Helianthus Annuus (Липазный гидролиз $TAG$)

Приготовление $суспензии$ Joshida (2010)

Note

1 $mg$ ТАГ - 535 ${\mu}L$ $суспензии$.

Note

Взвесить в крышечке, затем закрутить и перевернуть.

Пропорции на 10 $mg$ ТАГ:

Насыпать $липаза$: 15 $mg$.
Внести $Tris-buffer$ ($pH$ 7.5): 2.5 $mL$
Внести $CaCl_2$ (0.01 $M$): 100 ${\mu}L$
Внести: $Деоксихолат$ (0.1%, 1 $mg/mL$): ~ 250 ${\mu}L$
Внести $Tris-buffer$ ($pH$ 7.5): ~ 2.5 $mL$ (довести до 5 $mL$)

Пропорции на 20 $mg$ ТАГ:

Насыпать $липаза$: 30 $mg$.
Внести $Tris-buffer$ ($pH$ 7.5): 5 $mL$
Внести $CaCl_2$ (0.01 $M$): 200 ${\mu}L$
Внести: $Деоксихолат$ (0.1%, 1 $mg/mL$): ~ 500 ${\mu}L$
Внести $Tris-buffer$ ($pH$ 7.5): ~ 5 $mL$ (довести до 10 $mL$)

Note

Каждый раз при наборе $суспензии$ баламутить дозатором осадок.

Note

Использовать 2 $mL$ пластиковые пробирки с круглым дном.

Внести пробу: 20 ${\mu}L$ (2 $mg$)
- Упарить досуха в токе $N_2$, 35 $^\circ C$
Внести $суспензию$: 1070 ${\mu}L$
- Греть 35 $min$, 37 $^\circ C$
Внести $Hexane$/$Et_2O$ (1/1, $v/v$): 600 ${\mu}L$ (до верха пробирки)
Отобрать верхнюю фазу в пробы [2.1, 2.2, 2.3, 3.1, 3.2, 3.3] (продукты гидролиза)
- Упарить досуха в токе $N_2$, 50 $^\circ C$
Внести $Hexane$/$Et_2O$ (1/1, $v/v$): 50 ${\mu}L$

Нанести пробу: 50 ${\mu}L$ (всю).
- Неподвижная фаза: $Silica\ gel\ 60$.
- Подвижная фаза: $CHCl_3$/$Acetone$ (96/4 (24/1), $v/v$): 20 $mL$.
Опрыскать $Dichlorofluorescein$.
Соскаблить $MAG-2$.

Note

$H_2O$ половина от $H_2SO_4/MeOH$!

Note

Важно вносить $H_2O$ до $Heptane$!