Vereshchagin1972

III. Биосинтез триглицеридов

Исследование ферментативного механизма, исходных и промежуточных продуктов, энергетики и внутриклеточной локализации биосинтеза триглицеридов имеет большое теоретическое и практическое значение. Поэтому биосинтез нейтральных липидов изучали во многих органах и тканях живых организмов — в печени, слизистой оболочке кишечника, молочной железе, жировой ткани животных, в семенах и иных запасающих органах масличных растений и т. д.

Еще в середине 30-х годов классическими исследованиями Шенхеймера и Риттенберга, в которых применялась дейтерированная вода, было установлено, что в жировой ткани мышей происходят непрерывный синтез и распад запасных триглицеридов, которые, следовательно, находятся в состоянии динамического равновесия [858]. На основе распространенных в то время концепций обратимости гидролитических и синтетических ферментативных реакций синтез триглицеридов пытались представить как их «обращенный» гидролиз, катализируемый одним и тем же ферментом — липазой. В дальнейшем подобные представления потеряли значение, но на смену им до 50-х годов не было предложено никаких новых гипотез образования глицеридов. Только в течение последних 15 лет современные методы хроматографии, радиоактивных изотопов, фракционирования клеточных органоидов и другие позволили начать интенсивные исследования триглицеридов и путей их биосинтеза.

Известно, что меченые предшественники продуктов обмена веществ облегчают изучение биосинтеза, поскольку новообразованные соединения легко отличаются от веществ, содержавшихся в организме до опыта. Однако для успешного проведения изотопных исследований in vivo необходимо поддерживать постоянный обмен веществ, знать заранее распределение предшественников между многими «резервуарами» метаболизма и соблюдать целый ряд других условий опыта. Поэтому предпочитают изучать биосинтез in vitro, где удельную активность окружающей среды <\br> легко поддерживать на определенном уровне и где исключен физиологическое действие регуляторных реакций живого организма. Изложенные принципы и методы позволили довольно быстро установить, что триглицериды, как и другие сложные природные соединения, следуют при своем образовании и распаде по различным путям обмена веществ. Если при ферментативном гидролизе глицерида образуются свободные жирные кислоты и глицерин, то для непосредственного ферментативного синтеза исходного соединения эти продукты сами по себе непригодны. Было показано, что и жирные кислоты, и глицерин перед вовлечением в биосинтетические реакции должны перейти в особое, активированное состояние. Реакции активирования, отдельные элементарные акты этерификации жирных кислот и сам процесс жирообразования в целом осуществляются за счет энергии, запасенной в аденозинтрифосфорной кислоте (АТФ). В животных тканях найдены многочисленные промежуточные продукты биосинтеза: наоборот, в семенах растений синтез и распад триглицеридов не сопровождаются образованием свободных жирных кислот, диглицеридов и других предполагаемых промежуточных веществ, присутствие которых можно было бы легко обнаружить современными методами [481, 484, 492].

В настоящее время вскрыта взаимосвязь биосинтеза триглицеридов и таких процессов, как синтез фосфолипидов [569], углеводный обмен [158] и окислительное фосфорилирование [122]. Показано, что синтез триглицеридов локализован в эндоплазматическом ретикулуме цитоплазмы и отличается жирнокислотной специфичностью. Обнаруженные недавно особенности биосинтеза триглицеридов в жировом теле москитов свидетельствуют о возможной связи жирообразования с генетическим аппаратом клетки. У этих насекомых при выращивании на среде, содержащей глюкозу, способностью к синтезу глицеридов обладают только самки, а самцы не образуют нейтральных липидов даже при обильном углеводном питании [346].

Вопросы, связанные с механизмом образования триглицеридов, ввиду их большой актуальности, обсуждались в ряде статей обзорного характера [20, 31, 36, 155, 344, 409, 449, 565, 566, 569, 710, 713, 828, 867, 977]. Однако и до настоящего времени в литературе отсутствуют работы, целиком посвященные этой важной проблеме. Поэтому здесь сделана попытка отразить современные представления о последовательных этапах отдельных путей биосинтеза триглицеридов в животных и растительных тканях. Изменения глицеридного обмена животных под действием гормонов, а также механизм синтеза насыщенных и ненасыщенных кислот в данной работе не рассматриваются.

ВКЛЮЧЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ГЛИЦЕРИНА В ЖИР ИНТАКТНОЙ ТКАНИ И ИХ АКТИВИРОВАНИЕ

Глава 17. ВКЛЮЧЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ГЛИЦЕРИНА В ТРИГЛИЦЕРИДЫ

ВКЛЮЧЕНИЕ МЕЧЕНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ТРИГЛИЦЕРИДЫ

Обнаружение динамического состояния запасных глицеридов в организме [858] побудило многих исследователей изучить включение меченых и немеченых жирных кислот и глицерина в триглицериды интактных органов и тканей. Работы, которые рассматриваются в данной главе, предшествовали исследованию механизма биосинтеза триглицеридов in vitro на уровне изолированных субклеточных частиц.

Еще в 1880 г. Мунк показал, что свободные алифатические кислоты в слизистой оболочке кишечника собаки превращаются в триглицериды, поступающие затем в лимфу [867]. При инкубации роговицы кролика с олеатом-1-С¹⁴ и глюкозой-С¹⁴ триглицериды синтезировались со скоростью 10 мкмолей/г сырого веса за 48 час., причем олеат включался только в ацильные части молекулы, а глюкоза-С¹⁴, как показано ниже, использовалась почти исключительно для синтеза остатка глицерина [906].

Наряду с радиоактивными изотопами для изучения биосинтеза триглицеридов иногда применяют жирные кислоты необычного состава, например пентадеканоат. После введения этого предшественника в виде свободной кислоты или моноглицерида в молочную железу козы он обнаруживался в большом количестве в составе моно-, ди- и триглицеридов молока [776]. В стенке кишечника крысы и хомяка С¹⁴-жирные кислоты (пальмитиновая и олеиновая) образуют главным образом триглицериды, но в небольшой степени включаются и в диглицериды; синтез радиоактивных моноглицеридов не наблюдается [69, 448, 933].

Условия инкубации ткани с мечеными предшественниками сильно влияют на скорость биосинтеза. Так, ингибиторы аэробного энергетического обмена — цианид, азид и 2,4-динитрофенол (ДНФ) — останавливают включение пальмитата- и стеарата-1-C¹⁴ в триглицериды жировой ткани крысы и жирового тела шелко- <\br> пряда [185, 810, 872, 960]. Эти результаты опровергают прежние утверждения о независимости биосинтеза триглицеридов от состава газовой среды [443]. Интересно, что поглощение ненасыщенной линолевой кислоты-1-C¹⁴ лейкоцитами кролика не нарушается этими дыхательными ядами, но в то же время сильно тормозится ингибиторами анаэробного гликолиза — фторидом и йодацетатом, которые в свою очередь почти не оказывают влияния на скорость превращения насыщенных кислот [262, 810, 872]. В скелетной мышце образование нейтрального жира из пальмитата-1-C¹⁴ усиливается вдвое после добавления глюкозы [31, 142].

При совместной инкубации жирные кислоты могут адсорбироваться на клеточных частицах. Так, митохондрии и микросомы при 0° в отсутствие АТФ избирательно поглощали пальмитат-1-C¹⁴ из его комплекса с сывороточным альбумином. В связывании меченой кислоты труднорастворимыми белками органоидов участвовали конституционные липиды. Возможно, что неметаболитическое поглощение жирных кислот предшествует их этерификации [822].

Ионы калия увеличивают, а ионы натрия снижают общую скорость жирообразования в стенках кишечника и в печени; однако затрагивается не сам синтез триглицеридов непосредственно, а лишь его подготовительные реакции, в которых возникают активированные предшественники этого синтеза [621, 810].

Скорость и направление включения жирной кислоты в триглицериды или другие липиды в значительной степени определяются длиной ее цепи и ненасыщенностью. Уксусная, пропионовая, масляная и стеариновая кислоты-1-C¹⁴ с разной интенсивностью образовывали триглицериды молока в молочной железе коровы [659]. Относительная радиоактивность глицеридов, полученных при всасывании альбуминовых комплексов жирных кислот-1-С¹⁴ срезами кишечника хомяка [293], показана ниже (активность для пальмитата принята за 100). Можно видеть, что скорость включения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот не определяется простыми физическими свойствами жирных кислот, такими, как растворимость или точка плавления, а регулируется ферментативным механизмом ацилирования [293].

Аналогичные результаты были получены при поглощении пальмитиновой, стеариновой, олеиновой и линолевой кислот эпидидимальной жировой тканью крысы [900]. <\br> Различные жирные кислоты включались в 1-, 2- или 3-положение триглицерида по-разному. Олеат-, пальмитат- или стеарат-1-С¹⁴ инкубировали с неразрушенными клетками слизистой оболочки кишечника ягненка или крысы, триглицериды-С¹⁴ выделяли препаративно и расщепляли их в 1,3-положениях липазным гидролизом (стр. 113). Продукты гидролиза выделяли и радиоактивность в 2-положении исходных триглицеридов (х) вычисляли по формуле: x = c — a — √(c — a)² + 4b (a + b + c) / 2 (a + + b + c), где а, b и с — соответственно активность (в имп/мин) СЖК, 2-моноглицеридов и 1,2(2,3)-диглицеридов, возникших при гидролизе. Иногда величину х определяли непосредственно по радиоактивности 2-моноглицеридов: х = 100 b' / 3d', где b' и d' — удельные активности (в имп/мин/мкмоль) 2-моноглицеридов и триглицеридов. Оба способа вычисления дали сходные результаты. Определение включения жирных кислот-1-C¹⁴ в 2-положение триглицеридов клеток слизистой оболочки кишечника ягненка и крысы in vitro в процентах С¹⁴ [348, 349] показало (см. ниже), что пальмитиновая кислота распределяется в глицеридах слизистой статистически, а стеариновая ацилирует главным образом крайние гидроксилы молекулы.

Этерификация олеиновой кислоты отличается видовой специфичностью: если у ягненка эта кислота связывается почти исключительно в 1,3-положениях, то в кишечнике крысы она включается преимущественно в 2-положение триглицеридов [288, 348, 349].

Меченые жирные кислоты обнаруживаются при инкубации не только в триглицеридах, но и в диглицеридах и в фосфолипидах. Преимущественный синтез триглицеридов по сравнению с фосфолипидами наблюдается в слизистой кишечника [215, 810], мышцах [753], лейкоцитах [262] и свежевыделенном молоке [668]. Напротив, в печени и выделенных из нее митохондриях и микросомах радиоактивный пальмитат обычно включается сильнее в фосфолипиды [301, 449]. Природа жирной кислоты также в значительной степени определяет направление синтеза. Ниже показано включение жирных кислот в триглицериды и фосфолипиды тканей крысы.

ВКЛЮЧЕНИЕ МЕЧЕНОГО ГЛИЦЕРИНА И ГЛЮКОЗЫ В ТРИГЛИЦЕРИДЫ

О биосинтезе триглицеридов в интактной ткани можно судить не только по включению в них жирных кислот, но и по включению глицерина. В печени и молочной железе, обладающих активной глицерокиназой (стр. 240), меченый глицерин легко переходил в глицериды [153, 664]. Однако после введения в кишечник глицерина-С¹⁴ или Н³ метка в хиломикронах лимфы почти не обнаруживалась [867]. Возник вопрос, может ли глицерин, освободившийся при гидролизе глицеролипидов в кишечнике, снова использоваться для ресинтеза триглицеридов в слизистой оболочке.

Для решения этого вопроса надосадочную жидкость гомогената слизистой кишечника свиньи инкубировали в системе кофакторов с пальмитатом и фруктозо-1,6-дифосфатом-С¹⁴; к смеси прибавляли эквимолярное количество немеченого глицерина и его производных. Оказалось, что добавка глицерина совершенно не влияла на включение С¹⁴ в спиртовой радикал триглицеридов; в то же время диоксиацетонфосфат и L-глицеро-3-фосфат в 1,5—2 раза снижали активность полученного жира [158]. В дальнейшем, однако, удалось продемонстрировать включение свободного глицерина рациона в глицериды лимфы, причем этот процесс стимулировался жирными кислотами и желчнокислыми солями [867]. В слизистой срезов кишечника крысы до 12% глицерина-1-C¹⁴ переходило без разрыва цепи в состав глицеридов [843]. По-видимому, для окончательного решения вопроса о наличии глицерокиназы в этой ткани необходимы дальнейшие исследования.

Включение активности глюкозы-С¹⁴ в триглицериды наблюдали в эпидидимальной жировой ткани, кишечнике и печени крысы [303, 572, 867], а также в молочной железе [289, 664], причем в последнем случае глюкоза-С¹⁴ более эффективно превращалась в спиртовой радикал глицеридов, чем глицерин-С¹⁴ [664]. Выше уже отмечалось стимулирующее действие глюкозы на синтез гли- <\br> церидов. Наоборот, под влиянием ингибиторов глюкозного обмена (фторида, цианида, иодацетата и 2-дезоксиглюкозы) этерификация жирных кислот в жировой ткани замедлялась, а скорость выделения свободных жирных кислот во внешнюю среду возрастала ([572], см. также стр. 228).

ДИНАМИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ В РАЗЛИЧНЫХ МЕТАБОЛИТИЧЕСКИХ РЕЗЕРВУАРАХ

Возвращаясь к вопросу о подвижном состоянии запасных глицеридов в организме, которое изучалось главным образом в опытах на целом организме или на интактных органах и тканях, следует отметить, что по современным представлениям это состояние поддерживается динамическим равновесием между образованием и гидролизом сложноэфирных связей. По длительности периода полуобновления триглицеридов разные органы и ткани и отдельные органоиды клетки сильно различаются между собой. Путем инкубации ткани крысы с пальмитиновой- и линолевой-1-С¹⁴ кислотами было показано, что в изолированных клеточных частицах жировой ткани и печени этот период не превышал 20—25 мин. [899], а в интактной эпидидимальной жировой ткани in vivo составлял 163—187 дней [900]. По более ранним данным многих исследователей, остатки алифатических кислот в запасных триглицеридах жировой ткани обновлялись наполовину за 9—80 дней в зависимости от режима питания, что свидетельствовало о ее сравнительной метаболической инертности [900].

Скорость обновления глицеридов в этой ткани можно измерить по включению и освобождению меченого глицерина. Использование глицерина или глюкозы в подобных опытах имеет определенные методические преимущества: образовавшийся в процессе гидролиза липидов глицерин не может, в отличие от жирных кислот, реутилизироваться жировой тканью in situ для биосинтеза триглицеридов из-за отсутствия в ней глицерокиназы (см., однако, стр. 240). Применяя глюкозу-С¹⁴ в качестве предшественника спиртового радикала жиров и определяя количество выделенного во внешнюю среду глицерина, установили, что средний период полуобновления триглицеридов в эпидидимальной ткани крысы (согласно уравнению скорости реакции первого порядка) составляет 41 день [303]. Найденная величина несколько ниже полученной в прежних работах [900], где не учитывали возможность вторичной этерификации кислот в жировой ткани.

Неодинаковая скорость обновления триглицеридов разного происхождения свидетельствует о том, что в ткани имеется несколько связанных между собой резервуаров («пулов») жирнокислотного и глицеридного обмена, которые не находятся в равновесии между собой. Такой градиент может долго поддерживаться лишь при том условии, что синтез триглицеридов сосредоточен в небольшом метаболическом резервуаре, содержащем только вы- <\br> сокорадиоактивную фракцию жирных кислот ткани. Поскольку удельная активность этого пула остается неизвестной, истинную скорость биосинтеза глицеридов определить невозможно [960].

Фракционированием гомогената жировой ткани установили, что триглицериды («свободный жир») составляют 85% ее свежего веса [960]. После включения пальмитата-1-C¹⁴ удельная радиоактивность алифатических кислот и глицеридов в клеточных частицах была намного выше, чем в свободном жире; выравнивание активности внутри клеток достигалось только трех- четырехчасовой инкубацией печени или жировой ткани в отсутствие изотопа [899, 960].

