитата в триглицериды, по-видимому, была связана с большим сродством ацил-КоА-синтетазы к этой кислоте (стр. 238) [456].

Как видно из рис. 39, в микросомах, особенно в отсутствие пальмитил-КоА, весьма активна моноглицеридлипаза, вызывающая накопление свободного пальмитата. Образование диглицеридов не <\br> обусловлено ацилтрансферазным обменным действием этого фермента (стр. 234), так как, во-первых, для ацилирования необходимы АТФ или ацил-КоА-производные, а во-вторых, МГ-трансацилаза и моноглицеридлипаза различаются по оптимуму рН (8,0 и 5,0) [198]. Однако при наличии липазы нельзя исключить возможности раздельного включения в диглицериды продуктов гидролиза или изомеризации меченых моноглицеридов. Чтобы доказать, что моноглицериды превращаются в ди- и триглицериды в интактном виде, не изменяя строения, были поставлены специальные опыты [454, 455].

Выше уже упоминалось о том, что в слизистой кишечника in vivo меченные по ацильному остатку 2-моноглицериды, включаясь в триглицериды лимфы, не претерпевают ацильной миграции [449, 571]. При изучении строения триглицеридов, образовавшихся в гомогенате слизистой in vitro из 1- или 2-монопальмитина-(пальмитат-С¹⁴), было обнаружено, что в первом случае С¹⁴ находился преимущественно в 1,3-, а во втором — в 2-положении триглицеридов [151, 152, 449]. Распределение радиоактивности (в %) в продуктах липазного гидролиза триглицеридов, образовавшихся в гомогенате слизистой in vitro из 1- или 2-монопальмитина-(пальмитат-С¹⁴) [151, 152, 449], показано ниже:

Включение радиоактивности в ди- и триглицериды и прирост количества сложноэфирных связей наблюдали и в бесклеточных системах слизистой, содержащих ацил-КоА-производные и меченные по глицерину 1-моноглицериды-С¹⁴ или -Н³ [408, 867, 870]. Такие опыты не доказывали, однако, что радиоактивные триглицериды не синтезировались из глицерофосфата-С¹⁴, который мог образоваться при действии глицерокиназы кишечника (стр. 240) на свободный глицерин-С¹⁴, возникший при липазном гидролизе [449, 571]. Поэтому наиболее убедительные данные были получены с применением дважды меченного 1-монопальмитина, р = 1,88 (стр. 258), который после двухчасовой инкубации с гомогенатом слизистой в присутствии нерадиоактивного пальмитил-КоА на 63% превращался в ди- и триглицериды с величиной р 1,89 и 1,82 соответственно [449, 454, 455, 867].

Таким образом, 1-моноглицериды включаются в диглицериды в интактном виде. К сожалению, аналогичные опыты труднее провести с более важными в физиологическом отношении 2-моноглицеридами, которые в водной среде, даже при оптимальном для МГ-трансацилазы значении рН, могут частично изомеризоваться в 1-моноглицериды [54, 55, 150, 874]. Поэтому вместо 1- и 2-моно- <\br> глицеридов применяли глицерил-1- и -2-(9, 10-Н³)-октадецениловый и глицерил-2-(1-C¹⁴)-октадециловый эфиры, которые, имея простую эфирную связь, устойчивы к изомеризации и не разрушаются гидролизом. При инкубации этих эфирных аналогов 1- и 2-моноглицеридов со срезами кишечника хомяка или крысы в присутствии желчнокислых солей и олеиновой кислоты появлялись соответствующие аналоги ди- и триглицеридов, из продуктов щелочного гидролиза которых можно было регенерировать исходные 1- и 2-глицериловые эфиры. Следовательно, превращаясь в диглицериды, 2-моноглицериды, наряду с 1-изомерами, сохраняют первоначальное строение [571, 874].