Таким образом, в запасающих тканях имеются по меньшей мере два метаболитических резервуара, различающихся по скорости кругооборота триглицеридов, — клеточные частицы и эндоплазматический ретикулум цитоплазменного слоя, с одной стороны, и крупные капли «свободного жира» — с другой [900].

Представление о нескольких пулах обмена липидов в организме подтвердилось при изучении образования триглицеридов в печени и сыворотке крови крысы. Когда меченый пальмитат вводили внутривенно, то радиоактивность триглицеридов в печени достигала максимума через 5 мин., а в сыворотке — лишь через 30 мин. после инъекции; при этом появлению С¹⁴-глицеридов в крови предшествовал 10-минутный лаг-период. Следовательно, источником триглицеридов сыворотки служит один из метаболитических пулов печени, отличающийся большой скоростью обновления. Схема взаимоотношений глицеридов крови и печени показана ниже [79].

Резервуары: А — быстро метящиеся триглицериды клеточных частиц печени; Б — триглицериды сыворотки крови; В — медленно метящиеся триглицериды жировых «депо» печени; а — поступление триглицеридов из сыворотки в печень; б — поступление свободных жирных кислот из сыворотки для синтеза триглицеридов в печени; в — поступление триглицеридов из липидов печени; г — поступление триглицеридов, образованных в резервуаре А, в резервуар В; д — выделение триглицеридов и продуктов их гидролиза и переэтерификации из резервуаров А и В; е — поступление триглицеридов из печени в сыворотку (лаг-период 10 мин.); ж — превращение триглицеридов сыворотки в другие липиды; з — незначительное поступление триглицеридов в резервуар Б при отсутствии жиров в рационе.

Аналогичная модель, отражающая обмен (глицерин-С¹⁴)-триглицеридов, была предложена при исследовании печени и сыворотки человека [271]. <\br> Единый резервуар жирных кислот, обеспечивающий биосинтез липидов нескольких классов, обнаружен до настоящего времени только в одном биологическом объекте. Имеется в виду молочная железа козы, где соотношение стеарата и олеата у всех изученных липидов составляет 1/2 — 1/3. Интересно, что сразу после инъекции пальмитата-1-С¹⁴ в железу наибольшей радиоактивностью обладали эфиры холестерина. Поскольку кислотные остатки этих эфиров включались в триглицериды и фосфолипиды быстрее, чем свободные алифатические кислоты, предположили, что именно эфиры холестерина служат предшественниками и переносчиками жирных кислот при биосинтезе глицеролипидов молочного жира [774].

При голодании крыс, получавших пальмитат-С¹⁴, содержание глицеридов в жировой ткани снижается, а удельная радиоактивность этих соединений не меняется. Отсюда ясно, что новообразованные триглицериды не откладываются концентрическими слоями на периферии этой ткани, как думали прежде, а равномерно перемешиваются с предсуществующим свободным жиром [894]. В то же время разные жирные кислоты включались в глицериды той или иной степени ненасыщенности с различной скоростью. После инкубации пальмитиновой кислоты-1-С¹⁴ с эпидидимальной тканью крысы удельная активность пальмитата в насыщенных триглицеридах была в четыре раза выше, чем в ненасыщенной фракции. В опытах in vivo такое соотношение С¹⁴ сохранялось в течение двух недель. Можно сделать вывод о том, что близкое к статистическому распределение остатков жирных кислот в триглицеридах некоторых природных жиров, по-видимому, не обусловлено быстрой интенсивной переэтерификацией вновь синтезированных глицеридов [388].

В начале раздела уже отмечалось, что инкубация смеси триглицеридов и С¹⁴-жирных кислот in vitro с липазой поджелудочной железы не увеличивает общего содержания сложноэфирных связей. Однако благодаря ацилтрансферазным обменным реакциям, которые тоже катализируются липазой (стр. 113), меченые жирные кислоты включаются в небольшой степени в крайние положения триглицеридов, что приводит к частичному обновлению жирнокислотного состава последних [60, 61, 115, 873].

В настоящее время можно представить следующую примерную схему образования триглицеридов интактных запасающих тканей. Свободные жирные кислоты неферментативно адсорбируются клеточными структурами, а затем переходят в активированное состояние при участии АТФ. Путем этерификации активные производные образуют глицериды и фосфолипиды. Свободный глицерин включается в сложные эфиры лишь в присутствии глицерокиназы.

По мере образования триглицериды мигрируют с поверхности клеточных частиц и поглощаются каплями «свободного жира», более инертными в метаболическом отношении. Частицы и «сво- <\br> бодный жир» представляют собой отдельные резервуары, или пулы глицеридного обмена, и отличаются друг от друга по длительности периода полуобновления триглицеридов. В «свободном жире» новообразованные триглицериды быстро перемешиваются; однако во включении различных жирных кислот в триглицеридные фракции разной насыщенности имеется известная специфичность.

Глава 18. АКТИВИРОВАНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

СУБКЛЕТОЧНАЯ СИСТЕМА АКТИВИРОВАНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

После того как было обнаружено включение жирных кислот в триглицериды ряда органов и тканей, механизм отдельных этапов этого процесса стали изучать на субклеточном уровне. Оказалось, что для биосинтеза глицеридов в гомогенатах и клеточных частицах необходимы кофакторы — АТФ, кофермент ацетилирования (КоА) и ионы Mg²⁺ [587, 868]. Отсюда следует, что жирные кислоты, по-видимому, участвуют в биосинтетических процессах в виде ацил-КоА-производных. Таким образом, образование этих производных можно считать первым этапом построения триглицеридов.

Ферменты активирования жирных кислот получили название тиокиназ, ацил-КоА-синтетаз, или, по новой классификации, жирная кислота : КоА-лигаз (АМФ), КФ 6.2.1.2 или КФ. 6.2.1.3 [96].

Образование ацил-КоА-производных из жирных кислот и КоА было обнаружено в субклеточных системах печени морской свинки [587], слизистой кишечника крысы и свиньи [53, 56, 868, 869] и жировой ткани крысы [827]. Для выделения ацил-КоА-синтетазы ткани гомогенизировали в 0,25 М растворе сахарозы, 0,2 М растворе фосфатного буфера, рН 7,4, или растворе 0,28 М маннита-0,01 М фосфатного буфера, рН 7,5 [53, 56, 587, 827, 868]. Центрифугированием гомогената получали фракции ядер и «свободного жира» (450—500g, 10 мин.), митохондрий (2500—4500g, 20 мин.) и микросом (7800—110000g, 30—60 мин.). Многократным замораживанием и оттаиванием суспензии клеточных частиц печени часть фермента можно было перевести в растворимую форму, причем активность фермента составляла 25% от исходной. Иногда микросомы отделяли в подкисленной среде, рН 5,8. Лиофилизированные препараты каждой фракции сохраняли на холоду [53, 58, 587, 827, 863].

Чистоту препарата митохондрий определяли по активности в нем щелочной β-глицерофосфатазы, которая обычно свойственна микросомам, а загрязнение микросом митохондриями — по активности цитохромоксидазы в препарате микросом. Микросомы отличались также от других фракций высоким содержанием РНК <\br> Таблица 26 Биосинтез пальмитил-КоА в субклеточных фракциях слизистой тонкого кишечника крысы [868]

и активностью НАД-Н-цитохром с-редуктазы ([53, 868, 869] (стр. 261).

В табл. 26 показано распределение активности ацил-КоА-синтетазы в субклеточных фракциях слизистой тонкого кишечника крысы [868]. Полученные данные и результаты других работ [409, 587, 827, 867, 869] однозначно свидетельствуют о том, что образование ацил-КоА-производных связано с микросомами, представляющими собой продукты разрыва мембран ретикулума (стр. 248). В других фракциях активность фермента тесно коррелирует с активностью щелочной фосфатазы [53, 868]. Таким образом, современные представления о внутриклеточной локализации ацил-КоА-синтетазы отличаются от старой концепции [587], согласно которой в митохондриях, микросомах и надосадочной жидкости гомогената печени активирование жирных кислот осуществляется с одинаковой скоростью ([867, 868], см. также стр. 247).

Активность ацил-КоА-синтетазы определяли в присутствии кофакторов (примерный состав среды показан ниже) [53, 56, 587, 827, 868], и выражали количеством моногидроксамовых производных жирных кислот (моноацилпроизводных гидроксиламина).

Если превращение сложных эфиров высших алифатических кислот в гидроксамовые кислоты требует высокой температуры и присутствия концентрированной щелочи, то гидраксиламино- <\br> лиз ацил-КоА-производных, представляющих собой тиоэфиры КоА с макроэргической связью, легко осуществляется при обычных условиях инкубации фермента — рН 7,4—8,3 и 37°: RCH₂CO ~ SKoA + NH₂OH → RCH₂CONHOH + HSKoA. После 30—60 мин. инкубации при 37—40° ферментативную реакцию останавливали прибавлением к смеси хлорной кислоты, гидроксаматы высших жирных кислот извлекали этанолом и колориметрировали в виде комплексов с ионами Fe³⁺ при 520 нм; молярная экстинкция составляла 1,28×10³ [56, 868]. Образование ацил-КоА-производных при активировании жирных кислот было подтверждено непосредственным выделением и идентификацией самих производных и полученных из них ацил-гидроксаматов соответствующих кислот [56, 587, 868].

МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ АКТИВИРОВАНИЯ И СВОЙСТВА АЦИЛ-КоА-СИНТЕТАЗ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ

Потребность системы в АТФ, КоА и Mg²⁺ позволяет заключить, что по механизму реакция активирования высших алифатических жирных кислот сходна с исследованной ранее [713] реакцией активирования ацетата. Реакция обратима и идет с участием ионов Mg²⁺, связывающих фосфатные группы ацил-аденилатного комплекса [867].

CH₃(CH₂)₁₄C—OH + HSKoA + аденозил—O—P—O—P—O—P—O⁻ → (фермент-Мg²⁺-АМФ-ацил)-комплекс + HS KOA ↔ CH₃(CH₂)₁₄C—S—KoA + аденозилмонофосфат (АМФ) + ⁻О—Р—О—Р—О⁻

В течение первых 30 мин. инкубации наблюдается линейный рост концентрации ацил-КоА в системе, а затем синтез приостанавливается из-за термолабильности фермента in vitro при 37° [53, 56]. В печени на 1 моль АТФ образуется 1 моль пальмитилгидроксамата; в присутствии избытка АТФ и фермента пальмитат полностью превращается в пальмитил-КоА. Таким образом, реакция ацил-КоА-синтетазы является здесь стехиометрической [587]. В слизистой кишечника такой стехиометричности не наблюдалось даже при повышенных концентрациях фторида, тормозящего эндогенную АТФ-азу, а добавленный пальмитат переходил в ацил-КоА только на 25% [56]. <\br> Образование ацил-КоА-производных обнаруживает линейную зависимость от содержания АТФ и КоА. Как показывают данные (стр. 236), АТФ необходим для синтеза ацил-КоА в субстратных, а КоА — в каталитических количествах. Однако исключение из среды любого из этих кофакторов в одинаковой степени снижает скорость реакции. Увеличение концентрации белка микросом до 3 мг также усиливает активирование жирных кислот; дальнейший рост содержания фермента приводит к торможению [53, 56]. У крысы оптимум рН фермента кишечника составлял 6,8—7,8 [868], а у свиньи — 8,3 [56]. Активность тормозилась трипсином [587] и таурохолеатом [868], а также исключением из среды цистеина и глутатиона-SH [55]. Добавление ДНФ к митохондриям печени крысы из-за активирования АТФ-азы снимало образование ацил-КоА, зависимое от АТФ. После прибавления ингибитора индуцированной АТФ-азы — олигомицина — синтез ацил-КоА восстанавливался [96].

Ацил-КоА-синтетаза исследованных тканей специфична для насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с m ≥ 8 [56, 449, 587, 867]. Такая специфичность хорошо согласуется с тем, что глицериды, которые запасаются или секретируются этими тканями, содержат только высшие жирные кислоты [56, 449]. Максимальная активность в печени морской свинки и в слизистой кишечника свиньи проявлялась по отношению к лауриновой, а в жировой ткани и слизистой крыс — к пальмитиновой кислотам [56, 587, 827, 868]. Ненасыщенные кислоты также образовывали ацил-КоА-производные, причем в кишечнике свиньи пальмитат и олеат активировались с одинаковой скоростью. В то же время высокие концентрации свободного линолеата и линолената несколько тормозили ацил-КоА-синтетазу [56, 587, 827, 868]. Следовательно, активирование разнообразных жирных кислот происходит с различной скоростью.

В слизистой кишечника свиньи кроме ацил-КоА-синтетазы, описанной выше, была обнаружена другая ферментная система, которая медленно образовывала олеил- и пальмитил-гидроксаматы в нейтральной среде при полном отсутствии кофакторов. Эта активность, связанная с переносом остатков жирных кислот ферментами типа эстераз, имела оптимум рН 7,0—7,5 и была более устойчива к температуре. Неизвестно, участвует ли независимая от кофакторов система переноса ацилов в биосинтезе глицеридов ([56], см. также стр. 234).

Таким образом, в печени, жировой ткани и слизистой кишечника имеются ацил-КоА-синтетазы, способные активировать именно те жирные кислоты, которые обычно встречаются в синтезируемых этими тканями триглицеридах. Ацил-КоА-производные с длинной цепью образуются за счет энергии АТФ и по активности в реакции этерификации превосходят исходные кислоты. Кроме того, благодаря содержанию многочисленных полярных групп в остатке КоА эти производные, в отличие от кислот, становятся во- <\br> дорастворимыми при нейтральном рН, что значительно облегчает их участие в реакциях ацилирования на дальнейших этапах биосинтеза триглицеридов. Ниже представлена структурная диаграмма пальмитил-КоА [867]. Показан значительный объем водорастворимого полярного остатка КоА по сравнению с неполярным углеводородным «хвостом» остатка жирной кислоты.

где: C ~ S — макроэргическая тиоэфирная связь.

Глава 19. АКТИВИРОВАНИЕ ГЛИЦЕРИНА

СУБКЛЕТОЧНАЯ СИСТЕМА АКТИВИРОВАНИЯ ГЛИЦЕРИНА

Описанные выше опыты с целыми тканями или их срезами показали, что глицерин включается в спиртовой радикал глицеролипидов только после предварительного активирования. Сначала считали, что единственным путем образования активированной формы глицерина и его аналогов служит анаэробный гликолиз. Затем было показано, что свободный глицерин может активироваться непосредственно под действием глицерокиназы. Это способствовало появлению многочисленных исследований, посвященных локализации, механизму действия и свойствам связанной с липогенезом ферментной системы активирования самого глицерина.

Глицерокиназа [153], или АТФ : глицерин-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.30, катализирует стереоспецифическое фосфорилирование глицерина с образованием L-глицеро-3-фосфата (ниже этот изомер обозначается «глицерофосфат») [331, 867]. Этот фермент <\br> довольно широко распространен у животных, растений и микроорганизмов; он обнаружен в печени крысы, голубя и курицы [44, 153, 897, 988], молочной железе морской свинки [664], почках крысы [988], проростках клещевины [1003], межплоднике авокадо [91], а также в адаптированных к глицерину клетках Oospora lactis и Candida mycoderma [155, 988].

До сих пор окончательно не установлено, содержится ли глицерокиназа в слизистой кишечника (стр. 231). Вначале глицерокиназа не была обнаружена [158, 988], возможно из-за наличия в слизистой фосфатазы [867]. В дальнейшем путем фракционирования растворимых белков гомогената сульфатом аммония удалось убедительно продемонстрировать глицерокиназную активность в слизистой кишечника кошки, крысы и хомяка [197, 331]. Играет ли эта глицерокиназа сколько-нибудь существенную роль в процессе всасывания жиров в кишечнике? Для ответа на этот вопрос необходимо будет определить, в какой мере глицерофосфат, образованный глицерокиназой, и глицерофосфат, возникший в гликолитических реакциях, участвуют в синтезе глицеридов из продуктов их гидролиза.

В аорте кролика и собаки [899] и в листьях шпината [184] глицерокиназа отсутствует. Большинство исследователей считают, что этот фермент не содержится и в жировой ткани [685, 988]. Однако при инкубации жировых клеток эпидидимальной ткани крысы в присутствии высоких концентраций глицерина-С¹⁴ было обнаружено включение С¹⁴ в спиртовой радикал триглицеридов [403а]. По-видимому, для окончательного решения этого вопроса нужны дальнейшие исследования.

Для препаративного получения фермента ткани гомогенизировали на холоду (табл. 27). Клеточные частицы осаждали часовым нагреванием гомогената [155], подкислением среды [567] или центрифугированием при 78—144 тыс. g [91, 331, 664]. Надоса-

Таблица 27 Условия получения гомогената ткани для препаративного выделения глицерокиназы

Таблица 28 Очистка глицерокиназы печени голубя [988]

Аналогичным путем из адаптированных клеток С. mycoderma получили фермент с высоким выходом (35%) и высокой активностью (165 000 ед/мг) [155]. Глицерокиназу проростков клещевины при помощи фракционирования сульфатом аммония удалось очистить в 86 раз [1003].

Определение удельной активности фермента основано на сочетании глицерокиназной реакции с действием L-глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы (фермента Барановского, КФ 1.1.1.8):

L-глицеро-3-фосфат + НАД⁺ ↔ диоксиацетон (ДОА)-фосфат + НАД·Н + Н⁺ ↓ комплекс с гидразином

Если проводить определение в щелочной среде, а образующийся ДОА-фосфат сразу же связывать гидразином, то реакция идет только в сторону восстановления НАД. Количество НАД·Н, эквивалентное концентрации глицерофосфата, измеряли спектрофо- <\br> тометрически. Реакционная смесь содержала MgCl₂-гидразин-глициновый буфер, рН 9,8, а также избыток глицерина, НАД·Н, АТФ и фермента Барановского. За единицу активности принимали количество фермента, увеличивающее оптическую плотность D при 340 нм в среде определенного состава при 25° со скоростью 0,001 ед/мин в течение первых 2 мин. инкубации [155, 331, 664].

В неочищенных ферментных препаратах молочной железы спектрофотометрическое определение глицерокиназы было невозможно из-за быстрого восстановления НАД в контрольном опыте. Для снижения D в контроле препарат очищали от глицерина; скорость реакции можно было определить радиохроматографически по включению глицерина-С¹⁴ в глицерофосфат [91, 331, 664].

Практически вся глицерокиназа межплодника авокадо, слизистой кишечника, молочной железы и других тканей была сосредоточена в надосадочной жидкости после отделения микросом (стр. 235) [91, 331, 664]. Так, в плодах авокадо включение добавленного глицерина-С¹⁴ в глицерофосфат составляло в надосадочной жидкости 14%, а в микросомах — не более 0,6% [91]. Аналогичная картина распределения наблюдалась и в гомогенате молочной железы морской свинки [664]:

Активирование глицерина изучали в системе, содержащей (в мкмолях/мл) АТФ — 6—15, глицерин — 1—30, MgCl₂ — 1—6, а также фермент и К-фосфатный буфер, рН 7,4, 25—50 (его можно заменить трис-буфером, рН 7,4—9,0; 30—170, или глициновым буфером, рН 9,4; 33). Иногда добавляли цистеин или меркаптопропанол 10—25, фторид Na или К 8—40 и фосфокреатин 3. Через 30—180 мин. при 37° реакцию останавливали добавлением 0,2 моля метафосфорной или хлорной кислоты и возникший глицерофосфат определяли, как описано выше [91, 153, 154, 331, 664].

Для хроматографической идентификации L-глицеро-3-фосфата как продукта глицерокиназной реакции депротеинизированную надосадочную жидкость реакционной смеси пропускали через катионит Дауэкс-50 (Н⁺), а затем через анионит Амберлит ІН-4В (ОН⁻). Глицерофосфат, поглощенный анионитом, элюировали 1М раствором NН₄ОН и идентифицировали хроматографией на бумаге в трех системах растворителей: этанол — 1M NaOH (3 : 1), этанол или этилацетат — уксусная кислота — вода (3 : 3 : 1), метилэтилкетон — метилцеллозольв — АНОН — вода (7 : 2 : 0,7 : 2, 3). Если субстратом реакции был глицерин-С¹⁴, то единственным радиоактивным фосфорным эфиром на хроматограмме был L-глицеро-3-фосфат [91, 331, 664].

МЕХАНИЗМ ГЛИЦЕРОКИНАЗНОЙ РЕАКЦИИ И СВОЙСТВА ГЛИЦЕРОКИНАЗ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ

Глицерокиназа катализирует реакцию фосфорилирования [153, 567, 988, 1003]: глицерин + АТФ ↔ L-глицеро-3-фосфат + аденозиндифосфат (АДФ). Возникающий глицеро-3-фосфат принадлежит к L-ряду — следовательно, фосфорилирование является стереоспецифическим [154, 567, 1003] и тем самым определяет окончательную пространственную конфигурацию липидов (стр. 122) — производных L-глицеро-3-фосфата [713]. Таким образом, глицерин фосфорилируется асимметрически (в противном случае фермент не различал бы 1-ОН- и 3-ОН-группы глицерина и наблюдалось бы образование смеси D- и L-форм глицерофосфата). Для проверки этого утверждения глицерин-1-C¹⁴, полученный биосинтетически, действием глицерокиназы печени превращали в его фосфат, который расщепляли затем на отдельные С-атомы периодатным окислением. Поскольку на С-1 глицеро-3-фосфата приходилось 83% всей активности молекулы, был сделан вывод, что глицерокиназа стереоспецифически фосфорилирует глицерин по С-3. Глицерокиназную реакцию можно считать первым шагом асимметрического обмена глицерина в ткани [154].

Между исчезновением кислотолабильного фосфата и образованием глицерофосфата в реакционной смеси наблюдалось стехиометрическое соотношение, соответствующее уравнению реакции [153, 1003]. Количество глицерофосфата в среде находилось в линейной зависимости от концентрации глицерина, фермента и времени инкубации [331, 664, 988]. Для фермента дрожжей при 37° число кругооборотов составило 10⁵ молей фосфорилированного глицерина в мин. на 251000 г белка [155]. Скорость биосинтеза глицерофосфата у животных достигала 16—18 молей/час г, что вполне обеспечивало потребность организма в субстрате для синтеза спиртового радикала глицеридов [664, 988]. Константы Михаэлиса (Км) ферментов различного происхождения (табл. 29) были достаточно близки между собой.

Таблица 29 Величина констант Михаэлиса глицерокиназ различного происхождения

Молекулярный вес фермента дрожжей составляет 251 тыс., изоэлектрическая точка (ИЭТ)=4,6. Фермент печени, судя по его нерастворимости в воде, представляет собой глобулин. Он наиболее стабилен в кислой среде (рН 4,5—6,7), содержащей глицерин и ЭДТА. По устойчивости к изменениям температуры глицерокиназа превосходит другие киназы. При определенных условиях она выдерживает нагревание до 70—80°, замораживание и оттаивание, глубокое охлаждение и лиофилизацию. Частичная инактивация фермента на холоду снимается цистеином или глютатионом. Кристаллы дрожжевой глицерокиназы устойчивы в виде суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония [153, 197, 988].

Глицерокиназа действует лишь в присутствии АТФ и Mg²⁺, который можно заменить ионами Mn²⁺ [153, 155]. Для максимальной активности необходим цистеин, который можно заменить меркаптоэтанолом, тиогликолевой кислотой, сульфидом Na и т. д. Ингибиторы SH-групп — иодацетамид и n-хлорртутьбензосульфонат — тормозят ферментативную активность [153, 155, 664]. Оптимум рН фермента печени и слизистой кишечника составляет соответственно 9,8 и 9,4, а глицерокиназы проростков клещевины — 8,5 [155, 331, 1003]. Один и тот же фермент катализирует фосфорилирование глицерина, ДОА и глицеринового альдегида [153, 988, 1003].

Таким образом, несмотря на определенные различия в действии глицерокиназы в зависимости от источника выделения, ферменты животных, растений и микроорганизмов (возможно, изозимы глицерокиназы) в общем довольно сходны по оптимуму рН, термостойкости, Км, потребности в кофакторах, внутриклеточной локализации, устойчивости в кислой среде и т. д. [331, 664, 988]. Возможно, что это сходство отражает одинаковую физиологическую роль глицерокиназы, которая заключается в активировании глицерина, используемого затем для биосинтеза глицеролипидов. В исследованных тканях глицерокиназная реакция покрывает потребность липогенеза в глицерофосфате. Так, в молочной железе глицерин-С¹⁴ включается в глицерофосфат в 10 раз быстрее, чем в глицериды [664].

ОБРАЗОВАНИЕ ГЛИЦЕРОФОСФАТА ИЗ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ГЛИКОЛИЗА

В жировой ткани для построения спиртового радикала глицеридов служит L-глицеро-3-фосфат, образующийся из продуктов гликолиза при стереоспецифическом восстановлении ДОА-фосфата под действием фермента Барановского [567, 713]. В гомогена- <\br> те эпидидимальной ткани (ткани придатков семенников) фруктозо-1,6-дифосфат, глюкозо-6-фосфат, 3-фосфоглицериновый альдегид и ДОА-фосфат могли в присутствии НАД·Н превращаться в глицерофосфат. В случае глюкозо-6-фосфата кроме НАД·Н требовался АТФ или глицериновый альдегид, который в результате трансальдолазной реакции переходил в 3-фосфоглицериновый альдегид:

глюкозо-6-фосфат ↔ фруктозо-6-фосфат + D-глицериновый альдегид ↔ 3-фосфоглицериновый альдегид + D-фруктоза.

Образование глицерофосфата из промежуточных продуктов гликолиза было сосредоточено в надосадочной жидкости гомогената, полученной осаждением микросом [685].

В настоящее время еще трудно судить, какой путь образования глицерофосфата — глицерокиназный или гликолитический — имеет большее значение для синтеза глицеридов in vivo. Тем не менее очевидно, что обмен глицерина как одно из связующих звеньев между углеводным и жировым обменом ткани играет значительную роль в липогенезе, обеспечивая для него субстрат и определяя направление и специфику последующих этапов этого процесса.

БИОСИНТЕЗ ГЛИЦЕРИДОВ В СУБКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ НА ОСНОВЕ ГЛИЦЕРОФОСФАТА И ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ЭТОГО ПРОЦЕССА

Глава 20. БИОСИНТЕЗ ГЛИЦЕРИДОВ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ ГЛИЦЕРОФОСФАТА

РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГФ-ТРАНСАЦИЛАЗЫ

Первая попытка изучения синтеза липидов в субклеточной системе относится к 1883 г. Инкубация глицерина и калиевых солей высших жирных кислот с экстрактом слизистой кишечника собаки привела к образованию сложноэфирных связей [270]. Сейчас, когда исследовано включение меченых кислот и глицерина в глицериды неразрушенных тканей (стр. 234), можно считать, что процесс in vivo представляет собой ферментативную этерификацию.

По современным данным, для биосинтеза глицеридов в гомогенате и его фракциях необходимо сочетание многих кофакторов — КоА, АТФ, Mg²⁺, глицерофосфата, глутатиона и других, образующих систему трансацилирования между алифатическими тиоэфирами <\br> КоА и теми или иными акцепторами ацилов. Помимо включения меченых предшественников в нейтральные липиды в бесклеточном ферментном препарате удается обнаружить и довольно значительный прирост общего содержания глицеролипидов.

Превращение глицерофосфата и активированных жирных кислот в глицериды осуществляется ацил-КоА : L-глицеро-3-фосфат-ацилтрансферазой (ГФ-трансацилазой), КФ 2.3.1.15 [123], содержащейся в бесклеточных препаратах диафрагмы [751], аорты [901], слизистой кишечника [404, 408, 409], печени [36, 123, 896—898, 902, 934, 945—947], почек [36, 405], эпидидимальной жировой ткани [31, 827, 903, 904], молочной железы [247, 665, 804], межплодника авокадо [91] и листьев шпината [184].

Активность ГФ-трансацилазы определяли различными путями. Один метод — измерение уровня глицеридов в смеси гидроксамовым методом (стр. 237). Другой, спектрофотометрический метод основан на количественном определении свободного КоА при ацилировании в простой системе, содержащей (в мкмолях) пальмитил-КоА—0,05, глицерофосфат — 5, глутатион — 1 и глицилглициновый буфер, рН 7,5—5, в общем объеме 0,1 мл. Через 15 мин. белок и пальмитил-КоА осаждали 3%-ной хлорной кислотой, а затем учитывали D кислотного экстракта при 260 нм. По чувствительности данная реакция была в 10 раз выше гидроксамовой. Благодаря нейтральной среде удалось подавить образование КоА за счет гидролитического деацилирования тиоэфиров [827, 892]. Если перед инкубацией добавить 4 мг сывороточного альбумина, который связывает возникающие при гидролизе ацил-КоА свободные кислоты (стр. 252), то для работы можно использовать кислую среду, рН 6,5, и трансацилазная реакция значительно активируется. Образование КоА и включение глицерофосфата-С¹⁴ в липиды в микросомах печени морской свинки (в мкмолях) [123] равно соответственно для реакции с альбумином 74 и 59, а в опыте без альбумина — 3 и 5. Этот метод особенно применим для определения фермента в органоидах с сильным гидролитическим действием, например в митохондриях [123].

Для радиохроматографической оценки активности фермента глицериды экстрагировали из реакционной смеси этанолом с эфиром (3 : 1) [902, 934], ацетоном, эфиром и петролейным эфиром [196], а также смесями хлороформа с метанолом 2 : 1 [751], изопропанола, изооктана и серной кислоты (40 : 10 : 1) [904] или гептана, изопропанола, воды и н. NaOH (40 : 40 : 30 : 1) [665]. Эфирную фазу очищали водной щелочью от свободных жирных кислот и частично — от моноглицеридов и фосфолипидов [665, 904]. Глицериды выделяли препаративной адсорбционной хроматографией на колонке [91, 196, 904], на бумаге, пропитанной адсорбентом [904], или в тонком слое [665]. Радиоактивность определяли на сцинтилляционном спектрометре, а молярную концентрацию — гидроксамовым методом. Затем вычисляли удельную радиоактивность [91, 194, 196, 407, 665, 904]. Процент включения меченого <\br> предшественника в глицериды (І) рассчитывали по формуле I = 100A/MА', где А — удельная активность глицеридов, М и А' — количество и удельная активность предшественника [804] (см. также стр. 265).

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГФ-ТРАНСАЦИЛАЗЫ И ФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА БИОСИНТЕЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Действие ГФ-трансацилазы было прежде всего изучено в гомогенатах ряда тканей (стр. 246). Гомогенат получали обычными способами (стр. 241 и табл. 27). «Свободный жир», ядра и обломки клеток отделяли кратковременным центрифугированием при 500—1000 g. При дальнейшем фракционировании было установлено, что активность фермента связана со структурными элементами клетки [247, 405, 664, 901, 934]. Так, в митохондриальных препаратах печени даже после экстрагирования многократным замораживанием и оттаиванием почти 70% белка вся оставшаяся ГФ-трансацилазная активность сохранялась в нерастворившихся субъединицах клеточных структур [36, 863]. После разделения клеточных частиц определяли однородность полученных фракций митохондрий и микросом [409, 751]. Иногда для максимальной активности ГФ-трансацилазы помимо клеточных частиц требовалось небольшое количество надосадочной жидкости гомогената, служившей источником глицерокиназы или просто структурного белка [247, 934] (см. также стр. 252).