Что касается продуктов этого превращения, то, разумеется, 2-моноглицериды могут непосредственно образовывать только 1,2-диглицериды. Возникает вопрос, какие соединения появляются при моноацилировании 1-моноглицеридов, содержащих и первичные, и вторичные ОН-группы. Как показывают данные, полученные методом тонкослойной радиохроматографии, этими соединениями являются 1,3-диглицериды [455]. Распределение радиоактивности С¹⁴-пальмитил-КоА в 1,2- и 1,3-диглицеридах и триглицеридах при инкубации с 1- и 2-монопальмитином в гомогенате слизистой кишечника хомяка в % от исходной активности было следующим.

В слизистой хомяка из С¹⁴-пальмитил-КоА и (глицерин-Н³)-1-монопальмитина синтезировались преимущественно 1,3-дипальмитин и лишь небольшое количество 1,2-изомера. В отличие от последнего, значение р (стр. 258) 1,3-диглицерида было вдвое выше теоретически вычисленной величины р трипальмитина, который мог бы образоваться в той же системе биосинтеза триглицеридов. Следовательно, только 1,3-дипальмитин служил промежуточной ступенью этого биосинтеза. И наконец, именно этот изомер накапливался в реакционной смеси, если концентрация пальмитил-КоА была недостаточна для полного превращения 1-монопальмитина в триглицериды [449]. Таким образом, МГ-трансацилаза слизистой кишечника специфична к 1-ОН-группам 1- и 2-моноглицеридов [54, 55, 152, 449, 455, 457, 867, 874].

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО АЦИЛИРОВАНИЯ МОНОГЛИЦЕРИДОВ

При изучении кинетики МГ-трансацилазы применяли микросомы слизистой кишечника крысы, которые, в противоположность аналогичным клеточным частицам хомяка, могли эффективно ис- <\br> пользовать для биосинтеза триглицеридов почти исключительно 2-моноглицериды. Ацилирование же основной части 1-монопальмитина в этих органоидах происходило медленнее и не шло дальше образования 1,3-дипальмитина. Эта реакция тормозилась 2-монопальмитином, в то время как 1-монопальмитин почти не оказывал влияния на этерификацию 2-изомера. Наблюдаемая конкуренция свидетельствует о том, что в микросомах имеется только одна МГ-трансацилаза и что по величине сродства к этому ферменту 2-моноглицериды превосходят 1-изомер [55, 449, 867, 870].

Кинетику реакции обычно определяли в течение первых 5 мин. инкубации до исчезновения половины моноглицеридов из реакционной смеси, когда кривые включения жирных кислот в глицериды имели еще линейный характер [55, 151, 870]. Если построить график зависимости между обратными величинами концентрации субстрата и скорости ацилирования (1/S и 1/v) за этот период, то можно заметить, что при переходе ацильного остатка монопальмитина (субстрата S) из 1-положения в 2-положение Kₘ снижается, а истинная субстратная константа взаимодействия комплекса МГ-трансацилаза (Е)-пальмитил-КоА (Т) с субстратом S возрастает в 4—7 раз. Одновременно увеличивается и скорость распада ES-комплекса. Реакция фермента с субстратами Т и S показана на схеме.

Схема реакции моноглицерид-трансацилазы (Е) с 1- или 2-монопальмитином (S) и пальмитил-КоА (Т).

где: k — скорость распада комплекса EST с образованием диглицеридов; Kₛ, Kₜ, K'ₛ, K'ₜ — субстратные константы, характеризующие сродство фермента и комплексов ЕТ и ES к субстратам S и Т [55]. <\br> В состоянии равновесия v = k × [EST] = {kKₛ × Kₜ [E]₀ [S] [T]} / {1 + Kₛ [S] + Kₜ [T] + KₛK'ₜ [S] [T]}, где [S], [T] и [E]₀ — исходные концентрации монопальмитина, пальмитил-КоА и фермента. Преобразовав это уравнение в уравнение Михаэлиса-Ментен, нашли истинные величины субстратных констант взаимодействия МГ-трансацилазы с 1- и 2-монопальмитином [55].