Изучению внутриклеточной локализации ГФ-трансацилазной активности были посвящены многолетние работы лаборатории Шапиро с печенью крысы и лаборатории Хюбшера со слизистой оболочкой кишечника и другими тканями. Ранние исследования по фракционированию гомогената печени привели авторов к выводу, что биосинтез глицеридов осуществляется в митохондриях, полученных центрифугированием при 11 000 об/мин (система 1). Образование глицеридов в этом препарате требовало кроме АТФ и Mg²⁺ добавления 0,2 части нативной надосадочной жидкости (микросом) и 3 частей кипяченой надосадочной жидкости, которую можно было заменить КоА и небольшим количеством глицерофосфата [896, 902, 934, 945]. Однако позже было показано, что ГФ-трансацилазную активность, нуждающуюся для включения жирных кислот в глицериды в АТФ, КоА, Mg²⁺ и 5—10-кратном по сравнению с системой 1 количестве глицерофосфата, можно выделить из нативной надосадочной жидкости при 40 000 об/мин или подкислением уксусной кислотой до рН 5,8 (система 2) [896]. Среди продуктов биосинтеза в системе 1 преобладали триглицериды, а в системе 2 — ди- и моноглицериды [902]. После отделения микросом (система 2) гомогенат уже не содержал ГФ-трансацилазу [405, 897, 947]. На основе полученных данных возникло представление о двух независимых системах синтеза глицеридов в печени — митохондриальной и микросомной, которые различаются <\br> по механизму действия [896, 902]. Однако в последней работе этой лаборатории уже не упоминается система 1, а о микросомах говорится как о единственном средоточии образования глицеридов в гомогенате [946].

Сначала считали, что и в слизистой кишечника синтез глицеридов происходит в митохондриях [36, 194, 196], но в дальнейшем выяснилось, что ГФ-трансацилазная активность этой ткани на 70—80% локализована в микросомах [408]. Опыты с молочной железой крысы дали аналогичный результат [247]. В своем обзоре Хюбшер подробно обсуждает вопрос о месте образования глицеридов в гомогенате слизистой и приходит к выводу, что этот процесс протекает главным образом в микросомах. Оптимальный биосинтез требует прибавления термолабильного недиализуемого фактора белковой природы, осаждаемого сульфатом аммония из бесструктурной надосадочной жидкости, т. е. глицерокиназы [409]. Ниже показано влияние центрифугирования в градиенте плотности (ЦГП) на глицерофосфатный путь синтеза нейтральных липидов во фракции митохондрий листьев шпината [184].

Можно видеть, что в результате длительных исследований двух лабораторий прежние представления об исключительном значении митохондрий в биосинтезе триглицеридов были пересмотрены. По-видимому, в ранних работах обнаружение ГФ-трансацилазной активности во фракции митохондрий было связано с загрязнением этой фракции микросомами [751]. Митохондриальные препараты растительных тканей удалось очистить от такой примеси центрифугированием в градиенте плотности (ЦГП) (см. выше). Сходные результаты были получены в опытах с межплодником авокадо [91]. Таким образом, ГФ-трансацилазная активность тканевого гомогената связана с микросомами ¹, в которых и обнаруживаются образованные ферментом глицериды [408, 665, 751, 946]. Возникает вопрос, какой морфологической структуре живой клетки соответствуют микросомы. В настоящее время микросомы считают обломками липопротеиновых мембран эндоплазматического ретикулума клетки, на поверхности которых укрепле-

¹ Недавно было показано, что одна из реакций глицерофосфатного пути биосинтеза триглицеридов — ацилирование лизофосфатидных кислот с образованием фосфатидных кислот (стр. 256) — осуществляется как в микросомах, так и во фракции внешних мембран митохондрий, выделенных после разрушения этих органоидов [842а]. <\br> ны рибосомы (стр. 236 и 265). В то же время нельзя исключить возможности образования части микросом из гладких мембран аппарата Гольджи [91, 409].

Ниже представлены в обобщенном виде условия инкубации и примерный состав бесклеточной ферментной системы биосинтеза глицеридов.

Как и в случае ацил-КоА-синтетазы, источник энергии (АТФ) был необходим для реакции в субстратных, а кофактор активирования жирных кислот (КоА) — в каталитических количествах [196, 751]. Глутатион-SH можно было заменить цистеином или этилмеркаптаном, фторид — ингибитор АТФ-азы — ионами Ni²⁺, жирную кислоту — КоА- ацил-КоА-производными, а фосфатный буфер — трис-буфером, рН 7,4—8 [31, 184, 196, 665, 751, 904].

Для разделения, идентификации и количественного определения липидных продуктов ферментативной реакции применяли хроматографические методы (стр. 246). ГФ-Трансацилаза синтезирует не только глицериды, но и фосфолипиды (главным образом фосфатидные кислоты, стр. 253), причем относительное содержание этих классов липидов в реакционной смеси изменяется в широких пределах в зависимости от происхождения фермента, длительности инкубации и т. д. [31, 184, 901, 903, 904, 946, 977]. Большая часть нейтральных липидов, возникших в ферментной системе, представляет собой смесь три- и диглицеридов [194]. Преобладают количественно обычно триглицериды, но иногда наблюдается и обратное соотношение [196, 407], связанное с источником фермента ([247]; а также стр. 247), со сравнительной скоростью отдельных этапов ГФ-трансацилирования и с активностью липазы в ферментных препаратах [196, 407]. В опытах с жирными кислотами-С¹⁴ удельная радиоактивность углерода в диглицеридах обычно в десятки раз выше, чем в триглицеридах-С¹⁴, сильно разбавляемых эндогенными, не содержащими С¹⁴ триглицеридами гомогената [31, 751, 904]. Иногда среди продуктов биосинтеза in vitro встречаются моноглицериды, несущие подчас значительную долю <\br> Рис. 37. Адсорбционная хроматограмма нейтральных липидов, синтезированных из пальмитата-1-C¹⁴ гомогенатом жировой ткани крысы [903] По горизонтали — номера фракций и градиент концентрации подвижной фазы (1—100%-ный раствор эфира в петролейном эфире). По вертикали — концентрация липидов в элюате колонки (в мк-экв гидроксамата на 1 мл, II) и радиоактивность элюата (в имп/мин-мл, I, III, IV). I — эфиры холестерина; II — триглицериды; III — диглицериды; IV — моноглицериды

радиоуглерода суммы глицеридов [184, 901]. В качестве примера на рис. 37 представлена хроматограмма нейтральных липидов, образовавшихся при инкубации гомогената жировой ткани с пальмитатом-С¹⁴ и с системой кофакторов [903].

СВОЙСТВА И КИНЕТИКА ГФ-ТРАНСАЦИЛАЗЫ И СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ БЕЛКА НА ЕЕ АКТИВНОСТЬ

Направление и скорость ГФ-трансацилазной реакции определяются и жирнокислотной специфичностью фермента. Так, линолеат и олеат включались в глицериды клеточных частиц печени сильнее, чем пальмитат [898]. Последний, в свою очередь, интенсивнее, чем ацилы летучих кислот с m = 4—8, превращался в ди- и триглицериды молочной железы [804].

Исследование кинетики реакции показало, что в зависимости <\br> от происхождения фермента постоянная скорость включения глицерофосфата-С¹⁴ сохранялась в течение 10—60 мин.; лаг-период в системе включения не обнаружили. После 30—60 мин. инкубации биосинтез новых глицеридов обычно прекращался; его можно возобновить прибавлением свежего набора кофакторов ГФ-трансацилирования. В отсутствие ингибиторов АТФ-азы (фторида или ионов Ni) уже через 15 мин. реакция останавливалась перед энергетическим барьером [184, 196, 751, 904].

Включение жирных кислот и глицерофосфата в глицериды, особенно в анаэробных условиях, обнаруживает абсолютную потребность в АТФ, КоА и ионах Mg²⁺ и заметно стимулируется глутатионом-SH [91, 184, 902, 904, 934]. Другие нуклеозид-трифосфаты не заменяют АТФ [196, 247]. Необходимость ионов Mg²⁺ была показана в опытах с ферментными препаратами, которые были обработаны ЭДТА для связывания эндогенного магния. Ионы Mg²⁺ в реакции можно было заменить ионами Mn²⁺ [184]. Избыток Mg²⁺ (3 × 10⁻³ М) несколько ингибировал трансацилирование [91, 196, 407, 897]. Ферментные системы слизистой крысы и листьев шпината активировались ненасыщенными жирными кислотами с m = 14—18 (0,2—0,5 мкмоля) [184, 196].

ГФ-трансацилаза специфически тормозится даже низкими концентрациями (0,66 мг/мл) поверхностно-активного полиэфира Твин-20 [196, 407, 751]. Оптимум рН обычно сглажен и для ферментов различных тканей составляет 6,7—8,5 [184, 196, 407, 751].

Внесение глицерофосфата в субклеточные системы молочной железы и других органов усиливало биосинтез глицеридов в 12—88 раз [196, 247, 901]. Возможность замены этого эфира глицерином или фосфорилированными продуктами гликолиза зависела от присутствия глицерокиназы в ферментном препарате (стр. 240). Симметричный β-глицерофосфат не мог быть использован вместо L-глицеро-3-фосфата [196, 247, 664]. В структурных элементах жировой ткани и слизистой кишечника заметное образование глицеридов наблюдалось и без добавления глицерофосфата, за счет возникшего при гликолизе эндогенного глицерофосфата, содержание которого в эпидидимальной ткани крысы было равно 0,2 мкмоля/г [31, 196, 904]. Для печени крысы соответствующая величина составляла 1 мкмоль/г; падение концентрации глицерофосфата под действием голодания или по другой причине значительно снижало способность этой ткани к биосинтезу глицеридов [947]. Регуляторная роль глицерофосфата в липидном обмене печени по принципу обратной связи была снова показана при исследовании превращения цитрата-С¹⁴ в жирные кислоты в бесструктурной надосадочной жидкости. Ниже представлены данные о стимулирующем действии микросом и L-глицеро-3-фосфата (ГФ) на биосинтез жирных кислот в надосадочной жидкости гомогената печени крысы, определяемый по включению цитрата в жирные кислоты (в мкмолях/мг белка надосадочной жидкости за час) [401]: <\br> | Белок микросом, мг | —ГФ | +ГФ | | :--- | :--- | :--- | | 0,0 | 14,6 | 18,6 | | 0,6 | 17,4 | 91,0 | | 1,2 | 16,7 | 106,6 |

Продукты превращения цитрата — алифатические ацил-КоА-производные — сильно тормозят синтез самих жирных кислот. Если же в систему внести микросомы печени, способные к образованию глицеридов, а также акцептор ацилов — глицерофосфат, то в результате ГФ-трансацилазной реакции содержание ацил-КоА-производных падает, их ингибирующее действие снимается, а включение меченых предшественников в жирные кислоты возрастает в несколько раз. По-видимому, физиологический уровень глицерофосфата имеет жизненно важное значение для регуляции синтеза глицеролипидов в живой ткани [401].

При низких концентрациях ГФ-трансацилазы слизистой кишечника скорость включения пальмитата в глицериды пропорциональна количеству фермента. Оптимальное содержание последнего в обычной системе кофакторов (см. выше) составляет 3—5 мг белка на 3 мл [196, 407, 946]. Активность свежего фермента значительно понижается после его выдерживания при комнатной температуре, замораживания или обработки ацетоном [184, 751, 934]. Лиофилизированная ГФ-трансацилаза микросом выдерживает хранение при —10° С без инактивации [897].

Было отмечено несколько случаев стимуляции биосинтеза глицеридов in vitro сывороточным альбумином и другими белками [91, 247]. В опытах с микросомами печени обнаружено, что вторичное добавление свежего фермента в реакционную смесь после 30 мин. инкубации вызывает резкий подъем ГФ-трансацилазной активности [946]. Аналогичный эффект давали сывороточные альбумины и различные липопротеины, действие которых было аддитивным даже при оптимальной концентрации каждого компонента. Ниже показано активирование биосинтеза глицеридов микросомами печени in vitro альбумином и другими белками [140]. Состав реакционной смеси и единицы измерения те же, что и на стр. 249, содержание белка микросом 0,9 мг.

Предполагается, что положительное влияние альбумина на микросомную систему липогенеза основано на стабилизации ГФ-трансацилазы (стр. 246). Как и в гомогенате жировой ткани [904], избыток сывороточного белка тормозит активность фермента. <\br> В то же время липопротеин, по-видимому, играет в этой системе роль акцептора синтезированных глицеролипидов, которые сосредоточены в микросомах. Последние, освободившись от избытка липидов, восстанавливают способность к включению жирных кислот. С этой точки зрения первыми свободными продуктами биосинтеза глицеридов в живых тканях являются не сами липиды, а липопротеины [947].

Таким образом, при биосинтезе глицеридов в субклеточной ГФ-трансацилазной системе происходит перенос ацильных групп с КоА-производных жирных кислот на глицерофосфат. В продуктах этого биосинтеза обнаружено несколько соединений — три-, ди- и моноглицериды, фосфатидные кислоты и т. д. (стр. 249). Поэтому можно считать, что ГФ-трансацилазная реакция — это сложный, многоступенчатый процесс, а сама ГФ-трансацилаза представляет собой комплекс различных ферментов.

Глава 21. ФОСФАТИДНЫЕ КИСЛОТЫ КАК ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ БИОСИНТЕЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

БИОСИНТЕЗ ГЛИЦЕРИДОВ ИЗ ГЛИЦЕРОФОСФАТА ЧЕРЕЗ ФОСФАТИДНЫЕ КИСЛОТЫ

Гипотеза о том, что синтез глицеридов в слизистой оболочке кишечника осуществляется при участии фосфолипидов, была высказана еще в 1929 г. [879].

Позднее предположили, что такими промежуточными веществами могут быть представители безазотистых фосфолипидов — фосфатидные кислоты. Во-первых, именно фосфатидные кислоты (ІІІ) легче всего представить себе возможным продуктом ацилирования глицерофосфата (І). Кроме того, эти соединения часто находят в бесклеточных системах биосинтеза триглицеридов. И наконец, давно известно, что фосфатидные кислоты служат предшественниками фосфолипидов.

В живой ткани фосфатидных кислот обычно очень мало [406, 977]. Поэтому прежде они считались артефактом автолиза клеток, возникшим из фосфолипидов под действием фосфолипазы [184, 565, 587].

По современным данным, фосфатидные кислоты содержатся в нормальной живой клетке. Однако обнаруживаются они с трудом из-за их гидрофильности и чрезвычайно высокой скорости обмена, особенно дефосфорилирования [184, 565, 828, 886]. Поэтому первым прямым доводом в пользу их важной метаболической роли стало выделение меченых фосфатидных кислот из природных источников в условиях, исключающих гидролиз. <\br> Схема реакций биосинтеза диглицеридов из глицерофосфата и моноглицеридов с промежуточным образованием фосфатидных кислот

где: 1—3 — атомы углерода в цепи глицерина; I — L-глицеро-3-фосфат; II — L-α-лизофосфатидные кислоты; III — L-α-фосфатидные кислоты; IV — D-1,2-диглицериды; V — 1-моноглицериды; а — глицерофосфат-трансацилаза; б — лизофосфатидат-трансацилаза; в — диглицеридкиназа; г — моноглицеридкиназа; д — фосфатидат-фосфатаза; R, R' — ацилы жирных кислот

С этой целью дегидратированные метанолом ткани гомогенизировали в 5%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ) в присутствии нерадиоактивных фосфатидных кислот, добавленных в качестве носителя, и экстрагировали хлороформом или его смесью с метанолом [61, 406, 451, 452]. Фосфатидные кислоты осаждали <\br> метанолом, рН 8, или раствором хлорида Мg в ацетоне и очищали хроматографией на ионообменных смолах, кремнекислоте или бумаге, пропитанной кремнекислотой, в системе диизобутилкетон — уксусная кислота — вода [184, 328, 384, 404, 406, 451, 452, 587]. На бумаге фосфатидные кислоты давали цветную реакцию с Родамином Ж, но не окрашивались Родамином 6Ж. Пятна совпадали с зонами активности на радиоавтографах хроматограмм [184, 451, 452, 784]. Лизофосфатидные кислоты (см. схему, ІІ) анализировали аналогичным методом, но для их отделения от фосфатидилэтаноламина применяли двумерную тонкослойную хроматографию [91, 184, 770, 784].

Рис. 38. Последовательность появления радиоактивности глицерофосфата в различных классах липидов Источник ферментов — микросомы межплодника авокадо (20,5 мг белка). Система содержала глицерофосфат-1,3-С¹⁴ (4,65 × 10⁵ распадов в 1 мин.). 1 — фосфатидные кислоты; 2 — диглицериды; 3 — триглицериды; 4 — моноглицериды [91]

Фосфатидные кислоты и дифосфатидилглицерины можно разделить только в виде их деацилатов — глицерофосфата и диглицерофосфатглицерина соответственно [328, 404]. Единственным водорастворимым продуктом щелочного деацилирования фосфатидных и лизофосфатидных кислот, который идентифицируется методом бумажной и ионообменной хроматографии (стр. 243), является несимметричный L-глицеро-3-фосфат [91, 184, 328, 404, 451, 784]. Следовательно, природные фосфатидные кислоты содержат фосфатный остаток только в положении 3. Соотношения глицерина, фосфата и жирных кислот в препаратах фосфатидных кислот близки к теоретическим [404, 587].

Имеются и другие доказательства промежуточной роли фосфатидных кислот в образовании глицеридов. Так, в микросомной системе биосинтеза из плодов авокадо (стр. 249) глицерофосфат-1,3-С¹⁴ включался прежде всего в фосфатидные кислоты (рис. 38). Затем радиоактивность переходила в указанном порядке в моноглицериды (см. схему, V), диглицериды (IV) и триглицериды. В аналогичном опыте с листьями шпината фосфатидные кислоты в начале инкубации составляли 80—90% суммы липидов. Через 2 часа после начала опыта в системе преобладали глицериды. По-видимому, глицерофосфат образует с ацил-КоА-производными фосфатидные кислоты, которые, в свою очередь, дефосфорилируются, давая диглицериды [91, 184].

Когда пальмитат-С¹⁴ ввели в слизистую кишечника или в дру- <\br> гие ткани in vitro или in vivo, а затем разделили их фосфолипиды, то на долю фосфатидных кислот пришлось 90% общей радиоактивности и только 0,4—1,5% органического фосфора [328, 406, 451, 452, 565, 828]. Таким образом, весьма быструю обмениваемость этих соединений в клетке можно считать доказанной.

В суспензиях клеточных частиц слизистой оболочки, печени, почек и молочной железы немеченые фосфатидные кислоты конкурировали с глицерофосфатом-С¹⁴ за включение в глицериды и полностью заменяли его в системе биосинтеза [36, 196, 247, 405, 407, 449, 452, 665, 867, 897]. В срезах слизистой кишечника жирные кислоты в несколько раз усиливали этерификацию NaH₂P³²O₄ с образованием фосфатидных кислот. Радиоактивность других фосфолипидов при этом не изменялась [449—452].

Все изложенное не оставляет сомнения в том, что фосфатидные кислоты широко распространены в природе и играют роль промежуточных продуктов в глицеролипидном обмене.

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ ФОСФАТИДНЫХ КИСЛОТ ИЗ ГЛИЦЕРОФОСФАТА

Помимо биологических объектов, уже упомянутых выше, биосинтез L-α-фосфатидных кислот обнаружен в скелетных мышцах и эритроцитах [384, 751]. Эта реакция является составной частью ГФ-трансацилазного пути образования триглицеридов и потому не отличается от него по составу субклеточной ферментной смеси и по внутриклеточной локализации [91, 184, 384, 587, 751, 867] (стр. 247).

Изучение кинетики биосинтеза показало, что скорость реакции, пропорциональная концентрации фермента, была постоянной в первый час инкубации, а затем снижалась. Между убылью АТФ и глицерофосфата-Р³² и реакции и образованием АМФ, пирофосфата и Р³²-фосфатидных кислот наблюдалось стехиометрическое соотношение. Включение жирных кислот не происходило вовсе или было сильно ослаблено в отсутствие АТФ и КоА, а также цистеина и ионов Mg²⁺. Фторид, гидроксиламин и избыток самих фосфатидных кислот тормозили реакцию. Выход фосфатидных кислот в субклеточной системе (из расчета на пальмитил-КоА) составлял 80% [384, 587, 665].

Механизм включения жирных кислот в фосфатидные кислоты отличается высокой специфичностью. Хотя пальмитат и стеарат могут входить в эти соединения, главная роль в жирнокислотном обмене фосфатидных кислот, содержащих 10—20% олеата и 70—80% линолеата, принадлежит ненасыщенным кислотам, которые ацилируют преимущественно средние гидроксилы молекулы и при этом усиливают этерификацию пальмитиновой кислоты [406, 587, 751, 841, 898, 977].

Каков же механизм превращения глицерофосфата в фосфатидные кислоты? Как видно из данных рис. 38, в начале инкуба- <\br> ции моноглицериды обнаруживали более высокую радиоактивность, чем диглицериды. Можно думать, что эти моноглицериды представляли собой продукты гидролиза лизофосфатидных кислот фосфатидат-фосфатазой (стр. 258). К тому же небольшое количество лизофосфатидных кислот выделили непосредственно из реакционной смеси [91]. Если это предположение справедливо, то лизофосфатидные кислоты следует считать первыми продуктами неполного ацилирования глицерофосфата. Пока неизвестно, какой из его гидроксилов ацилируется сначала — средний или крайний [713]. Возможно, что замещение каждой ОН-группы контролируется особым ферментом, причем один из них катализирует преимущественное включение ненасыщенных кислот в положение 2 [20].

ОБРАЗОВАНИЕ ФОСФАТИДНЫХ КИСЛОТ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ДИГЛИЦЕРИДКИНАЗЫ

В клеточных структурах мозга, эритроцитов, семядолей арахиса и листьев шпината был обнаружен другой путь синтеза фосфатидных кислот — под действием особого фермента диглицеридкиназы [122, 184, 384, 386]. Этот фермент в простой системе кофакторов (эмульсия диглицерида, АТФ, ионы Mg²⁺, глутатион, фторид и буфер, рН 7—8) осуществлял прямое анаэробное фосфорилирование D-1,2-диглицеридов (см. в на схеме, стр. 254) с образованием фосфатидных и частично лизофосфатидных кислот. В разных тканях относительные скорости ГФ-трансацилазного и диглицеридкиназного путей биосинтеза были различны. Активность диглицеридкиназы, которую легко перевести в раствор путем замораживания и оттаивания, была пропорциональна концентрации ферментного белка, АТФ и диглицеридов, а также ненасыщенности последних. Реакцию тормозило связывание ионов Mg²⁺ с ЭДТА, нагревание до 100° и добавление иодацетата. Вследствие стереоспецифичности фермента фосфорилирование L-1,2-диглицеридов почти не происходило [122, 184, 384, 386, 828].

Физиологическая роль диглицеридкиназы неясна. Непосредственно в биосинтезе диглицеридов она, по-видимому, не участвует, поскольку количество сложноэфирных связей в этой реакции не увеличивается. Вместе с растворимой фосфатидатфосфатазой диглицеридкиназа образует так называемый цикл фосфатидных кислот, которому приписывают важную роль в регуляции ионной проницаемости биомембран (стр. 263) [384].

МОНОГЛИЦЕРИДКИНАЗА И ЕЕ РОЛЬ В БИОСИНТЕЗЕ ГЛИЦЕРИДОВ

Третий путь биосинтеза фосфатидных кислот, являющийся в то же время одним из механизмов прямого использования моноглицеридов в липогенезе (стр. 264), был обнаружен в структурных элементах клеток мозга, печени, эритроцитов, слизистой <\br> кишечника и семядолей арахиса [122, 383, 384, 770, 784]. Фермент моноглицеридкиназа образует из АТФ и моноглицеридов лизофосфатидные кислоты, которые путем ацилирования превращаются в фосфатидные кислоты (см. г, б на схеме, стр. 254) [344, 409, 867].

Содержание лизофосфатидных кислот достигало максимума после 30 мин инкубации. Для проявления активности было необходимо сохранение свободных SH-групп ферментного белка. При фракционировании сульфатом аммония в препарате возрастала концентрация моноглицеридкиназы и снижалось содержание системы, синтезирующей фосфатидные кислоты. Ненасыщенные моноглицериды превращались в лизофосфатидные кислоты быстрее, чем насыщенные [784].

Ниже приведен метод выделения и определения активности фермента из микросом мозга. Микросомы экстрагировали раствором, содержащим (в молях) глицилглициновый буфер — 0,02, pH 6,8, дезоксихолеат Na — 0,006, сахарозу — 4,25% и глутатион — 0,001. Осадок отделяли при 105 000 g и надосадочную жидкость фракционировали сульфатом аммония (30% насыщения). Фермент (4 мг) инкубировали один час в системе, содержащей, кроме раствора для экстракции, 1-монопальмитин — 0,002, Mg²⁺ — 0,002, фторид Na — 0,01 и АТФ-генерирующую систему в общем объеме 9 мл. После инкубации смеси методами хроматографии (стр. 254) выделили всего 0,1—2,0 мкмоля лизофосфатидных кислот [784].

Столь малое количество этих кислот указывает на их быстрое превращение в какие-то другие продукты. Действительно, в клеточных структурах мозга, печени и эритроцитов под действием фермента лизофосфатидат-трансацилазы P³²-L-α-(α'-олеил)-лизофосфатидные кислоты этерифицировались пальмитил-КоА, давая P³²-L-α-фосфатидные кислоты. Это трансацилирование обычно в несколько раз превосходило по скорости моноглицеридкиназную реакцию. Максимума радиоактивности фосфатидных кислот в клеточных частицах и в мембранах эритроцитов достигали соответственно за 10 и 60 мин. Фторид и ионы Mg²⁺ активировали трансацилирование благодаря торможению фосфатидат-фосфатазы (стр. 262). Несмотря на то, что моноглицеридкиназа фосфорилировала 1- и 2-моноглицериды с одинаковой скоростью, β-лизофосфатидные кислоты, возникшие из 2-моноглицеридов, не были способны превращаться в фосфатидные кислоты [384, 784].

До недавнего времени роль моноглицеридного пути образования фосфатидных кислот в биосинтезе триглицеридов в живой ткани, в частности в слизистой кишечника, оставалась неясной [409, 867]. Сейчас, однако, показано, что в превращении моноглицеридов в ди- и триглицериды могут участвовать фосфорилированные производные. В кишечник крысы вводили дважды меченный 1-монопальмитин (пальмитат-9,10-Н³-глицерин-1-C¹⁴), где соотношение активностей р = [H³] / [C¹⁴] составляло 3,6. Липиды слизистой раз- <\br> Таблица 30 Включение 1-монопальмитина-1-С¹⁴-9,10-Н³ в глицериды и фосфолипиды слизистой оболочки кишечника крысы in vitro [770]

деляли хроматографически и определяли [Н³] и [С¹⁴] в их отдельных классах. Табл. 30 показывает, что значение р изменялось по следующей схеме: моноглицериды (3,6) → лизофосфатидные кислоты (3,2) → фосфатидные кислоты (4,5) → диглицериды (4,6) → триглицериды (6,0). Таким образом, глицериды слизистой синтезировались путем ацилирования лизофосфатидных кислот и диглицеридов пальмитатом-Н³, образовавшимся из 1-монопальмитина (см. б, г, д на схеме, стр. 254), а величина прироста р на каждом этапе этого процесса, приблизительно равная 1,4, по-видимому, отражала радиоактивность метаболического резервуара (стр. 233) свободных жирных кислот ткани [770].

ФОСФАТИДАТ-ФОСФАТАЗА: ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ, СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ВЫДЕЛЕНИЕ

Превращение фосфатидных кислот в D-1,2-диглицериды (см. д на схеме, стр. 254) осуществляет специфический фермент фосфатидат-фосфатаза (Ф-фосфатаза), впервые обнаруженная в 1957 г. Кеннеди в печени [886]. Ф-фосфатаза (L-α-фосфатидат-фосфогидролаза, КФ 3.1.3.4) в том или ином количестве найдена также в мозгу, сердце, мембране эритроцитов, скелетных мышцах, слизистой кишечника, почках и жировой ткани различных млекопитающих и птиц [214, 384, 386, 449, 453, 710, 827, 841, 886, 977]. В настоящее время установлено, что в живых тканях содержится не одна, а несколько Ф-фосфатаз, различных по свойствам. <\br> Для измерения активности фермента 0,03 моля малеатного буфера, рН 6,4, и 0,0025 моля фосфатидной кислоты инкубировали с ферментом один час в общем объеме 2 мл, прибавляли 4 мл 5%-ной ТХУ и определяли содержание ортофосфата в фильтрате. Количестве фермента, образующее 1 мкмоль фосфата в час на 1 мг белка, принимали за единицу его активности [214, 989].

Специфическим субстратом всех Ф-фосфатаз служат L-α-фосфатидные и L-α-лизофосфатидные кислоты (см. II, III на схеме, стр. 254) [385, 449, 453]. Жирнокислотный состав субстрата влияет на скорость его гидролиза, поскольку фосфатидные кислоты, полученные из природного лецитина или же содержащие одинаковые ацильные группы в обоих положениях, преимущественно расщеплялись ферментом. Возможно, что такая специфичность определяет своеобразие глицеридного состава данной ткани [20, 911]. Выход D-1,2-диглицеридов при гидролизе достигает 90% [886].

Фермент почти не гидролизует L-глицеро-3-фосфат, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, дифосфоинозитид и синтетические β-фосфатидные кислоты, но может расщеплять алкилфосфаты с длинной цепью [214, 385, 449, 453, 568]. Таким образом, для проявления активности Ф-фосфатазы необходимо, чтобы глицерофосфат был этерифицирован хотя бы одним остатком жирной кислоты, чтобы ортофосфатная группа находилась в α-положении и чтобы в этой группе не происходило дальнейшего замещения [214, 453].

Ф-Фосфатаза была впервые выделена путем осаждения надосадочной жидкости гомогената печени цыплят 1 М ацетатным буфером, рН 5 [886]. Современные методы препаративного получения этого фермента основаны на предварительном разделении и тщательной очистке клеточных фракций. Например, гомогенат печени в 9 частях раствора 0,25 М сахарозы и 0,002 М ЭДТА разделяли на безъядерный гомогенат, митохондрии, лизосомы, микросомы и бесструктурную надосадочную жидкость при 1000 g (10 мин.), 4300 g (10 мин.), 11 700 g (20 мин.), 104 000 g (60 мин.) соответственно. Для обеспечения однородности каждый осадок многократно промывали на центрифуге [863, 989].