Вычисленные данные подтвердили сделанный ранее из графика и из опытов по конкурентному торможению вывод о повышенном сродстве 2-изомера к ферменту и ЕТ-комплексу. Сродство пальмитил-КоА к МГ-трансацилазе и ее комплексу с монопальмитином не зависит от изомерной формы последнего, но комплекс ЕТ-2-монопальмитин вдвое превышает комплекс ЕТ-1-монопальмитин по скорости распада. Таким образом, главный путь ресинтеза триглицеридов в микросомах эпителия крысы изображается схемой: 2-моноглицериды → 1,2-диглицериды → триглицериды [54, 55].

ЗНАЧЕНИЕ МОНОГЛИЦЕРИДНОГО И ГЛИЦЕРОФОСФАТНОГО ПУТЕЙ БИОСИНТЕЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ В СЛИЗИСТОЙ КИШЕЧНИКА

Поскольку в слизистой кишечника триглицериды могут образовываться как по глицерофосфатному, так и по моноглицеридному пути, неоднократно пытались оценить долю каждого из путей в общем балансе биосинтеза. С этой целью клеточные частицы ткани инкубировали с глицерофосфатом или с 1- и 2-моноглицеридами и определяли скорость этерификации меченых ацил-КоА-производных тем или иным акцептором ацильных групп. При совместном присутствии акцепторов наблюдался аддитивный эффект, свидетельствующий об известной независимости отдельных путей биосинтеза диглицеридов. Была обнаружена видовая специфичность липидного обмена у различных животных. Так, у кролика первый из путей был по интенсивности в 1,5—2 раза выше, а у крысы — в 10 раз ниже второго [194].

Эти ранние опыты не вполне совершенны в методическом отношении, поскольку эмульгированные моноглицериды не были так же доступны для фермента клеточных частиц, как растворимый в воде глицерофосфат. Поэтому в дальнейших исследованиях измерением радиоактивности учитывали только включение (гли- <\br> церин-1-C¹⁴)-1-моноолеина и олеата-Н³ срезами кишечника хомяка в мицеллярном растворе дезоксихолеата [571].

При расчете доли каждого из путей в синтезе глицеридов исходили из того, что 1-моноолеин превращался в ди- и триолеин в интактном виде (стр. 269) и что возникший при гидролизе моноолеина свободный глицерин-С¹⁴ не участвовал в реакции. Для синтеза 11 молей диолеина из моноолеина-С¹⁴ было необходимо 11 молей

Рис. 40. Диаграмма синтеза ди- и триглицеридов (ДГ и ТГ) срезами тонкого кишечника хомяка (100—200 мг) при инкубации в течение 30 мин. при 37° в атмосфере чистого кислорода в системе, содержащей в мкмолях тауродезоксихолеат Na 2400; олеиновую кислоту-Н³ 800 и 1-моноолеин-(глицерин-С¹⁴) 0(а), 200(б) или 400(в) Перед определением радиоактивности глицериды разделяли тонкослойной хроматографией [571]; 1 — глицерофосфатный путь; 2 — моноглицеридный путь

олеата-Н³. Остальной олеат (13,7 моля) включился в диолеин путем ацилирования глицерофосфата, каждый моль которого связывал 2 моля жирной кислоты [571]. Следовательно, этим путем образовалось 13,7 : 2 = 6,85 моля диолеина. Аналогичным вычислением можно показать, что для синтеза 61,8 моля триолеина-С¹⁴ из моноолеина-С¹⁴ требуются 61,8 × 2 = 123,6 моля олеата-Н³. Поскольку эта величина в пределах ошибки опыта соответствует количеству олеата-Н³, включившемуся в триолеин (120 молей), очевидно, что весь триолеин образовался в этих условиях только из 1-моноолеина.