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ, КИНЕТИКА И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ОБЕИХ ФОРМ Ф-ФОСФАТАЗЫ

Сейчас установлено, что Ф-фосфатаза содержится в структурных элементах клетки [911]. Действительно, в жировой ткани фермент обнаружили в «тяжелых частицах» (по-видимому, митохондриях); в слизистой хомяка он распределялся почти поровну между митохондриями и микросомами, а в слизистой кишечника кошки и в почках свиньи на 60% сосредоточивался в микросомах [214, 408, 409, 452, 453, 827]. Возникло мнение, что Ф-фосфатаза, как и другие ферменты глицерофосфатного пути биосинтеза, кроме глицерокиназы, локализована только в микросомах [214]. Однако <\br> ее активность постоянно обнаруживалась и в более тяжелых частицах гомогената. Распределение Ф-фосфатазы внутри клетки изучали с использованием очищенных субклеточных фракций (см. выше). Однородность фракций определяли по удельной активности для данной фракции маркирующего фермента: 1) сукциноксидазы для митохондрий, 2) фосфомоноэстеразы для лизосом, 3) глюкозо-6-фосфат-фосфатазы для микросом ¹ и 4) 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы для бесструктурной надосадочной жидкости [409, 863, 989]. Было показано, что основная активность Ф-фосфатазы сосредоточена в лизосомах печени крысы, а при переходе к митохондриям и затем к микросомам эта активность каждый раз снижается вдвое. Результаты другого опыта (табл. 31) свидетельствуют о том, что каждая из фракций обладает собственной Ф-фосфатазой, причем микросомы содержат наибольшее количество этого фермента, а лизосомы характеризуются его наивысшей удельной активностью [863, 989].

Таблица 31 Внутриклеточное распределение маркирующих ферментов, фосфатидат-фосфатазы и белка в печени крысы [863]

• По отношению к активности в безъядерном гомогенате. Обозначения маркирующих ферментов приведены на стр. 260 и 261.

Однако изучение внутриклеточной локализации Ф-фосфатазы не ограничилось уровнем отдельных структур цитоплазмы. Оказалось, что в каждой клеточной частице печени имеются две формы фермента. Растворимую Ф-фосфатазу, содержащуюся преимущественно в лизосомах и митохондриях, можно было извлечь

¹ Недавно было показано, что глюкозо-6-фосфат-фосфатазная активность препарата митохондрий, составляющая 4—10% от соответствующей активности в микросомах, не связана с присутствием последних в препарате, а вызывается содержанием этого фермента во внешних мембранах митохондрий. Поэтому глюкозо-6-фосфат-фосфатазу допустимо использовать для контроля микросомного загрязнения лишь в интактных митохондриях [152a]. <\br> трех-четырех-кратным замораживанием и оттаиванием суспензии. Неэкстрагируемая часть фермента прочно связана и преобладает в микросомах [863, 989].

Когда микросомы печени после четырехдневного автолиза и шестичасового действия РНК-азы обработали 8%-ным н-бутанолом в 2,5×10⁻² М этаноламиновом буфере, рН 10,5, то прочно связанная Ф-фосфатаза полностью растворилась. Очищенный фермент частично осаждался 5 × 10⁻² М малеатным буфером, рН 6, содержал 0,3 мкмоля высших жирных кислот на единицу активности, снижал активность на 25% под действием фосфолипазы А и тормозился детергентами. Сопоставляя эти факты с необходимостью органического растворителя (бутанола) для растворения фермента, можно заключить, что прочно связанная Ф-фосфатаза микросом имеет липопротеиновую природу [214, 863].

В течение первых 40 мин. инкубации, когда расщеплялось 35—40% субстрата, кинетика гидролиза соответствовала уравнению нулевого порядка [214]. Судя по величине Км, растворимые ферменты лизосом и митохондрий печени отличались более высоким сродством к субстрату, чем прочно связанные Ф-фосфатазы митохондрий и микросом [863]. Оптимум концентрации для фосфатидной кислоты был равен 3 × 10⁻³ М, а для фермента — 5,5 мг белка на 1 мл [385, 886].

Другие фосфатазы цитоплазмы — кислая и щелочная (рН 5 и 10) — не расщепляют фосфатидные кислоты. Оптимум рН суммарной Ф-фосфатазной активности клеточных частиц составляет 6,0—6,5, а различие между растворимым и прочно связанным ферментом по этому показателю равно единице рН [214, 568, 863].

Тормозящее действие детергентов и свободных жирных кислот на Ф-фосфатазу вызвано изменением дзета-потенциала связанных с белком липидов на поверхности липопротеинового комплекса фермента. Особенно сильным ингибитором фермента является неионогенный детергент Твин-20, который тормозит преимущественно нерастворимую часть фермента. В то же время ингибирующее действие ионогенных детергентов направлено главным образом на растворимую Ф-фосфатазу [196, 214, 407, 863, 867, 886, 898].

Торможение фермента n-хлорртутьбензоатом снимается глутатионом; следовательно, свободные SH-группы ферментного белка необходимы для проявления Ф-фосфатазной активности. Ионы фторида (10⁻² М) вдвое снижают суммарную активность микросом, а на действие растворимого фермента эритроцитов не влияют [214, 385, 897].

Для всех Ф-фосфатаз чрезвычайно характерна чувствительность к двухвалентным катионам, особенно к ионам Mg²⁺. В нейтральной среде высокие концентрации Mg²⁺ (10—20 мкмолей/мл), образующего нерастворимые Mg-фосфатидаты, сильнее ингибировали активность фермента и вызывали большее накопление фосфатидных кислот, чем в кислой среде, где растворимость фос- <\br> фатидатов была выше. В малых дозах (2—10 мкмолей/мл) ионы Mg²⁺ стимулировали растворимые Ф-фосфатазы митохондрий печени и мембран эритроцитов, а на прочно связанную форму фермента оказывали только тормозящее действие. Ингибиторами реакции были также двухвалентные катионы Са, Ва, Mn, Fe, Zn и Hg [214, 386, 568, 863, 897].

Таким образом, в клетке присутствуют по меньшей мере две различные Ф-фосфатазы. Сопоставление некоторых свойств обоих ферментов показало, что константы Михаэлиса растворимой и прочно связанной фосфатазы равны 1,6—6,1 × 10⁻³ и 1,3—1,5 × × 10⁻² М, а оптимум рН 6,5 и 5,5 соответственно. Растворимая фосфатаза ингибируется ионными детергентами и не ингибируется фторидом, активируется ионами Mg²⁺ и сосредоточена преимущественно в структурах, не синтезирующих глицериды. Прочно связанная фосфатаза, напротив, ингибируется неионными детергентами, фторидом и ионами Mg²⁺. Она сосредоточена в структурах, синтезирующих глицериды.

Растворимая Ф-фосфатаза содержится главным образом в лизосомах, которые известны как средоточие гидролитической активности цитоплазмы, и в мембранах оболочки эритроцитов, где глицерофосфатный путь синтеза фосфатидных кислот почти отсутствует. Полное извлечение растворимого фермента из митохондрий не приводит к снижению их общей ГФ-трансацилазной активности [385, 863, 989]. По-видимому, Ф-фосфатаза этого типа имеет непосредственное отношение не к липогенезу, а к процессам регуляции поглощения катионов биологическими мембранами (стр. 257).

Прочно связанная форма Ф-фосфатазы сходна с ферментами синтеза глицеридов тем, что она тоже сосредоточена в микросомах и отчасти в митохондриях и не экстрагируется из клеточных структур при замораживании [863]. Весьма вероятно, что эта форма фермента является составной частью пространственно-организованного многоферментного комплекса микросом, который осуществляет синтез триглицеридов в живой клетке.

Выше (стр. 254) приведены те реакции этого комплекса, которые связаны с образованием диглицеридов из фосфорилированных предшественников. Как видно, исходным продуктом синтеза диглицеридов может служить не только глицерофосфат, но и моноглицерид. Далее будет рассмотрен другой путь превращения моноглицеридов в ди- и триглицериды, в котором соединения фосфорной кислоты не являются непосредственными промежуточными продуктами.

ОБРАЗОВАНИЕ ДИГЛИЦЕРИДОВ НА ОСНОВЕ МОНОГЛИЦЕРИДОВ И ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ БИОСИНТЕЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

Глава 22. БИОСИНТЕЗ ДИГЛИЦЕРИДОВ НА ОСНОВЕ МОНОГЛИЦЕРИДОВ

СВОЙСТВА МОНОГЛИЦЕРИД-ТРАНСАЦИЛАЗЫ

Исследование всасывания жиров в кишечнике (стр. 219) показало, что 85—90% триглицеридов лимфы сходны с триглицеридами рациона по 2-моноглицеридной структуре. Если бы триглицериды слизистой образовывались только из глицерофосфата и свободных жирных кислот, возникших при гидролизе, то наблюдаемое сходство в строении было бы невозможным. Поэтому предположили, что наряду с глицерофосфатным путем в этой ткани имеется и другой — «моноглицеридный» путь жирообразования, который состоит в непосредственном ацилировании моноглицеридов алифатическими ацил-КоА-производными без участия фосфатидных кислот [867, 977].

Действительно, в слизистой кишечника различных животных, а также в молочной железе морской свинки, поджелудочной железе и почках был найден фермент моноглицерид-трансацилаза (МГ-трансацилаза), или ацил-КоА : моноглицерид-ацилтрансфераза, КФ 2.3.1, осуществляющий прямое превращение моноглицеридов в диглицериды. Распространение этого фермента в живых тканях, по-видимому, ограничено, поскольку в молочной железе козы и крысы, в мозгу, печени, жировой ткани и аорте он не был обнаружен [36, 54, 664, 863, 870].

Как и в случае ГФ-трансацилазы (стр. 247), внутриклеточная локализация МГ-трансацилазы была установлена не сразу. Сначала средоточием фермента считали митохондрии и бесструктурную надосадочную жидкость гомогената [36, 194]. Затем возникло представление о двух формах МГ-трансацилазы — прочно связанном ферменте митохондрий и микросом, который нельзя солюбилизировать замораживанием или действием змеиного яда, и растворимой форме, на долю которой приходится до 66% всей активности гомогената [195, 198].

В дальнейшем для получения гомогената слизистой разрушаемую этой тканью 0,25 М сахарозу (d = 1,034) заменили изотоническим раствором маннита (d = 1,016), что привело к более полному осаждению микросом при тех же условиях центрифугирования; одновременно чистоту фракций клеточных частиц стали характеризовать активностью цитохромоксидазы (митохондрии) и высоким содержанием РНК (микросомы, стр. 235). Применение этих <\br> новых методов не оставило сомнения в том, что МГ-трансацилаза вместе с ацил-КоА-синтетазой и диглицерид-трансацилазой на 65—90% локализована в микросомах и что, следовательно, там содержится полный набор ферментов моноглицеридного пути ресинтеза триглицеридов [55, 198, 408, 409, 867, 869, 870]. Электронномикроскопическое исследование эпителия кишечника в период всасывания жира подтвердило этот вывод, показав, что мельчайшие жировые капли заключены в мембранах эндоплазматического ретикулума эпителиальной клетки (стр. 248) [870].

Таким образом, препаратом МГ-трансацилазы чаще всего служат микросомы, выделенные центрифугированием гомогената слизистой в растворе 0,28 М маннита-0,01 М трис-малеатного буфера, рН 7 (стр. 235) [55, 194, 408, 456, 870]. Среда для определения активности фермента была близка по составу к приведеной выше (стр. 249), но вместо глицерофосфата в фосфатном буфере содержала эквимолярное количество моноглицеридов в трис-буфере, pH 7 [36, 194, 196, 664]. Если вместо жирных кислот применяли ацил-КоА-производные (0,2 — 1,0 мкмоль), то из среды исключали кофакторы их биосинтеза (стр. 238) — АТФ, КоА и глутатион. Прирост сложноэфирных связей в полной системе, установленный гидроксамовым методом (стр. 237), свидетельствует об увеличении общего содержания глицеридов при инкубации. В данном случае образование диглицеридов в присутствии АТФ доказывает, что лизофосфатидные кислоты не участвуют в реакции (см. ниже) [152, 454, 456, 457, 870].

Действие фермента останавливали ТХУ, серной кислотой или растворителями липидов — смесью хлороформа с метанолом (2 : 1) и этанолом. Триглицериды, 1,2 (2,3)-диглицериды, моноглицериды и СЖК разделяли на силикагеле [55, 456, 870, 874], а радиоактивность отдельных классов измеряли на сцинтилляционном спектрометре (стр. 246) [870]. Содержание моноглицеридов определяли периодатным методом в сочетании с изомеризацией в хлорной кислоте [55].

Для сопоставления ацилакцепторной способности моноглицеридов разного жирнокислотного состава в реакции степень их эмульгирования в водной среде должна быть одинаковой. Эмульгаторами обычно служат Твин-20 или Твин-80 (2—10 мг), а также щелочные соли жирных кислот, сывороточный альбумин и 5%-ный ацетон. Твин ингибирует диглицерид-трансацилазу и моноглицерид-липазу микросом (стр. 275), приводя тем самым к накоплению в них диглицеридов и облегчая определение МГ-трансацилазной активности, которая не только не снижается, но даже несколько активируется этими эмульгаторами. Отсутствие тормозящего действия Твина в МГ-трансацилазной системе, отсутствие конкурентного влияния фосфатидных и лизофосфатидных кислот на включение пальмитата-С¹⁴ в диглицериды и, наконец, установленное хроматографически отсутствие самих фосфорилированных производных в продуктах реакции — все это еще раз доказывает, <\br> что фосфатидные кислоты не являются промежуточными продуктами ацилирования моноглицеридов [36, 196, 198, 238, 407, 455, 664, 665, 867, 870].

Оптимальная концентрация моноглицеридов и ферментного белка в реакционной смеси равнялась соответственно 3,3 мкмоля и 1,5—2,5 мг/мл, а средняя скорость включения пальмитата в диглицериды микросомами слизистой составляла 47—80 мкмолей/мг белка в час [198, 408, 409, 449]. МГ-Трансацилаза была устойчива к замораживанию до —20°, но тормозилась нагреванием и избытком ионов Mg²⁺ [196, 198, 869, 870].

Поскольку свободный глицерин или глицерофосфат не заменяют моноглицериды в ферментативной реакции, можно предположить, что МГ-трансацилаза представляет собой липопротеин, к активному центру которого присоединяются только гидрофобные производные глицерина, замещенные по одной из ОН-групп алифатической цепью [198, 870, 874]. Природа возникающей при замещении сложной или простой эфирной связи (стр. 269), 1- или 2-положение алифатического остатка, D- или L-конфигурация 1-замещенного производного глицерина не определяют субстратной специфичности фермента [150, 152, 405, 449, 867]. Уменьшение m и увеличение е в жирной цепи моноглицеридов облегчают их эмульгирование и обычно стимулируют МГ-трансацилазу, причем наиболее активными акцепторами ацилов оказываются монокаприн, моноундецилин и моноолеин. Однако растворимые в воде производные насыщенных кислот с m = 2—8 — худшие субстраты реакции, чем монопальмитин [196, 198, 407, 449, 870].

ПРОДУКТЫ МГ-ТРАНСАЦИЛАЗНОЙ РЕАКЦИИ

Глицеридный состав бесклеточной МГ-трансацилазной системы (1,87% моно-, 88,80% ди- и 9,33% триглицеридов) и динамика радиоактивности отдельных классов липидов в реакционной смеси (рис. 39) свидетельствуют о том, что первыми продуктами ацилирования в микросомах кишечника крысы являются диглицериды [194, 198, 405, 449, 870].

Рис. 39. Последовательность появления радиоактивности пальмитил-1-С¹⁴-КоА в различных классах липидов и накопление свободного пальмитата-1-С¹⁴ во фракции микросом слизистой кишечника крысы в присутствии 1-монопальмитина Условия инкубации и анализа липидов см. стр. 249 [870]. 1 — фосфатидные кислоты; 2 — моноглицериды; 3 — триглицериды; 4 — свободный пальмитат; 5 — диглицериды <\br> В микросомах слизистой хомяка 2-монопальмитин сразу, без промежуточного накопления диглицеридов, превращался в триглицериды, которые разделяли тонкослойной хроматографией с Ag⁺ (стр. 41). Ниже показана схема реакции и приведен теоретически ожидавшийся и найденный экспериментально состав триглицеридов.

Схема биосинтеза триглицеридов в эквимолярной смеси 2-монопальмитина-9,10-С¹⁴, пальмитил-КоА (П-КоА) и олеил-КоА (О-КоА) [456]

где: 25, 50, 25 — вычисленное (в %) распределение концентрации; 24, 48, 22 — найденное распределение концентрации.

Можно видеть, что схема достаточно полно отражает действительный ход биосинтеза. При инкубации 2-монопальмитина только с пальмитил-КоА или олеил-КоА в триглицеридах преобладали соответственно ППП и ОПО. Если же ацил-КоА-производные заменяли смесью свободных жирных кислот, АТФ и КоА, то при применении чистых жирных кислот результаты оставались прежними, а из эквимолярной смеси олеата и пальмитата возникал главным образом ППП. Аналогичные результаты были получены в реакции 1-монопальмитина с отдельными ацил-КоА-производными или их смесью, а также со свободными жирными кислотами. Итак, в изучаемой системе ферментов при ацилировании моноглицеридов тиоэфирами КоА не происходило первоочередного замещения первичных или вторичных ОН-групп и преимущественного использования насыщенных или ненасыщенных жирных кислот и моноглицеридов. Повышенная скорость включения свободного пальмитата в триглицериды, по-видимому, была связана с большим сродством ацил-КоА-синтетазы к этой кислоте (стр. 238) [456].

Как видно из рис. 39, в микросомах, особенно в отсутствие пальмитил-КоА, весьма активна моноглицеридлипаза, вызывающая накопление свободного пальмитата. Образование диглицеридов не <\br> обусловлено ацилтрансферазным обменным действием этого фермента (стр. 234), так как, во-первых, для ацилирования необходимы АТФ или ацил-КоА-производные, а во-вторых, МГ-трансацилаза и моноглицеридлипаза различаются по оптимуму рН (8,0 и 5,0) [198]. Однако при наличии липазы нельзя исключить возможности раздельного включения в диглицериды продуктов гидролиза или изомеризации меченых моноглицеридов. Чтобы доказать, что моноглицериды превращаются в ди- и триглицериды в интактном виде, не изменяя строения, были поставлены специальные опыты [454, 455].

Выше уже упоминалось о том, что в слизистой кишечника in vivo меченные по ацильному остатку 2-моноглицериды, включаясь в триглицериды лимфы, не претерпевают ацильной миграции [449, 571]. При изучении строения триглицеридов, образовавшихся в гомогенате слизистой in vitro из 1- или 2-монопальмитина-(пальмитат-С¹⁴), было обнаружено, что в первом случае С¹⁴ находился преимущественно в 1,3-, а во втором — в 2-положении триглицеридов [151, 152, 449]. Распределение радиоактивности (в %) в продуктах липазного гидролиза триглицеридов, образовавшихся в гомогенате слизистой in vitro из 1- или 2-монопальмитина-(пальмитат-С¹⁴) [151, 152, 449], показано ниже:

Включение радиоактивности в ди- и триглицериды и прирост количества сложноэфирных связей наблюдали и в бесклеточных системах слизистой, содержащих ацил-КоА-производные и меченные по глицерину 1-моноглицериды-С¹⁴ или -Н³ [408, 867, 870]. Такие опыты не доказывали, однако, что радиоактивные триглицериды не синтезировались из глицерофосфата-С¹⁴, который мог образоваться при действии глицерокиназы кишечника (стр. 240) на свободный глицерин-С¹⁴, возникший при липазном гидролизе [449, 571]. Поэтому наиболее убедительные данные были получены с применением дважды меченного 1-монопальмитина, р = 1,88 (стр. 258), который после двухчасовой инкубации с гомогенатом слизистой в присутствии нерадиоактивного пальмитил-КоА на 63% превращался в ди- и триглицериды с величиной р 1,89 и 1,82 соответственно [449, 454, 455, 867].

Таким образом, 1-моноглицериды включаются в диглицериды в интактном виде. К сожалению, аналогичные опыты труднее провести с более важными в физиологическом отношении 2-моноглицеридами, которые в водной среде, даже при оптимальном для МГ-трансацилазы значении рН, могут частично изомеризоваться в 1-моноглицериды [54, 55, 150, 874]. Поэтому вместо 1- и 2-моно- <\br> глицеридов применяли глицерил-1- и -2-(9, 10-Н³)-октадецениловый и глицерил-2-(1-C¹⁴)-октадециловый эфиры, которые, имея простую эфирную связь, устойчивы к изомеризации и не разрушаются гидролизом. При инкубации этих эфирных аналогов 1- и 2-моноглицеридов со срезами кишечника хомяка или крысы в присутствии желчнокислых солей и олеиновой кислоты появлялись соответствующие аналоги ди- и триглицеридов, из продуктов щелочного гидролиза которых можно было регенерировать исходные 1- и 2-глицериловые эфиры. Следовательно, превращаясь в диглицериды, 2-моноглицериды, наряду с 1-изомерами, сохраняют первоначальное строение [571, 874].

Что касается продуктов этого превращения, то, разумеется, 2-моноглицериды могут непосредственно образовывать только 1,2-диглицериды. Возникает вопрос, какие соединения появляются при моноацилировании 1-моноглицеридов, содержащих и первичные, и вторичные ОН-группы. Как показывают данные, полученные методом тонкослойной радиохроматографии, этими соединениями являются 1,3-диглицериды [455]. Распределение радиоактивности С¹⁴-пальмитил-КоА в 1,2- и 1,3-диглицеридах и триглицеридах при инкубации с 1- и 2-монопальмитином в гомогенате слизистой кишечника хомяка в % от исходной активности было следующим.

В слизистой хомяка из С¹⁴-пальмитил-КоА и (глицерин-Н³)-1-монопальмитина синтезировались преимущественно 1,3-дипальмитин и лишь небольшое количество 1,2-изомера. В отличие от последнего, значение р (стр. 258) 1,3-диглицерида было вдвое выше теоретически вычисленной величины р трипальмитина, который мог бы образоваться в той же системе биосинтеза триглицеридов. Следовательно, только 1,3-дипальмитин служил промежуточной ступенью этого биосинтеза. И наконец, именно этот изомер накапливался в реакционной смеси, если концентрация пальмитил-КоА была недостаточна для полного превращения 1-монопальмитина в триглицериды [449]. Таким образом, МГ-трансацилаза слизистой кишечника специфична к 1-ОН-группам 1- и 2-моноглицеридов [54, 55, 152, 449, 455, 457, 867, 874].

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО АЦИЛИРОВАНИЯ МОНОГЛИЦЕРИДОВ

При изучении кинетики МГ-трансацилазы применяли микросомы слизистой кишечника крысы, которые, в противоположность аналогичным клеточным частицам хомяка, могли эффективно ис- <\br> пользовать для биосинтеза триглицеридов почти исключительно 2-моноглицериды. Ацилирование же основной части 1-монопальмитина в этих органоидах происходило медленнее и не шло дальше образования 1,3-дипальмитина. Эта реакция тормозилась 2-монопальмитином, в то время как 1-монопальмитин почти не оказывал влияния на этерификацию 2-изомера. Наблюдаемая конкуренция свидетельствует о том, что в микросомах имеется только одна МГ-трансацилаза и что по величине сродства к этому ферменту 2-моноглицериды превосходят 1-изомер [55, 449, 867, 870].

Кинетику реакции обычно определяли в течение первых 5 мин. инкубации до исчезновения половины моноглицеридов из реакционной смеси, когда кривые включения жирных кислот в глицериды имели еще линейный характер [55, 151, 870]. Если построить график зависимости между обратными величинами концентрации субстрата и скорости ацилирования (1/S и 1/v) за этот период, то можно заметить, что при переходе ацильного остатка монопальмитина (субстрата S) из 1-положения в 2-положение Kₘ снижается, а истинная субстратная константа взаимодействия комплекса МГ-трансацилаза (Е)-пальмитил-КоА (Т) с субстратом S возрастает в 4—7 раз. Одновременно увеличивается и скорость распада ES-комплекса. Реакция фермента с субстратами Т и S показана на схеме.

Схема реакции моноглицерид-трансацилазы (Е) с 1- или 2-монопальмитином (S) и пальмитил-КоА (Т).

где: k — скорость распада комплекса EST с образованием диглицеридов; Kₛ, Kₜ, K'ₛ, K'ₜ — субстратные константы, характеризующие сродство фермента и комплексов ЕТ и ES к субстратам S и Т [55]. <\br> В состоянии равновесия v = k × [EST] = {kKₛ × Kₜ [E]₀ [S] [T]} / {1 + Kₛ [S] + Kₜ [T] + KₛK'ₜ [S] [T]}, где [S], [T] и [E]₀ — исходные концентрации монопальмитина, пальмитил-КоА и фермента. Преобразовав это уравнение в уравнение Михаэлиса-Ментен, нашли истинные величины субстратных констант взаимодействия МГ-трансацилазы с 1- и 2-монопальмитином [55].

Вычисленные данные подтвердили сделанный ранее из графика и из опытов по конкурентному торможению вывод о повышенном сродстве 2-изомера к ферменту и ЕТ-комплексу. Сродство пальмитил-КоА к МГ-трансацилазе и ее комплексу с монопальмитином не зависит от изомерной формы последнего, но комплекс ЕТ-2-монопальмитин вдвое превышает комплекс ЕТ-1-монопальмитин по скорости распада. Таким образом, главный путь ресинтеза триглицеридов в микросомах эпителия крысы изображается схемой: 2-моноглицериды → 1,2-диглицериды → триглицериды [54, 55].

ЗНАЧЕНИЕ МОНОГЛИЦЕРИДНОГО И ГЛИЦЕРОФОСФАТНОГО ПУТЕЙ БИОСИНТЕЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ В СЛИЗИСТОЙ КИШЕЧНИКА

Поскольку в слизистой кишечника триглицериды могут образовываться как по глицерофосфатному, так и по моноглицеридному пути, неоднократно пытались оценить долю каждого из путей в общем балансе биосинтеза. С этой целью клеточные частицы ткани инкубировали с глицерофосфатом или с 1- и 2-моноглицеридами и определяли скорость этерификации меченых ацил-КоА-производных тем или иным акцептором ацильных групп. При совместном присутствии акцепторов наблюдался аддитивный эффект, свидетельствующий об известной независимости отдельных путей биосинтеза диглицеридов. Была обнаружена видовая специфичность липидного обмена у различных животных. Так, у кролика первый из путей был по интенсивности в 1,5—2 раза выше, а у крысы — в 10 раз ниже второго [194].

Эти ранние опыты не вполне совершенны в методическом отношении, поскольку эмульгированные моноглицериды не были так же доступны для фермента клеточных частиц, как растворимый в воде глицерофосфат. Поэтому в дальнейших исследованиях измерением радиоактивности учитывали только включение (гли- <\br> церин-1-C¹⁴)-1-моноолеина и олеата-Н³ срезами кишечника хомяка в мицеллярном растворе дезоксихолеата [571].

При расчете доли каждого из путей в синтезе глицеридов исходили из того, что 1-моноолеин превращался в ди- и триолеин в интактном виде (стр. 269) и что возникший при гидролизе моноолеина свободный глицерин-С¹⁴ не участвовал в реакции. Для синтеза 11 молей диолеина из моноолеина-С¹⁴ было необходимо 11 молей

Рис. 40. Диаграмма синтеза ди- и триглицеридов (ДГ и ТГ) срезами тонкого кишечника хомяка (100—200 мг) при инкубации в течение 30 мин. при 37° в атмосфере чистого кислорода в системе, содержащей в мкмолях тауродезоксихолеат Na 2400; олеиновую кислоту-Н³ 800 и 1-моноолеин-(глицерин-С¹⁴) 0(а), 200(б) или 400(в) Перед определением радиоактивности глицериды разделяли тонкослойной хроматографией [571]; 1 — глицерофосфатный путь; 2 — моноглицеридный путь

олеата-Н³. Остальной олеат (13,7 моля) включился в диолеин путем ацилирования глицерофосфата, каждый моль которого связывал 2 моля жирной кислоты [571]. Следовательно, этим путем образовалось 13,7 : 2 = 6,85 моля диолеина. Аналогичным вычислением можно показать, что для синтеза 61,8 моля триолеина-С¹⁴ из моноолеина-С¹⁴ требуются 61,8 × 2 = 123,6 моля олеата-Н³. Поскольку эта величина в пределах ошибки опыта соответствует количеству олеата-Н³, включившемуся в триолеин (120 молей), очевидно, что весь триолеин образовался в этих условиях только из 1-моноолеина.

Выполненные расчеты (рис. 40) свидетельствуют о том, что биосинтез триглицеридов из свободной олеиновой кислоты идет исключительно по глицерофосфатному пути [571]. Эти данные совпадают с полученными ранее [867] указаниями на то, что в триглицеридах, выделенных из лимфы после введения в кишечник свободных С¹⁴-жирных кислот, радиоактивность распределена статистически между всеми тремя положениями ацильных остатков, а не присуща какому-либо определенному положению, как это имеет место при скармливании триглицеридов (стр. 264). С увеличением концентрации моноолеина в реакционной смеси доля учас- <\br> тия глицерофосфатного пути в образовании ди- и триглицеридов снижается, а интенсивность моноглицеридного пути и общая интенсивность биосинтеза неуклонно возрастают. В опытах с 2-моноэфирными аналогами 2-моноглицеридов отмечались сходные результаты [571].

Таким образом, моноглицеридный путь биосинтеза триглицеридов, локализованный в слизистом эпителии кишечника, представляет собой весьма эффективный физиологический механизм, облегчающий всасывание больших количеств жиров рациона из просвета кишечника в лимфатическую систему. В результате быстрой нестереоспецифической реакции МГ-трансацилаза ресинтезирует из 2-моноглицеридов и свободных кислот мицеллы, адсорбированной мембранами ретикулума, триглицериды, близкие по строению и составу к жирам рациона (стр. 222). В энергетическом отношении моноглицеридный путь вдвое выгоднее глицерофосфатного пути, так как требует для синтеза 1 моля триглицеридов всего 2 моля АТФ вместо 4. Нельзя считать случайным и совпадение между субстратной специфичностью панкреатической липазы, образующей при гидролизе почти исключительно 2-моноглицериды, и преимущественным сродством МГ-трансацилазы к этим изомерам. Глицерофосфатный путь играет, по-видимому, подчиненную роль в процессах всасывания жира, но может выступать на первый план при липидном голодании и при содержании в рационе большого количества свободных жирных кислот. Кроме того, при оценке путей биосинтеза липидов в слизистой кишечника не следует забывать об открытом недавно превращении 1-моноглицеридов в триглицериды при участии лизофосфатидных и фосфатидных кислот (стр. 258) [867, 977].

Глава 23. БИОСИНТЕЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПУТЕМ АЦИЛИРОВАНИЯ ДИГЛИЦЕРИДОВ

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ДИГЛИЦЕРИД-ТРАНСАЦИЛАЗЫ

В предыдущих разделах показано, что глицерофосфатный и моноглицеридный пути приводят к образованию диглицеридов, которые только и могут непосредственно превращаться в триглицериды. При длительном выдерживании интактных тканей с мечеными жирными кислотами наблюдался постепенный переход С¹⁴ из диглицеридов, отличавшихся в начале инкубации наибольшей радиоактивностью, в триглицериды (стр. 231). Аналогичное явление неоднократно обнаруживалось и в бесклеточных системах биосинтеза (см. рис. 38 и 39). Так, в препаратах жировой ткани после удаления меченого предшественника происходило выравнивание концентрации С¹⁴ в ди- и триглицеридах, а в клеточных частицах диафрагмы соотношение удельной активности <\br> этих классов после исключения пальмитата-С¹⁴ из среды снижалось с 8 до 2 [752]. В печени превращение Н³-пальмитат- и С¹⁴-олеат-диглицеридов в триглицериды отмечалось уже в течение первых 3 мин. инкубации [301]. Перераспределение метки между ди- и триглицеридами нельзя приписать неспецифической ацилтрансферазной активности липазы (стр. 234), поскольку оно сопровождалось ростом общей концентрации сложноэфирных связей в системе, для обеспечения которого были необходимы кофакторы энергетического обмена — АТФ и КоА [196, 665, 981, 982].