Выполненные расчеты (рис. 40) свидетельствуют о том, что биосинтез триглицеридов из свободной олеиновой кислоты идет исключительно по глицерофосфатному пути [571]. Эти данные совпадают с полученными ранее [867] указаниями на то, что в триглицеридах, выделенных из лимфы после введения в кишечник свободных С¹⁴-жирных кислот, радиоактивность распределена статистически между всеми тремя положениями ацильных остатков, а не присуща какому-либо определенному положению, как это имеет место при скармливании триглицеридов (стр. 264). С увеличением концентрации моноолеина в реакционной смеси доля учас- <\br> тия глицерофосфатного пути в образовании ди- и триглицеридов снижается, а интенсивность моноглицеридного пути и общая интенсивность биосинтеза неуклонно возрастают. В опытах с 2-моноэфирными аналогами 2-моноглицеридов отмечались сходные результаты [571].

Таким образом, моноглицеридный путь биосинтеза триглицеридов, локализованный в слизистом эпителии кишечника, представляет собой весьма эффективный физиологический механизм, облегчающий всасывание больших количеств жиров рациона из просвета кишечника в лимфатическую систему. В результате быстрой нестереоспецифической реакции МГ-трансацилаза ресинтезирует из 2-моноглицеридов и свободных кислот мицеллы, адсорбированной мембранами ретикулума, триглицериды, близкие по строению и составу к жирам рациона (стр. 222). В энергетическом отношении моноглицеридный путь вдвое выгоднее глицерофосфатного пути, так как требует для синтеза 1 моля триглицеридов всего 2 моля АТФ вместо 4. Нельзя считать случайным и совпадение между субстратной специфичностью панкреатической липазы, образующей при гидролизе почти исключительно 2-моноглицериды, и преимущественным сродством МГ-трансацилазы к этим изомерам. Глицерофосфатный путь играет, по-видимому, подчиненную роль в процессах всасывания жира, но может выступать на первый план при липидном голодании и при содержании в рационе большого количества свободных жирных кислот. Кроме того, при оценке путей биосинтеза липидов в слизистой кишечника не следует забывать об открытом недавно превращении 1-моноглицеридов в триглицериды при участии лизофосфатидных и фосфатидных кислот (стр. 258) [867, 977].

Глава 23. БИОСИНТЕЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПУТЕМ АЦИЛИРОВАНИЯ ДИГЛИЦЕРИДОВ

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ДИГЛИЦЕРИД-ТРАНСАЦИЛАЗЫ

В предыдущих разделах показано, что глицерофосфатный и моноглицеридный пути приводят к образованию диглицеридов, которые только и могут непосредственно превращаться в триглицериды. При длительном выдерживании интактных тканей с мечеными жирными кислотами наблюдался постепенный переход С¹⁴ из диглицеридов, отличавшихся в начале инкубации наибольшей радиоактивностью, в триглицериды (стр. 231). Аналогичное явление неоднократно обнаруживалось и в бесклеточных системах биосинтеза (см. рис. 38 и 39). Так, в препаратах жировой ткани после удаления меченого предшественника происходило выравнивание концентрации С¹⁴ в ди- и триглицеридах, а в клеточных частицах диафрагмы соотношение удельной активности <\br> этих классов после исключения пальмитата-С¹⁴ из среды снижалось с 8 до 2 [752]. В печени превращение Н³-пальмитат- и С¹⁴-олеат-диглицеридов в триглицериды отмечалось уже в течение первых 3 мин. инкубации [301]. Перераспределение метки между ди- и триглицеридами нельзя приписать неспецифической ацилтрансферазной активности липазы (стр. 234), поскольку оно сопровождалось ростом общей концентрации сложноэфирных связей в системе, для обеспечения которого были необходимы кофакторы энергетического обмена — АТФ и КоА [196, 665, 981, 982].

Заключительные реакции биосинтеза триглицеридов, представляющие собой ферментативное ацилирование диглицеридов ацил-КоА-производными жирных кислот, катализируются диглицерид-трансацилазой (ДГ-трансацилазой) или ацил-КоА : диглицерид-ацилтрансферазой [867]. Этот фермент содержится во всех способных к жирообразованию тканях, упомянутых ранее. Специально ДГ-трансацилазную реакцию изучали в слизистой кишечника крысы, печени крысы, молочной железе козы и морской свинки и в печени и жировой ткани цыплят [196, 299, 664, 863, 874, 899, 981, 982].

Для выделения фермента гомогенат ткани в растворе 0,25 М сахарозы-0,01 М 2-меркаптоэтанола разделяли центрифугированием при 700, 10 000 и 80 000 g на фракции ядер, митохондрий и микросом соответственно. Клеточные частицы без потери ДГ-трансацилазной активности сохранялись при —15° и выдерживали многократное замораживание и оттаивание [299, 863, 982]. При отступлении от этой методики происходила инактивация свободных SH-групп ферментного белка, приводящая к разрушению ДГ-трансацилазы или каких-то ее компонентов в бесклеточных препаратах тех тканей, которые (например, слизистая крысы) могли в виде интактных срезов интенсивно синтезировать триглицериды (стр. 228). Накопление диглицеридов в таких инактивированных препаратах в присутствии глицерофосфата или моноглицеридов свидетельствует о том, что ДГ-трансацилаза является особым, самостоятельным ферментом, отличным от МГ-трансацилазы [571].

Раньше считали, что реакция ацилирования диглицеридов свойственна митохондриям, однако сейчас общепризнано, что она связана с микросомами [196, 299, 863, 981, 982]. Так, в печени она обнаруживает ту же внутриклеточную локализацию, что и глюкозо-6-фосфат-фосфатаза (стр. 261) [989]. До сих пор ДГ-трансацилазу не удалось получить в растворенном состоянии [863].

Для определения активности фермента реакционную смесь, содержащую (в мкмолях) С¹⁴-ацил-КоА — 0,1—0,4; цистеин — 8; ионы Mg²⁺ — 5; диглицериды — 1,4; Твин-20 — 2—2,5 мг; белок микросом — 0,25—1,0 мг и трис-буфер, рН 7,4, 100—200 в общем объеме 1 мл инкубировали 1—2 часа при 37° [665, 784, 981, 982]. Реакцию останавливали прибавлением этанола, глицериды раст- <\br> воряли в CCl₄ или в смеси изооктана с изопропанолом (1 : 4) и измеряли их концентрацию и радиоактивность после многократной очистки от примесей ацил-КоА-производных и свободных кислот с помощью раствора NH₃ в 0,2 М КСІ или 0,05 н. раствора NaOH в 50%-ном этаноле [299, 665, 804, 981, 982, 989]. По данным адсорбционной хроматографии, 90—96% меченых липидов реакционной смеси приходилось на долю триглицеридов, причем между включением С¹⁴ и приростом эфирных связей наблюдалось стехиометрическое соотношение [299, 804, 982, 989].

Как показывают данные биосинтеза триглицеридов из D-1-линолео-2-стеарина и 1-С¹⁴-пальмитил-КоА микросомами печени цыпленка, присутствие диглицеридов необходимо для образования триглицеридов [981, 982] (условия инкубации, экстракции, разделения и количественного определения триглицеридов см. стр. 274).

Для сравнения действия фермента на диглицериды разного жирнокислотного состава степень дисперсности этих субстратов в водной среде должна быть одинаковой [449]. Для эмульгирования диглицериды перемешивали или обрабатывали ультразвуком в 0,5—1,0%-ном растворе Твин-20 в течение 20 мин. [665, 982], или же растворяли их в этаноле и быстро смешивали с реакционной средой [299]. Величина частиц полученных эмульсий составляла 1—5 мк [665].