Заключительные реакции биосинтеза триглицеридов, представляющие собой ферментативное ацилирование диглицеридов ацил-КоА-производными жирных кислот, катализируются диглицерид-трансацилазой (ДГ-трансацилазой) или ацил-КоА : диглицерид-ацилтрансферазой [867]. Этот фермент содержится во всех способных к жирообразованию тканях, упомянутых ранее. Специально ДГ-трансацилазную реакцию изучали в слизистой кишечника крысы, печени крысы, молочной железе козы и морской свинки и в печени и жировой ткани цыплят [196, 299, 664, 863, 874, 899, 981, 982].

Для выделения фермента гомогенат ткани в растворе 0,25 М сахарозы-0,01 М 2-меркаптоэтанола разделяли центрифугированием при 700, 10 000 и 80 000 g на фракции ядер, митохондрий и микросом соответственно. Клеточные частицы без потери ДГ-трансацилазной активности сохранялись при —15° и выдерживали многократное замораживание и оттаивание [299, 863, 982]. При отступлении от этой методики происходила инактивация свободных SH-групп ферментного белка, приводящая к разрушению ДГ-трансацилазы или каких-то ее компонентов в бесклеточных препаратах тех тканей, которые (например, слизистая крысы) могли в виде интактных срезов интенсивно синтезировать триглицериды (стр. 228). Накопление диглицеридов в таких инактивированных препаратах в присутствии глицерофосфата или моноглицеридов свидетельствует о том, что ДГ-трансацилаза является особым, самостоятельным ферментом, отличным от МГ-трансацилазы [571].

Раньше считали, что реакция ацилирования диглицеридов свойственна митохондриям, однако сейчас общепризнано, что она связана с микросомами [196, 299, 863, 981, 982]. Так, в печени она обнаруживает ту же внутриклеточную локализацию, что и глюкозо-6-фосфат-фосфатаза (стр. 261) [989]. До сих пор ДГ-трансацилазу не удалось получить в растворенном состоянии [863].

Для определения активности фермента реакционную смесь, содержащую (в мкмолях) С¹⁴-ацил-КоА — 0,1—0,4; цистеин — 8; ионы Mg²⁺ — 5; диглицериды — 1,4; Твин-20 — 2—2,5 мг; белок микросом — 0,25—1,0 мг и трис-буфер, рН 7,4, 100—200 в общем объеме 1 мл инкубировали 1—2 часа при 37° [665, 784, 981, 982]. Реакцию останавливали прибавлением этанола, глицериды раст- <\br> воряли в CCl₄ или в смеси изооктана с изопропанолом (1 : 4) и измеряли их концентрацию и радиоактивность после многократной очистки от примесей ацил-КоА-производных и свободных кислот с помощью раствора NH₃ в 0,2 М КСІ или 0,05 н. раствора NaOH в 50%-ном этаноле [299, 665, 804, 981, 982, 989]. По данным адсорбционной хроматографии, 90—96% меченых липидов реакционной смеси приходилось на долю триглицеридов, причем между включением С¹⁴ и приростом эфирных связей наблюдалось стехиометрическое соотношение [299, 804, 982, 989].

Как показывают данные биосинтеза триглицеридов из D-1-линолео-2-стеарина и 1-С¹⁴-пальмитил-КоА микросомами печени цыпленка, присутствие диглицеридов необходимо для образования триглицеридов [981, 982] (условия инкубации, экстракции, разделения и количественного определения триглицеридов см. стр. 274).

Для сравнения действия фермента на диглицериды разного жирнокислотного состава степень дисперсности этих субстратов в водной среде должна быть одинаковой [449]. Для эмульгирования диглицериды перемешивали или обрабатывали ультразвуком в 0,5—1,0%-ном растворе Твин-20 в течение 20 мин. [665, 982], или же растворяли их в этаноле и быстро смешивали с реакционной средой [299]. Величина частиц полученных эмульсий составляла 1—5 мк [665].

В первые 15—40 мин. инкубации скорость включения пальмитил-КоА в триглицериды была постоянной. Оптимальная концентрация ферментного белка для ацилирования диглицеридов различного состава равнялась 0,25 мг, а Км фермента составляла 10⁻⁴ М пальмитил-КоА. Фермент отличался широким оптимумом рН, равным 7—9. Абсолютной потребности реакции в ионах Mg²⁺ или Mn²⁺ не наблюдалось. Возможно, что липидный обмен частично регулировался концентрацией ионов Са²⁺, которые в жировой ткани ингибировали превращение диглицеридов в лецитины, но не влияли на активность ДГ-трансацилазы. Последняя, в отличие от МГ-трансацилазы, тормозилась Твином-80, причем с 1,3-диглицеридами торможение было особенно сильным. Другим ингибитором реакции был 0,03 М фторид натрия [196, 299, 665, 982]. Добавление эмульсии диглицеридов в систему, содержащую микросомы слизистой кишечника, 1-монопальмитин-Н³, и С¹⁴- <\br> пальмитил-КоА, не изменило величину р (стр. 258) образующихся триглицеридов. Следовательно, диглицериды-Н³-С¹⁴, являющиеся промежуточными продуктами этого биосинтеза, не выделялись в реакционную среду, где они смешались бы с немечеными экзогенными диглицеридами, а были прочно связаны с активными центрами микросомных ферментов [55, 449].

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДГ-ТРАНСАЦИЛАЗНОЙ РЕАКЦИИ

Если биосинтез фосфолипидов отличается абсолютной стереоспецифичностью, поскольку лишь Д-диглицериды способны превращаться в лецитины, то в образовании триглицеридов по моноглицеридному пути оптические свойства субстратов не играют никакой роли (стр. 266). В этом отношении синтез триглицеридов из L-глицеро-3-фосфата (см. схему на стр. 254) занимает промежуточное положение. Так, D-1,2-диолеин вдвое превосходил L-1,2-диолеин по ацилакцепторной способности при ацилировании диглицеридов микросомами печени [449, 867, 982].

Положение жирнокислотных остатков диглицеридов по-разному влияет на активность ДГ-трансацилазы в различных тканях. В микросомах жировой ткани и молочной железы 1,3-диглицериды ацилируются в 4—5 раз медленнее, чем 1,2-изомеры, а в микросомах кишечного эпителия крысы оказываются совершенно неспособными к образованию триглицеридов [55, 299, 665].

Однако вывод о том, что лишь 1,2-диглицериды служат предшественниками триглицеридов [299], явился преждевременным, ибо в интактных срезах, нефракционированных гомогенатах тканей и в микросомах слизистой оболочки кишечника хомяка (стр. 267) вторичные ОН-группы 1,3-диглицеридов и первичные ОН-группы 1,2-изомеров этерифицируются с одинаковой скоростью [152, 196, 449, 571].

Замещаются ли 1,3-диглицериды непосредственно, или же до ацилирования они изомеризуются в 1,2-диглицериды? Результаты липазного гидролиза триглицеридов (стр. 230) и опыты с простыми глицериловыми эфирами (стр. 269) свидетельствуют против изомеризации. Однако имеются данные и иного характера (табл. 32). Эти данные показывают, что с увеличением длительности инкубации первые продукты ацилирования 1-моноолеина — 1,3-диглицериды — превращаются в 1,2-изомеры. Добавление олеата, который заметно конкурирует с 1-моноолеином-С¹⁴ за включение в ди- и триглицериды, не останавливает изомеризацию. Возможно, что преобладание остатков ненасыщенных кислот в 2-положении большинства природных триглицеридов связано именно с миграцией ацилов (стр. 165), поскольку ненасыщенные 1,3-диглицериды изомеризуются быстрее насыщенных [874].

Еще одним важным фактором этерификации диглицеридов является их жирнокислотный состав. В ряду насыщенных диглицеридов соединения летучих кислот (до m = 10) уступали по <\br> Таблица 32 Распределение радиоактивности 1-моноолеина-(глицерин-1,3-C¹⁴) в ди- и триглицеридах срезов кишечника крысы (в % от общей радиоактивности липидов; содержание 1-моноолеина — 2 мкмоля [874])

• В систему добавили 4 мкмоля олеата.

ацилакцепторной способности высшим диглицеридам, но, начиная с дилаурина, удлинение цепи диглицеридов обычно снова снижало скорость их ацилирования. Как субстрат ДГ-трансацилазы микросом печени и жировой ткани 1,2-дипальмитин более чем в 10 раз уступал диолеину, а замена в нем даже одного остатка пальмитата олеатом в 1 или 2-положении заметно симулировала активность фермента. Однако это правило не соблюдалось в микросомах молочной железы, где дипальмитин по сродству к ДГ-трансацилазе превосходил диолеин. Наконец, при образовании триглицеридов печени крысы (стр. 214) специфичные к 3-положению ацил-КоА-трансферазы не обнаруживали селективности по отношению к sn-1,2-диглицеридам того или иного жирнокислотного состава, поскольку найденные соотношения концентраций отдельных стереоизомеров (sn-SOO/sn-SOI = sn-SIO/sn-SЛЛ = 1,3), отличающихся друг от друга только природой ацилов (О или Л) в 3-положении, равны между собой, отражая соотношение [О]₃/[Л]₃ = 1,5 в сумме триглицеридов [144, 617, 882]. Поэтому не следует считать, что скорость этерификации диглицеридов полностью определяется большей или меньшей скоростью их эмульгирования (стр. 271), хотя этот фактор как in vitro, так и in vivo играет, несомненно, большую роль в биосинтезе жира [299, 804, 982].

Присоединение третьего ацильного остатка к диглицеридам зависит не только от природы акцептора, но и от природы донора ацилов — ацил-КоА-производных жирных кислот. Так, пальмитил-КоА и олеил-КоА, как правило, реагируют с одним и тем же ферментом с неодинаковой скоростью. При этом олеат обнаруживается в 2-положении образовавшихся триглицеридов [299, 301, 804].

Можно видеть, что субстратная специфичность ДГ-трансацилаз различных тканей по отношению к диглицеридам и ацил-КоА- <\br> производным того или иного жирнокислотного состава достаточно широка. Это обеспечивает синтез свойственных данной ткани триглицеридов из насыщенных и ненасыщенных кислот рациона. Почему же отдельные ткани одного и того же животного или аналогичные ткани разных организмов отличаются друг от друга по триглицеридному составу (стр. 11)? Как было показано выше, это явление может вызываться жирнокислотной специфичностью таких ферментов биосинтеза триглицеридов, как ацил-КоА-синтетаза, ГФ-трансацилаза, Ф-фосфатаза, МГ-трансацилаза и ДГ-трансацилаза. В то же время нельзя исключить влияния и других факторов — видовой принадлежности, условий аэрации в реакционной смеси, ацилтрансферазного действия липазы, миграции ацилов и т. д.

Несходство жирнокислотного состава триглицеридов и фосфолипидов, возникающих из диглицеридов в одной и той же ткани, также бывает обусловлено многими факторами [752]. К числу последних относятся природа ткани (стр. 231) и содержащихся в ней жирных кислот, концентрация ионов Са²⁺ (стр. 275) и др. По жирнокислотной и стереоспецифичности ферменты синтеза лецитинов значительно более специализированы, чем ДГ-трансацилаза. Так, D-1,2-дилаурин в микросомной системе печени быстро превращался в триглицериды, но, в отличие от D-1,2-диолеина, совершенно не образовывал лецитины (стр. 225) [301, 449, 982]. Функциональная неоднородность метаболического резервуара диглицеридов была продемонстрирована в опытах со срезами легочной ткани и кишечника: лецитины не отличались от глицеридов по скорости включения меченого глицерина, но превосходили их в несколько раз по скорости влючения ацетата- и пальмитата-С¹⁴ [215, 615]. Наконец, замена ацил-КоА в системе, содержащей С¹⁴-глицерофосфат, кофактором биосинтеза фосфолипидов — цитидиндифосфатхолином — привела к сильному снижению радиоактивности образовавшихся глицеридов, стимулировав одновременно синтез лецитинов [449, 911].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате многолетних исследований достигнуты значительные успехи в изучении механизма образования природных жиров. При исследовании триглицеридов применяли радиоактивные изотопы, модельные аналоги метаболитов, градиентное центрифугирование, энзимологические методы, поверхностно-активные эмульгаторы, спектрофотометрию, хроматографию, селективный гидролиз липазой, электронную микроскопию и т. д. Все эти методы позволили в значительной степени определить состав, структуру и скорость обновления исходных, промежуточных и конечных продуктов обоих главных путей биосинтеза триглицеридов и показать связь этого процесса с общим обменом ве- <\br> ществ в клетке. Одновременно были установлены кофакторы, ингибиторы, кинетика, внутриклеточное распределение, механизм реакций, а также жирнокислотная, позиционная и стереоспецифичность участвующих в биосинтезе ферментов. Ферментативные реакции с участием липаз, трансацилаз, киназ и фосфатаз идут с высокой скоростью, а сами ферменты, за исключением глицерокиназы, являющейся глобулином, представляют собой липопротеины мембран эндоплазматического ретикулума цитоплазмы. Возможно, что строение ферментных белков или же их локализация в многокомпонентном липопротеиновом комплексе ретикулума зависят от растворимости ацилируемых ими производных глицерина, поскольку эмульгаторы типа Твин-20 тормозят образование триглицеридов по глицерофосфатному пути и в то же время стимулируют этерификацию моноглицеридов. И наконец, при изучении всасывания жиров в слизистом эпителии тонкого кишечника отчетливо выявлено соответствие между физиологическими функциями ткани и биохимическими особенностями обмена триглицеридов в ее клетках.

Несмотря на это, при оценке современного состояния исследований в области биосинтеза триглицеридов становится ясно, что многие коренные проблемы этого раздела биохимии липидов еще ждут своего решения. Из приведенных выше работ по биосинтезу видно, что они почти полностью посвящены животным тканям. Микроорганизмы в этом отношении до сих пор не изучены, а глицеридный обмен растений рассматривался лишь в единичных случаях. Неизвестно, например, что побуждает запасающие ткани масличных семян переходить на определенном этапе созревания к интенсивному накоплению жира. Не исследован и механизм действия генетических факторов, обусловливающих качественные и количественные особенности жирнокислотного состава триглицеридов.

Однако даже картина триглицеридного обмена животных организмов таит в себе еще немало «белых пятен». Среди многих нерешенных вопросов здесь можно упомянуть только важнейшие. Прежде всего, каковы взаимоотношения между синтезом жирных кислот и образованием триглицеридов в живой клетке, являются ли свободные кислоты исходными продуктами последнего? На каких именно участках ретикулума происходят синтетические реакции, какова роль рибосом в этом процессе? Если адсорбированные триглицериды действительно сосредоточены на липопротеиновых мембранах, то в чем состоит механизм их снятия с этих мембран и последующего обособления в виде скоплений «свободного жира»? Какова последовательность образования триглицеридов разного жирнокислотного состава? Как достигается позиционно-статистическое распределение жирных кислот, наблюдаемое в большинстве природных триглицеридов, а также замещение среднего положения последних преимущественно ацилами ненасыщенных кислот? Каково участие глицерокиназного и гликоли- <\br> тического путей в синтезе глицерофосфата in vivo? В какой последовательности происходит его ацилирование при биосинтезе фосфатидных кислот, какова жирнокислотная и позиционная специфичность этой реакции? Почему возникающие при этерификации разнокислотных 1,2-диглицеридов несимметричные триглицериды лишены оптической активности? Ацилируются ли 1,3-диглицериды непосредственно, или же они должны сначала превратиться в 1,2-диглицериды?

Приведенный перечень очередных задач в изучении биосинтеза триглицеридов (конечно, далеко не полный) показывает, что дальнейшее развитие этой проблемы не должно ограничиться накоплением одних только биохимических данных. Лишь сочетание структурных, биохимических, цитологических и генетических исследований может обеспечить успех работы.