В первые 15—40 мин. инкубации скорость включения пальмитил-КоА в триглицериды была постоянной. Оптимальная концентрация ферментного белка для ацилирования диглицеридов различного состава равнялась 0,25 мг, а Км фермента составляла 10⁻⁴ М пальмитил-КоА. Фермент отличался широким оптимумом рН, равным 7—9. Абсолютной потребности реакции в ионах Mg²⁺ или Mn²⁺ не наблюдалось. Возможно, что липидный обмен частично регулировался концентрацией ионов Са²⁺, которые в жировой ткани ингибировали превращение диглицеридов в лецитины, но не влияли на активность ДГ-трансацилазы. Последняя, в отличие от МГ-трансацилазы, тормозилась Твином-80, причем с 1,3-диглицеридами торможение было особенно сильным. Другим ингибитором реакции был 0,03 М фторид натрия [196, 299, 665, 982]. Добавление эмульсии диглицеридов в систему, содержащую микросомы слизистой кишечника, 1-монопальмитин-Н³, и С¹⁴- <\br> пальмитил-КоА, не изменило величину р (стр. 258) образующихся триглицеридов. Следовательно, диглицериды-Н³-С¹⁴, являющиеся промежуточными продуктами этого биосинтеза, не выделялись в реакционную среду, где они смешались бы с немечеными экзогенными диглицеридами, а были прочно связаны с активными центрами микросомных ферментов [55, 449].

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДГ-ТРАНСАЦИЛАЗНОЙ РЕАКЦИИ

Если биосинтез фосфолипидов отличается абсолютной стереоспецифичностью, поскольку лишь Д-диглицериды способны превращаться в лецитины, то в образовании триглицеридов по моноглицеридному пути оптические свойства субстратов не играют никакой роли (стр. 266). В этом отношении синтез триглицеридов из L-глицеро-3-фосфата (см. схему на стр. 254) занимает промежуточное положение. Так, D-1,2-диолеин вдвое превосходил L-1,2-диолеин по ацилакцепторной способности при ацилировании диглицеридов микросомами печени [449, 867, 982].

Положение жирнокислотных остатков диглицеридов по-разному влияет на активность ДГ-трансацилазы в различных тканях. В микросомах жировой ткани и молочной железы 1,3-диглицериды ацилируются в 4—5 раз медленнее, чем 1,2-изомеры, а в микросомах кишечного эпителия крысы оказываются совершенно неспособными к образованию триглицеридов [55, 299, 665].

Однако вывод о том, что лишь 1,2-диглицериды служат предшественниками триглицеридов [299], явился преждевременным, ибо в интактных срезах, нефракционированных гомогенатах тканей и в микросомах слизистой оболочки кишечника хомяка (стр. 267) вторичные ОН-группы 1,3-диглицеридов и первичные ОН-группы 1,2-изомеров этерифицируются с одинаковой скоростью [152, 196, 449, 571].

Замещаются ли 1,3-диглицериды непосредственно, или же до ацилирования они изомеризуются в 1,2-диглицериды? Результаты липазного гидролиза триглицеридов (стр. 230) и опыты с простыми глицериловыми эфирами (стр. 269) свидетельствуют против изомеризации. Однако имеются данные и иного характера (табл. 32). Эти данные показывают, что с увеличением длительности инкубации первые продукты ацилирования 1-моноолеина — 1,3-диглицериды — превращаются в 1,2-изомеры. Добавление олеата, который заметно конкурирует с 1-моноолеином-С¹⁴ за включение в ди- и триглицериды, не останавливает изомеризацию. Возможно, что преобладание остатков ненасыщенных кислот в 2-положении большинства природных триглицеридов связано именно с миграцией ацилов (стр. 165), поскольку ненасыщенные 1,3-диглицериды изомеризуются быстрее насыщенных [874].

Еще одним важным фактором этерификации диглицеридов является их жирнокислотный состав. В ряду насыщенных диглицеридов соединения летучих кислот (до m = 10) уступали по <\br> Таблица 32 Распределение радиоактивности 1-моноолеина-(глицерин-1,3-C¹⁴) в ди- и триглицеридах срезов кишечника крысы (в % от общей радиоактивности липидов; содержание 1-моноолеина — 2 мкмоля [874])

• В систему добавили 4 мкмоля олеата.

ацилакцепторной способности высшим диглицеридам, но, начиная с дилаурина, удлинение цепи диглицеридов обычно снова снижало скорость их ацилирования. Как субстрат ДГ-трансацилазы микросом печени и жировой ткани 1,2-дипальмитин более чем в 10 раз уступал диолеину, а замена в нем даже одного остатка пальмитата олеатом в 1 или 2-положении заметно симулировала активность фермента. Однако это правило не соблюдалось в микросомах молочной железы, где дипальмитин по сродству к ДГ-трансацилазе превосходил диолеин. Наконец, при образовании триглицеридов печени крысы (стр. 214) специфичные к 3-положению ацил-КоА-трансферазы не обнаруживали селективности по отношению к sn-1,2-диглицеридам того или иного жирнокислотного состава, поскольку найденные соотношения концентраций отдельных стереоизомеров (sn-SOO/sn-SOI = sn-SIO/sn-SЛЛ = 1,3), отличающихся друг от друга только природой ацилов (О или Л) в 3-положении, равны между собой, отражая соотношение [О]₃/[Л]₃ = 1,5 в сумме триглицеридов [144, 617, 882]. Поэтому не следует считать, что скорость этерификации диглицеридов полностью определяется большей или меньшей скоростью их эмульгирования (стр. 271), хотя этот фактор как in vitro, так и in vivo играет, несомненно, большую роль в биосинтезе жира [299, 804, 982].

Присоединение третьего ацильного остатка к диглицеридам зависит не только от природы акцептора, но и от природы донора ацилов — ацил-КоА-производных жирных кислот. Так, пальмитил-КоА и олеил-КоА, как правило, реагируют с одним и тем же ферментом с неодинаковой скоростью. При этом олеат обнаруживается в 2-положении образовавшихся триглицеридов [299, 301, 804].

Можно видеть, что субстратная специфичность ДГ-трансацилаз различных тканей по отношению к диглицеридам и ацил-КоА- <\br> производным того или иного жирнокислотного состава достаточно широка. Это обеспечивает синтез свойственных данной ткани триглицеридов из насыщенных и ненасыщенных кислот рациона. Почему же отдельные ткани одного и того же животного или аналогичные ткани разных организмов отличаются друг от друга по триглицеридному составу (стр. 11)? Как было показано выше, это явление может вызываться жирнокислотной специфичностью таких ферментов биосинтеза триглицеридов, как ацил-КоА-синтетаза, ГФ-трансацилаза, Ф-фосфатаза, МГ-трансацилаза и ДГ-трансацилаза. В то же время нельзя исключить влияния и других факторов — видовой принадлежности, условий аэрации в реакционной смеси, ацилтрансферазного действия липазы, миграции ацилов и т. д.

Несходство жирнокислотного состава триглицеридов и фосфолипидов, возникающих из диглицеридов в одной и той же ткани, также бывает обусловлено многими факторами [752]. К числу последних относятся природа ткани (стр. 231) и содержащихся в ней жирных кислот, концентрация ионов Са²⁺ (стр. 275) и др. По жирнокислотной и стереоспецифичности ферменты синтеза лецитинов значительно более специализированы, чем ДГ-трансацилаза. Так, D-1,2-дилаурин в микросомной системе печени быстро превращался в триглицериды, но, в отличие от D-1,2-диолеина, совершенно не образовывал лецитины (стр. 225) [301, 449, 982]. Функциональная неоднородность метаболического резервуара диглицеридов была продемонстрирована в опытах со срезами легочной ткани и кишечника: лецитины не отличались от глицеридов по скорости включения меченого глицерина, но превосходили их в несколько раз по скорости влючения ацетата- и пальмитата-С¹⁴ [215, 615]. Наконец, замена ацил-КоА в системе, содержащей С¹⁴-глицерофосфат, кофактором биосинтеза фосфолипидов — цитидиндифосфатхолином — привела к сильному снижению радиоактивности образовавшихся глицеридов, стимулировав одновременно синтез лецитинов [449, 911].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате многолетних исследований достигнуты значительные успехи в изучении механизма образования природных жиров. При исследовании триглицеридов применяли радиоактивные изотопы, модельные аналоги метаболитов, градиентное центрифугирование, энзимологические методы, поверхностно-активные эмульгаторы, спектрофотометрию, хроматографию, селективный гидролиз липазой, электронную микроскопию и т. д. Все эти методы позволили в значительной степени определить состав, структуру и скорость обновления исходных, промежуточных и конечных продуктов обоих главных путей биосинтеза триглицеридов и показать связь этого процесса с общим обменом ве- <\br> ществ в клетке. Одновременно были установлены кофакторы, ингибиторы, кинетика, внутриклеточное распределение, механизм реакций, а также жирнокислотная, позиционная и стереоспецифичность участвующих в биосинтезе ферментов. Ферментативные реакции с участием липаз, трансацилаз, киназ и фосфатаз идут с высокой скоростью, а сами ферменты, за исключением глицерокиназы, являющейся глобулином, представляют собой липопротеины мембран эндоплазматического ретикулума цитоплазмы. Возможно, что строение ферментных белков или же их локализация в многокомпонентном липопротеиновом комплексе ретикулума зависят от растворимости ацилируемых ими производных глицерина, поскольку эмульгаторы типа Твин-20 тормозят образование триглицеридов по глицерофосфатному пути и в то же время стимулируют этерификацию моноглицеридов. И наконец, при изучении всасывания жиров в слизистом эпителии тонкого кишечника отчетливо выявлено соответствие между физиологическими функциями ткани и биохимическими особенностями обмена триглицеридов в ее клетках.

Несмотря на это, при оценке современного состояния исследований в области биосинтеза триглицеридов становится ясно, что многие коренные проблемы этого раздела биохимии липидов еще ждут своего решения. Из приведенных выше работ по биосинтезу видно, что они почти полностью посвящены животным тканям. Микроорганизмы в этом отношении до сих пор не изучены, а глицеридный обмен растений рассматривался лишь в единичных случаях. Неизвестно, например, что побуждает запасающие ткани масличных семян переходить на определенном этапе созревания к интенсивному накоплению жира. Не исследован и механизм действия генетических факторов, обусловливающих качественные и количественные особенности жирнокислотного состава триглицеридов.

Однако даже картина триглицеридного обмена животных организмов таит в себе еще немало «белых пятен». Среди многих нерешенных вопросов здесь можно упомянуть только важнейшие. Прежде всего, каковы взаимоотношения между синтезом жирных кислот и образованием триглицеридов в живой клетке, являются ли свободные кислоты исходными продуктами последнего? На каких именно участках ретикулума происходят синтетические реакции, какова роль рибосом в этом процессе? Если адсорбированные триглицериды действительно сосредоточены на липопротеиновых мембранах, то в чем состоит механизм их снятия с этих мембран и последующего обособления в виде скоплений «свободного жира»? Какова последовательность образования триглицеридов разного жирнокислотного состава? Как достигается позиционно-статистическое распределение жирных кислот, наблюдаемое в большинстве природных триглицеридов, а также замещение среднего положения последних преимущественно ацилами ненасыщенных кислот? Каково участие глицерокиназного и гликоли- <\br> тического путей в синтезе глицерофосфата in vivo? В какой последовательности происходит его ацилирование при биосинтезе фосфатидных кислот, какова жирнокислотная и позиционная специфичность этой реакции? Почему возникающие при этерификации разнокислотных 1,2-диглицеридов несимметричные триглицериды лишены оптической активности? Ацилируются ли 1,3-диглицериды непосредственно, или же они должны сначала превратиться в 1,2-диглицериды?

Приведенный перечень очередных задач в изучении биосинтеза триглицеридов (конечно, далеко не полный) показывает, что дальнейшее развитие этой проблемы не должно ограничиться накоплением одних только биохимических данных. Лишь сочетание структурных, биохимических, цитологических и генетических исследований может обеспечить успех работы.

Сокращения

Сокращенные обозначения жирных кислот и их ацилов в триглицеридах:

Другие обозначения:

Опечатки и исправления